Малова елена Сергеевна
| Вид материала | Автореферат |
- Мама, мама, тебя не слышно! Елена Сергеевна, скорчившись на диване, кричала в трубку, 40.18kb.
- Зуева Елена Сергеевна Учебных часов: лекций 6 семинар, 278.17kb.
- Россия, ты у нас одна, 87.44kb.
- А. М. Горького Программы повышения квалификации и профессиональной переподготовки Экономика, 402.4kb.
- «Лизинговая компания уралсиб», 169.91kb.
- Кузнецова Елена Сергеевна г. Сергиев Посад 2009 г. Содержание Введение глава I. Теоретическое, 602.57kb.
- Заварина Елена Сергеевна Статистика Труда лекции, 659.42kb.
- Жвакина Елена Сергеевна мау дод «дши им. Алябьева» г. Тобольска Тема доклад, 65.21kb.
- Крюкова Елена Сергеевна старший преподаватель гражданского и предпринимательского права, 21.9kb.
- Г. К. Борескова со ран, конференц-зал 12 апреля, начало 30. Регламент, 189.27kb.
Новый методический подход к разработке способа неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени у больных ХГС. На данном этапе наших исследований апробация нового методического подхода к разработке Иммунотестов для неинвазивного определения стадий фиброза печени была произведена на основе оценки патогенетического значения CD56+ лимфоцитов у больных хроническим гепатитом С (ХГС). Под нашим наблюдением находилось 127 больных ХГС в возрасте от 18 до 65 лет с различной выраженностью фиброзных изменений печени, подтвержденной гистологическим исследованием ткани органа. В соответствии с результатами пункционной биопсии печени и последующей полуколичественной оценкой индекса фиброза по системе METAVIR больные ХГС были распределены на следующие группы: (1) 14 больных (11,0%) с отсутствием фиброзных изменений в печени – стадия фиброза F0 по шкале METAVIR; (2) 56 больных (44,1%) со стадией фиброза F1; (3) 12 (9,4%) больных – F2; (4) 9 больных (7,1%) – F3; (5) 36 больных ХГС с исходом в цирроз печени (28,4%) – стадия фиброзных изменений F4. Контрольную группу составили 32 здоровых донора.
Первичный анализ динамики типовых иммунологических показателей выявил связь СD56+ клеток (ЕКТ и естественных киллеров – CD3+/CD56+ и CD16+/CD56+) с наличием фиброзных изменений в органе-мишени у больных ХГС, что диктовало необходимость более углубленного исследования участия популяции этих клеток в фиброгенезе печени при данной патологии. Уровни данного исследования CD56+ лимфоцитов при ХГС соответствовали таковым при ХГВ.
Посредством углубленного исследования состояния популяции CD56+ клеток на разных стадиях фиброза печени при ХГС были выявлены наиболее значимые сдвиги в их составе. На данном этапе работы нами были установлены достоверные различия между стадиями фиброзных изменений в печени по ряду тестированных параметров. Наибольшие отклонения касались роста доли субпопуляции CD3+/CD56+/CD4+ ЕКТ, снижения экспрессии CD94+ рецептора на поверхности ЕК клеток и маркера цитотоксических гранул CD107а, падения уровня ТФРβ в крови больных на 3-й стадии фиброза в сравнении с предыдущей стадией, и снижения продукции ИЛ-10 на протяжении стадий F1 – F3. Значимые изменения субпопуляций ЕКТ (CD3+/CD56+/CD4+ и CD3+/CD56+/CD8+) и показателей функциональной активности CD56+ клеток (экспрессии NKG2D и CD107а) проявлялись также на стадии развития цирроза печени в сравнении с 3-й стадией фиброза печени (рисунок 3). Эти данные вызывали особый интерес с позиций декларируемого нами подхода к разработке Иммунотестов, а наибольшего внимания с этих позиций заслуживала стадия фиброза F3, иммунологические сдвиги при которой требовали дальнейшего изучения роли CD56+ клеток в прогрессировании фиброза на этапах F2→F3 и F3→F4.
Рис. 3. Астрограмма соответствия иммунологических данных стадиям
фиброза печени у больных хроническим гепатитом В
Далее нами устанавливалось диагностическое значение возможных дополнительных критериальных параметров из состава гемограмм и биохимических тестов. Комплексное исследование гематологических и биохимических изменений при ХГС в зависимости от стадии фиброза печени выявило значимое число достоверных различий между группами обследованных больных, однако попытка установить информативность этих отклонений для дифференциации отдельных стадий фиброза печени с помощью дискриминантного анализа, показала довольно низкие (<0,3) значения СККДФ, что позволяет считать использованные в исследовании гематологические и биохимические параметры непригодными на роль критериальных признаков отдельных стадий фиброза печени у больных ХГС.
