Учебное пособие. Нижний Новгород: Издательство ннгу им. Н. И. Лобачевского, 2004. 212 с. Isbn 5-85746-804-3
| Вид материала | Учебное пособие |
- Учебное пособие Нижний Новгород 2007 Балонова М. Г. Искусство и его роль в жизни общества:, 627.43kb.
- Учебное пособие Нижний Новгород 2003 удк 69. 003. 121: 519. 6 Ббк 65. 9 (2), 5181.42kb.
- Учебное пособие Нижний Новгород 2010 Печатается по решению редакционно-издательского, 2109.64kb.
- Учебно-методическое пособие для студентов, обучающихся по специальности 030501 Нижний, 1855.66kb.
- Учебное пособие Нижний Новгород 2002 удк ббк к найденко В. В., Губанов Л. Н, Петрова, 1219.74kb.
- Н. И. Лобачевского факультет управления и предпринимательства м. Ю. Малкина история, 1006.22kb.
- Учебное наглядное пособие для студентов экономического факультета Нижний Новгород, 356.34kb.
- Учебно методическое пособие Рекомендовано методической комиссией факультета вычислительной, 269.62kb.
- Николая Васильевича Гоголя преподавателем ннгу, к ф. н. М. С. Воробьёвой книга, 1063.36kb.
- Учебное пособие Издательство фгоу впо вгавт н. Новгород, 2007, 1819.73kb.
Сыворотку крови, содержащую антитела к какому-либо антигену, называют антисывороткой. Антисыворотка, как правило, поликлональна, поскольку содержит антитела, продуцируемые разными клонами плазматических клеток. Антисыворотку обычно получают путем иммунизации организма каким-либо антигеном.
Поликлональная антисыворотка может быть моноспецифической, то есть содержащей антитела к разным эпитопам одного и того же антигена. Например, выпускают поликлональные моноспецифические антисыворотки против тяжелых цепей иммуноглобулинов М, G, А человека. Каждая такая антисыворотка содержит поликлональные антитела, направленные к различным эпитопам какой-либо цепи иммуноглобулинов.
Моноклональные антитела продуцируются одним клоном плазмоцитов. Разработан метод получения больших количеств моноклональных антител с помощью, так называемой гибридомной технологии, являющейся одной из составляющих клеточной инженерии (рис. 7).
Рис. 7. Основные этапы получения моноклональных антител (МКА)
Гибридомы являются бессмертными клеточными клонами, продуцирующими антитела одной специфичности. Гибридомы получают путем слияния нормальных плазматических клеток, продуцирующих антитела, с опухолевыми В-лимфоцитами. Затем гибридомы отбирают в культуральной среде, не способной поддерживать рост родительских клеток. С помощью последовательных разведений и пересевов получают одиночные гибридные клетки и их клоны, способные неограниченно долго размножаться в условиях in vitro и продуцировать антитела. Клеточные линии, полученные из таких клеток, называют гибридомами. Используя различные методы культивирования гибридом, нарабатывают большие количества моноклональных антител.
Моноклональные антитела идентичны по своему строению, то есть относятся к одному и тому же классу, изотипу, аллотипу, имеют одинаковые активные центры, обладают одной и той же специфичностью, взаимодействуют с одним и тем же эпитопом антигена с одинаковой аффинностью.
Моноклональные антитела могут нарабатываться в неограниченных количествах и используются в качестве стандартных реагентов в иммунодиагностике, а также в качестве терапевтических антител. За создание гибридомной технологии Келер и Мильштейн в 1984 году получили Нобелевскую премию.
2.5. Перекрестно-реагирующие антитела
Существует два типа перекрестной реактивности антител.
— Антитела, направленные против какого-либо антигена одного вида животных, могут реагировать с антигенами другого вида. Причиной такой перекрестной реактивности является консервативность гомологичных биологических структур, например, белков, сохраняющих свою аминокислотную последовательность неизменной в процессе эволюции. Так, известен высоко консервативный белок, называемый Thy-1 антигеном и характерный для клеток тимуса позвоночных. Моноклональные антитела, взаимодействующие с Thy-1 антигеном человека, реагируют с Thy-1 антигеном земноводных и пресмыкающихся.
— Антитела, взаимодействующие со стереохимически сходными эпитопами, имеющими разную природу. Так, стрептококки несут антигены, конформационно сходные с антигенами сердечных клапанов. В результате, у лиц, перенесших стрептококковую ангину, может развиться ревматизм сердца вследствие наработки в организме перекрестно реагирующих антител к собственным антигенам. Такие антитела называют также аутоантителами, то есть антителами, направленными против собственных антигенов. В здоровом организме аутоантитела обычно присутствуют в следовых количествах.
Наличие эффекта перекрестного реагирования создает определенные трудности в оценке диагностической специфичности.
2.6. Механизмы образования иммуноглобулинов
Иммуноглобулины отличаются от других белков исключительным полиморфизмом. Полиморфизм проявляется в наличии разных изотопов, аллотипов иммуноглобулинов, а также в разнообразии активных центров антител (идиотипов), определяющих их специфичность по отношению к антигенным детерминантам.
Позвоночные в течение жизни способны создавать огромное количество вариантов антител, направленных против разных антигенов. Потенциальное разнообразие антител характеризуется цифрой, равной примерно 1016. Геном позвоночных состоит из нескольких десятков тысяч генов. Так, в составе генома человека присутствует всего 23,5 тысячи генов. Если исходить из основной догмы молекулярной биологии «один ген — один белок», то этого количества генов совершенно недостаточно для того, чтобы обеспечить синтез колоссального числа различных иммуноглобулинов. Однако природа нашла поразительный выход из положения, использовав прием, который характерен только для лимфоцитов.
Во всех клетках, кроме созревающих В-лимфоцитов, кодирующая легкие и тяжелые цепи ДНК находится в так называемой «зародышевой конфигурации». Такую конфигурацию называют также генами зародышевой линии, или гаметными генами.
Тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов кодируются набором кодирующих нуклеотидных последовательностей, названных генными сегментами и разделенных друг от друга некодирующими участками ДНК. Генные сегменты являются предшественниками функционально активных генов и представляют собой экзоны, перемежающие с интронами. В ходе В-клеточного созревания эти генные сегменты перестраиваются и особым образом соединяются вместе, давая функционально активные гены цепей иммуноглобулинов.
У человека и мыши существует три группы генных сегментов, обеспечивающих синтез всего многообразия тяжелых цепей иммуноглобулинов: V (variable — вариабельный), D (diversity — обеспечивающий разнообразие) и J (joining — соединительный). 14-я хромосома человека содержит 51 VH-сегмент, 27 DH-сегментов и 6 JH-сегментов. Сегменты расположены последовательно группами от 5' к 3' концу. V-сегмент кодирует 95-96 аминокислотных остатков, D и J сегменты — 12-14 аминокислотных остатков. К 3'-концу примыкает серия C-генных сегментов, кодирующих константные домены (рис. 8).
Аналогичным образом выглядит зародышевая конфигурация ДНК, кодирующей легкие цепи. Так, ДНК, кодирующая каппа-цепи иммуноглобулина человека, состоит из примерно 40 Vκ-сегментов, пяти Jκ сегментов и одного C-генного сегмента. D-сегменты в ДНК, кодирующей легкие цепи, отсутствуют.
Зародышевая конфигурация ДНК обеспечивает колоссальное разнообразие активных центров иммуноглобулинов благодаря тому, что в созревающих В-лимфоцитах генные сегменты подвергаются перестройке. В ходе такой перестройки случайным образом объединяется по одному V, D и J сегменту (V и J сегменты для легких цепей). Каждый В-лимфоцит получает собственный набор объединенных сегментов. Природа в данном случае играет в биологический конструктор, добиваясь поразительных результатов.
Весь путь созревания В-лимфоцита от незрелой клетки-предшественницы до антителосекретирующей плазматической клетки можно разделить на несколько этапов.
1. Соматическая рекомбинация — перестройка (реаранжировка) генных сегментов, кодирующих вариабельные домены цепей иммуноглобулинов. Это первый этап на пути к синтезу антител и ключевой момент формирования функциональных вариабельных областей легких и тяжелых цепей. Соматическая рекомбинация идет на ранних этапах созревания В-лимфоцитов в костном мозге с участием специализированных ферментов. В результате соматической рекомбинации объединяются генные сегменты, кодирующие вариабельные домены цепей иммуноглобулинов. Объединенные экзоны, кодирующие V-домен, остаются при этом разделены интроном с генными сегментами, кодирующими константные домены. Соматической рекомбинации в ходе созревания В-лимфоцитов сначала подвергаются генные сегменты тяжелой цепи, затем - генные сегменты легких цепей.
Наличие множества генных сегментов, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулинов, и их реаранжировка являются основной причиной полиморфизма активных центров антител. Дополнительным источником разнообразия формирующихся активных центров являются включение вставок между сегментами (так называемые P и N-вставки), вариации в соединении сегментов, приводящие к потере или появлению новых нуклеотидов и, соответственно, к сдвигу рамки считывания, комбинации V-доменов легких и тяжелых цепей при сборке полной молекулы иммуноглобулина и, наконец, соматические гипермутации, происходящие позднее в более зрелых В-клетках.