На следующем этапе работы посредством дискриминантного статистического анализа были выявлены иммунологические параметры, претендовавшие на статус информативных критериев фиброгенеза. Наибольшую значимость имели такие параметры как доля CD56+ клеток, экспрессирующих NKp46 рецептор, относительное содержание В-лимфоцитов (CD45+/CD19+) и ЕКТ (CD3+/CD56+) в крови, число ЕК, лишенных способности к АТЗЦТ (CD16-) и экспрессирующих маркер цитотоксических гранул (CD107а), то есть преимущественно показатели функциональной активности CD56+ клеток крови.
Для выявления конкретного диагностического и прогностического значения отмеченных информативных параметров анализировалась частота встречаемости диапазонов значений каждого из них на разных стадиях фиброза печени у больных ХГС. Стадия фиброза 0 была принята нами за исходную сравнительную позицию условного мониторинга больного, а принципом отбора того или иного признака в качестве диагностического критерия служила, как и в случае ХГВ, принятая нами относительно высокая (не менее 70%) частота регистрации критериальных значений показателя в исследуемой группе. В ходе анализа сопоставлялись диапазоны значений (минимум-максимум) показателей каждой последующей стадии по отношению к предыдущей, что позволило выделить такие критериальные значения параметра, которые не были зафиксированы на предыдущей стадии, а также установить частоту их встречаемости в каждой группе.
В итоге в качестве информативных показателей крови больных ХГС были отобраны девять признаков: (1) абсолютное и (2) относительное число ЕКТ (CD3+/ CD56+); содержание (3) CD4+ и (4) CD8+ субпопуляций ЕКТ; количество CD56+ клеток, экспрессирующих (5) CD94, (6) NKG2D, и (7) NKp46 рецепторы, а также (8) CD107а – маркер цитолитических гранул, (9) уровень ТФРβ в крови. При дальнейшем исследовании наиболее значимые сдвиги тестированных параметров были выявлены на 3-й стадии фиброзных изменений в печени (F3), что позволило перевести их в разряд критериальных, отличающих данную стадию фиброза печени при ХГС, и объединить в шкалу для иммунодиагностики данной стадии фиброза печени у больных ХГС (таблица 2).
Таблица 2. Шкала критериев иммунодиагностики стадии 3 фиброза
печени у больных хроническим гепатитом С (Иммунотест ХГС/F3)
| Критериальные параметры | Диапазон критериальных значений | Частота регистрации | |
| ниже: | выше: | ||
| CD3+/ CD56+, % | - | 3,7% | 100% |
| CD3+/ CD56+, абс. | - | 0,08*109/л | 88,9% |
| CD3+/CD56+/CD4+, % | - | 23,8% | 100% |
| CD3+/CD56+/CD8+, % | 47,6% | 66,7% | 100% |
| CD56+/ CD94+, % | 46,7% | 62% | 100% |
| CD56+/ NKG2D+, % | 95,9% | 98,4% | 100% |
| CD56+/ NKp46+, % | 28,9% | 40,5% | 100% |
| CD56+/ CD107a+, % | 98,2% | - | 100% |
| ТФРβ, пг/л | 11,0пг/л | - | 100% |
Таким образом, в процессе анализа удалось отобрать критериальные признаки 3-й стадии фиброзных изменений в печени при ХГС, что позволило с большой долей вероятности прогнозировать риск развития цирроза печени и, в ряде случаев, зафиксировать наступление цирротических сдвигов еще до появления клинических признаков этого состояния. Все отобранные критерии выявлялись при углубленном иммунологическом тестировании крови и имели четкие диапазоны значений, позволявшие проводить их диагностическую оценку.
Влияние эпигенетических факторов на результаты Иммунотестов для неинвазивной диагностики стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С. Апробированный на предыдущих этапах исследования новый методический подход не только позволил разработать критерии иммунологической диагностики фиброза и прогноза цирроза печени у больных хроническими гепатитами В и С, но и создал предпосылки для получения на основе этих критериев оригинальных неинвазивных способов определения некоторых стадий фиброзных изменений в печени при названных заболеваниях – Иммунотестов, а также сопоставить эти способы с другими схожими по целям диагностическими приемами с использованием мета-анализа. Для осуществления последнего потребовалось уточнить способ оценки результатов иммунодиагностики по отобранным критериям в соответствии с исследованиями других авторов, а также охарактеризовать гетерогенность полученных данных путем выявления их зависимости от отдельных эпигенетических факторов, входящих в индивидуальную характеристику каждого пациента и способных повлиять на особенности течения у него фиброзного процесса при хронических гепатитах В и С. Оценивалось влияние таких эпигенетических факторов как пол, возраст пациента, уровень вирусной нагрузки и генотипический вариант ВГС на диагностическое значение Иммунотестов при хронических гепатитах В и С.