В перестроенных генах гипервариабельные участки V-доменов иммуноглобулинов кодируются последовательностями, находящимися на границе между сегментами. Гипервариабельность этих участков связана с тем, что дополнительные механизмы формирования разнообразия затрагивают именно эти районы нуклеотидной последовательности.
Перестройка генов легких и тяжелых цепей происходит только в одной из двух гомологичных хромосом. Это обеспечивает аллельное исключение в отношении продуцируемых клеткой антител. В итоге одна В-клетка и ее потомство способны продуцировать только иммуноглобулины, имеющие идентичные активные центры.
Не каждая рекомбинация является продуктивной. Подсчитано, что в результате только одной из трех рекомбинаций формируется функционально активный ген. Если перестройка сегментов ДНК одной хромосомы является непродуктивной, то возможность перестроить генные сегменты получает вторая хромосома. Неудачные попытки перестройки генов приводят к смерти в костном мозге 90% созревающих клеток. Смерть происходит путем апоптоза.
Существование отдельных генных сегментов, кодирующих V и С регионы иммуноглобулинов, и реаранжировку генов в процессе созревания В-клеток обнаружили в 1976 году Тонегава и Хозуми. За открытие механизмов формирования разнообразия антител Тонегава в 1987 году получил Нобелевскую премию.
2. Синтез цепей иммуноглобулинов. Перестроенный ген тяжелой цепи в созревающем В-лимфоците (про-B клетка) содержит объединенные V, D, J сегменты, соединенные на 3'-конце с генными сегментами, кодирующими константные домены иммуноглобулинов разных изотипов. Последовательность расположения таких сегментов от 3' к 5' концу ДНК выглядит следующим образом: μ, δ, γ1-4, ε, α. Самым близким набором генных сегментов являются сегменты, кодирующие константные домены мю-цепи.
Первичный транскрипт РНК содержит нуклеотидные последовательности, включающие некодирующие интроны и генные сегменты, кодирующие домены иммуноглобулинов. Первичный транскрипт процессируется с удалением всех участков нуклеотидной последовательности кроме тех, которые кодируют вариабельный и константные домены мю-цепи.
Образовавшаяся матричная РНК транспортируется из ядра в цитоплазму, где происходит синтез мю-цепей на полирибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулюма. Мю-цепи после синтеза заякореваются на мембране эндоплазматического ретикулюма и объединяются с суррогатным полипептидом, заменяющим им легкую цепь. Затем происходит перестройка гена легкой цепи. На этой стадии В-лимфоцит представляет собой пре-B клетку.
Как тяжелые, так и легкие цепи подвергаются гликозилированию сначала в цистернах эндоплазматического ретикулюма, а затем в аппарате Гольджи, где одновременно происходит сортировка белков и перенос через систему везикул на поверхностную мембрану.
Синтез легкой цепи приводит к появлению на мембране лимфоцита полноценного мембранного IgM и к переходу В-лимфоцита в стадию незрелой B-клетки.
Созревание в зрелую наивную B-клетку сопровождается одновременным появлением на клетке мембранного IgM и IgD. Они имеют один и тот же активный центр, но разные константные домены, образующиеся за счет альтернативного сплайсинга матричной РНК. Обе формы мембранного иммуноглобулина входят в состав В-клеточных рецепторов. В-лимфоцит, экспрессирующий (несущий на мембране) B-клеточный рецептор, выходит из костного мозга и приобретает способность активироваться при встрече с антигеном, взаимодействующим с активным центром иммуноглобулина.
3. Дополнительные модификации. Зрелые наивные В-клетки мигрируют в лимфоузлы и другие лимфоидные органы, где в результате встречи с антигеном происходит их активация. Активация приводит к трем дополнительным событиям, затрагивающим перестроенные гены иммуноглобулинов и характер их экспрессии:
— Переключение изотипа. Путем альтернативного сплайсинга матричной РНК генные сегменты, кодирующие мю-цепи и дельта-цепи, удаляются. На их место перемещаются сегменты, кодирующие константные домены тяжелых цепей других изотипов. В результате взамен иммуноглобулинов классов М и D В-клетки начинают синтезировать иммуноглобулины класса G, А или Е. Такие иммуноглобулины имеют тот же активный центр (вариабельный домен), но принадлежат к другому изотипу. Каждый В-лимфоцит в этом случае синтезирует иммуноглобулины только одного изотипа. Переключение изотипов регулируется цитокинами.