Изучение влияния эпигенетических факторов пациентов на гетерогенность полученных критериев отдельных стадий фиброза печени при хронических гепатитах В и С проводилось методом дисперсионного анализа (F-тест) с определением критерия Фишера и соответствующего ему р неоднородности: при р неоднородности <0,05 группа больных с наличием того или иного признака считалась гетерогенной. Помимо этого, была проанализирована частота встречаемости каждого диагностически значимого критериального признака для стадий фиброза печени F1 при ХГВ и F3 при ХГС, поскольку была доказана возможность их иммунологической индикации.
Предварительно разрабатывался способ оценки результатов определения критериально значимых признаков для стадии фиброза печени 1 у больных ХГВ и стадии фиброза 3 у больных ХГС. С этой целью была предпринята попытка оценивать тест по иммунологическому определению отдельных стадий по шкале баллов. Определение весового коэффициента для каждого показателя с помощью регрессионного анализа успеха не принесло, в то время как соответствие каждого индивидуального показателя иммунограммы у больного диапазону значений одного из критериальных признаков, оцененная в 1 балл, оказалась высоко эффективной.
В результате такого подхода была зарегистрирована гетерогенность по половому признаку у больных ХГВ для критериев стадии фиброза печени 1, прежде всего, на уровне содержания моноцитов в крови. При хроническом гепатите С половые различия не влияли ни на один из критериев индикации стадии фиброза F3, а относительный риск (ОР) несоответствия критериев неинвазивной и инвазивной диагностики, определенный по шкале оценки теста в целом в баллах, был примерно одинаков у мужчин и у женщин.
Дисперсионный анализ влияния других факторов на оценку тестов в баллах ни в одной группе больных хроническими вирусными гепатитами не выявил гетерогенности тестируемых критериальных показателей по возрастному признаку, уровню вирусной нагрузки и генотипу ВГС. Что касается деталей определения влияния уровня вирусной нагрузки, то по нашим наблюдениям у больных ХГВ регистрировалась низкая вирусная нагрузка (<10000 копий/мл), за исключением 1 случая умеренной нагрузки (в интервале от 10000 до 100000 копий/мл) на стадии цирроза печени (F4), которая не влияла на достоверность различий показателей. Что касается хронического гепатита С, то низкая вирусная нагрузка (менее 2000000 копий/мл) преобладала на всех рассматриваемых в данном разделе стадиях, а «не 1b» генотип выявлен только у 3-х из 36 пациентов на стадии F4, что также не сопровождалось влиянием на достоверность наблюдаемых различий.
Таким образом, оценка критериальных признаков в баллах оказалась наиболее рациональным способом определения отдельных стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С и единственным критерием, который позволил рассчитать относительные риски (ОР) несоответствия полученных данных целям исследования. В целом, ОР без учета пола колебались от 0,93 до 1,05 для F1 стадии ХГВ и от 0,89 до 1,33 для F3 стадии ХГС, что позволяет предполагать значение общей оценки разработанных тестов в баллах (Иммунотестов ХГВ/F1 и ХГС/F3) как достоверных способов неинвазивной иммунодиагностики названных стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С. Что касается влияния пола на Иммунотест ХГВ/F1, то его способность снизить оценку данного теста на 1 балл была учтена нами в процессе дальнейшего анализа диагностической точности способа.
Иммунотест ХГВ/F1 как неинвазивный способ иммунодиагностики начала фиброзных изменений в печени у больных хроническим гепатитом В. На данном этапе исследований был проведен расширенный многокомпонентный статистический анализ соответствия значений Иммунотеста ХГВ/F1 различным стадиям фиброза печени как у больных ХГВ, так и у пациентов групп сопоставления. Последние были представлены больными ХГС (127 человек), алкогольным циррозом печени (10 человек), первичным билиарным циррозом печени (6 человек), контрольной группой клинически здоровых лиц (32 человека), что позволило оценить диагностическую точность, чувствительность и специфичность предлагаемого способа неинвазивной диагностики начала фиброзных изменений в печени у больных ХГВ. Проведенный анализ показал, что по максимальному количеству баллов (6) критериям Иммунотеста ХГВ/F1 удовлетворяли 75% больных ХГВ на данной стадии заболевания, причем данную группу пациентов почти целиком составляли мужчины.
Дальнейший статистический анализ по оценке диагностической точности метода неинвазивной иммунодиагностики фиброза печени у больных ХГВ (Иммунотеста ХГВ/F1) предполагал расчет 95% доверительного интервала (95%ДИ) для параметров использованного теста. Сравнительный анализ Иммунотеста ХГВ/F1 по 95%ДИ (рисунок 4) подтвердил его достоверное отличие (в сторону повышения) от аналогичных интервалов во всех других группах сопоставления при использовании непараметрического критерия Колмогорова-Смирнова, при этом ни в одной другой группе сопоставления показатель 95% ДИ не достигал нижней границы такового на стадии F1 у больных ХГВ. Благодаря этому, Иммунотест ХГВ/F1 характеризовался довольно высокой чувствительностью и специфичностью.
Стадии F0 F1 F2/3 F4 F0 F1 F2 F3 F4 Цирроз
алко- первичн.
ХГВ ХГС голь- били-
ный арный
Баллы
Рис. 4. 95% доверительные интервалы оценки в баллах разных стадий
фиброза печени при различных заболеваниях с помощью критериев
для F1 у больных хроническим гепатитом В
За чувствительность способа принималась доля его ложнопозитивных результатов среди всех больных групп сопоставления, за специфичность способа – доля его ложнонегативных результатов при сравнении с группой здоровых людей [Altman D.G., Bland J.M., 1994]. В основной группе больных ХГВ на стадии F1 у 75% обследованных регистрировалась величина Иммунотеста ХГВ/F1 в 6 баллов, которая ни разу не была отмечена в группах сопоставления, то есть чувствительность способа в этом случае составляла 100%. У 25% больных основной группы, у которых сказывалось, в первую очередь, влияние пола (женщины) на число моноцитов, величина Иммунотеста ХГВ/F1 составляла 5 баллов. Такой же результат был отмечен у 19 из 142 больных (14%) групп сопоставления, в связи с этим чувствительность метода при 5 баллах снижалась до 86%. Что касается специфичности способа, то в основной группе при 5-6 балльной оценке ни разу не было отмечено ложнонегативного результата, предполагаемого у здоровых людей, то есть специфичность также была на уровне 100%.
При проведении мета-анализа соотношение чувствительности/ специфичности способа и, соответственно, его диагностическую и прогностическую значимость принято характеризовать путем построения ROC-кривой и выражать в величинах AUROC. При таком статистическом подходе, чем выше уровень величин и соответствия чувствительности и специфичности способа, тем больше площадь пространства под ROC-кривой – AUROC, а способ, у которого AUROC <0,5, не должен рассматриваться в качестве диагностически значимого [Long E.R., De Long D.M., Clarke-Pearson D.L.б 1988; Poynard T., Morra R., Halfon P. et al., 2007; Zhou X., Obuchowski N., McClish D, 2002]. На рисунке 5 представлена ROC-кривая и значения AUROC при использовании Иммунотеста ХГВ/F1 у больных ХГВ на диагностируемой стадии фиброза печени. AUROC, равный 0,978, подтверждает высокий уровень соответствия чувствительности и специфичности, а также диагностическую точность Иммунотеста ХГВ/F1 на начальной стадии фиброзных изменений в печени. В то же время на остальных стадиях диагностическая точность Иммунотеста ХГВ/F1 находилась за пределами положительной оценки. Прогностическая ценность предложенного теста позволила отнести его качество по величине AUROC (>0,90) в разряд«отличных» неинвазивных методов иммунодиагностики стадии фиброза F1 при ХГВ [Павлов Ч.С. и др., 2007].
Рис. 5. ROC-кривая оценки в баллах Иммунотеста ХГВ/F1
на 1-й стадии фиброза печени у больных ХГВ
Кроме того, проведенный статистический анализ предлагаемого способа иммунодиагностики позволил уточнить алгоритм определения начальной стадии фиброза печени (F1) у больных ХГВ, который складывался из нескольких этапов: (1) верификация диагноза «хронический гепатит В»; (2) определение в крови больного 6 иммунологических критериев, включающих относительное содержание моноцитов, цитотоксических CD3+/CD8+ лимфоцитов, CD4+ и CD8+ субпопуляций ЕКТ, количество CD56+ клеток, экспрессирующих NKp46 рецептор, и уровень ТФРβ; (3) определение соответствие каждого из 6 показателей у данного больного диапазону их критериальных значений; (4) оценка иммунодиагностического теста в баллах; (5) определение соответствия оценки в баллах доверительному интервалу иммунодиагностического теста (5,46 – 6,04); (6) вывод о соответствии или несоответствии иммунодиагностического теста 1-й стадии фиброза печени у больного хроническим гепатитом В.
Иммунотест ХГС/F3 как неинвазивный способ иммунодиагностики начала фиброзных изменений в печени у больных хроническим гепатитом С. В данном разделе исследований проверялась гипотеза о том, что определение критериальных признаков стадии F3 у больных ХГС можно представить в виде Иммунотеста – оценки теста в баллах, где соответствие каждого индивидуального показателя иммунограммы у больного диапазону значений одного из критериальных признаков оценивается в 1 балл. В этом случае на стадии F3 максимальная суммарная оценка критериального теста в баллах была равна девяти. Для подтверждения эффективности разработанного способа иммунодиагностики ХГС/F3 группами сопоставления в данном фрагменте исследования служили больные с другими стадиями фиброза печени при ХГС, с различными стадиями фиброза печени при ХГВ, с циррозами печени невирусной этиологии (алкогольный, первичный биллиарный), контрольная группа здоровых доноров.
Статистическая обработка результатов соответствия балльной иммунологической оценки стадии фиброза у больных хроническими заболеваниями печени критериям ХГС/F3 проводилась в четырех основных направлениях: (1) подсчет количества удовлетворяющих критериям баллов для каждой группы пациентов (из расчета один признак равен одному баллу); (2) вычисление в каждой группе обследования 95% доверительного интервала (ДИ) оценки в баллах с помощью указанных критериев ХГС/F3; (3) оценка достоверности различий доверительных интервалов в разных группах по сравнению со стадией ХГС/F3 с использованием критерия Колмогорова-Смирнова; (4) определение чувствительности и специфичности метода по доле ложнопозитивных тестов в группах сопоставления и ложнегативных тестов при сравнении с контрольной группой.
Проведенный анализ показал, что по 8-9 баллам критериям Иммунотеста ХГС/F3 удовлетворяли 100% больных одноименной группы, а также 18,8% контингента из группы больных ХГВ с начальной стадией фиброзных изменений в печени (F1), то есть 3% по отношению к 142 больным, вошедшим в группы сопоставления (ложнопозитивный результат). В связи с этим при оценке Иммунотеста ХГС/F3 в 9 баллов чувствительность метода составляла 100%, а в 8 баллов – 97%, то есть была очень высокой. Это же касалось и специфичности метода, оцениваемой в 100%.
Диагностическая точность Иммунотеста ХГС/F3 подтвердилась и при анализе 95% доверительного интервала для основной группы больных, поскольку балльная оценка на 3-й стадии фиброза при ХГС по 95%ДИ достоверно превышала таковую во всех других группах сопоставления (рисунок 6). Отмечено было также выраженное расхождения критериальных признаков у больных ХГС на стадии фиброза F2 с критериями ХГС/F3. На этой стадии Иммунотест ХГС/F3 показывал минимальный интервал, также значительно отличавшийся от такового в группах сопоставления, что создавало в перспективе возможности мониторингового определения прогрессирования фиброза печени на этапе F2→F3. Столь же высокое диагностическое значение приобретало резкое падение 95%ДИ при переходе стадии предцирротических изменений (F3) в цирроз печени (F4).
Стадии F0 F1 F2/3 F4 F0 F1 F2 F3 F4 Цирроз
алко- певичн.
ХГВ ХГС голь- били-
ный арный
Баллы
Рис. 6. 95% доверительные интервалы оценки в баллах разных стадий фиброза при хронических заболеваниях печени с помощью
критериев F3 у больных хроническим гепатитом С
ROC-кривые в случае применения Иммунотеста ХГС/F3 в отношении всех стадий данного заболевания подтвердили наибольшую прогностическую ценность, чувствительность и специфичность (AUROC=0,993) предложенного способа иммунодиагностики для стадии фиброза F3 при ХГС (рисунок 7) и позволили оценить его качество как отличное. На других стадиях фиброзного процесса в печени, взятых в данном случае у больных ХГС для сравнения, указанные критерии не являлись диагностически и прогностически значимыми.