— Образование растворимых иммуноглобулинов (антител). Активация В-лимфоцитов приводит к их превращению в плазматические клетки — конечный этап дифференцировки В-клеток. Плазматические клетки теряют способность продуцировать мембранную форму иммуноглобулинов, но начинают синтез растворимых иммуноглобулинов. На 3'-конце каждой группы генных сегментов, кодирующих константные домены тяжелых цепей разных изотипов, имеются дополнительные кодирующие последовательности, определяющие принадлежность синтезируемого белкового продукта к растворимой или мембранной форме.
Если в результате альтернативного сплайсинга матричной РНК к сегменту, кодирующему последний константный домен, присоединяется дополнительный экзон, определяющий присоединение к С-концу белковой цепи группы гидрофильных аминокислот (S), то образуется растворимый иммуноглобулин. Если в этом участке остается экзон, кодирующий последовательность, состоящую из гидрофобных аминокислот (М), то образуется мембранная форма (рис. 9). Таким образом, антитела можно рассматривать как растворимую форму мембранных иммуноглобулинов.
— Соматические гипермутации. Затрагивают только гипервариабельные участки, кодирующие V-домены. Происходят в зародышевых (терминальных) центрах лимфоузлов, где концентрируются активированные В-клетки. Скорость соматических гипермутаций составляет 10-3 на одну пару нуклеотидов за одно клеточное деление. Нормальная скорость мутаций составляет 10-8-10-9 на пару нуклеотидов за одно клеточное деление. То есть скорость мутаций вариабельных участков в генах легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов на несколько порядков превышает нормальный темп мутаций. Одна мутация возникает в среднем за два клеточных деления. Клетки делятся каждые 6 часов. Механизм соматических гипермутаций остается неизвестным.
Соматические гипермутации лежат в основе феномена аффинного созревания антител. В зародышевых центрах лимфоузлов происходит отбор и размножение В-лимфоцитов, продуцирующих иммуноглобулины с повышенной аффинностью, возникающей вследствие активного мутационного процесса.
3. МЕТОДЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Многие иммунологические методы построены на взаимодействии антиген-антитело. С помощью таких методов можно выявлять как антитела, так и антигены. Определение может быть качественным и количественным. Эта группа методов не требует большого количества материала для анализа (микроанализ). Объем анализируемого материала в наиболее совершенных методах составляет 0,1 мл, а чувствительность достигает десятых долей нанограмма на миллилитр.
3.1. Иммунопреципитация
Метод основан на поливалентности антител. За счет наличия нескольких активных центров в составе иммуноглобулинов они могут взаимодействовать с одинаковыми эпитопами на нескольких антигенах. В результате образуются видимые глазом и выпадающие в осадок агрегаты (преципитат). Если антиген содержит несколько эпитопов, то с ним связывается несколько антител, что увеличивает массу агрегата. Различают иммунопреципитацию в растворе и преципитацию в геле.
Иммунопреципитация в растворе является первым из разработанных методов иммунологического анализа и наименее чувствительным (рис. 10).
Существует количественный вариант иммунопреципитации в растворе, основанный на измерении мутности раствора с помощью нефелометрии.
Иммунопреципитация в геле позволяет определять антитела и антигены с более высокой чувствительностью, которая, однако, недостаточно высока по сравнению с современными методами иммунологического анализа. В качестве геля обычно используют тонкий слой агар-агара или агарозы. Антигены и антитела, нанесенные в лунки на некотором расстоянии друг от друга, диффундируют в толще геля. В месте их встречи образуется видимая глазом полоса (рис. 11).
Таким способом можно определить наличие или отсутствие в пробе антигена или антител. В первом случае в одну из лунок наносят антитела, направленные против искомого антигена. Во вторую — тестируемую пробу. Если образуется полоса преципитата, то в тестируемом образце имеется искомый антиген. При определении антител используют раствор антигена, к которому должны быть направлены искомые антитела. Метод может быть использован для определения веществ, находящихся в концентрации от 10 мкг/мл и выше. Ранее иммунопреципитация широко применялась в лабораторной практике, однако в настоящее время не используется в связи с относительно низкой чувствительностью.
Для методов, основанных на преципитации, важной является соотносительная концентрация взаимодействующих компонентов. Если концентрация одного из компонентов реакции намного превышает концентрацию второго, то преципитат может не выпадать вследствие быстрого истощения одного из компонентов и невозможности образования полноценного преципитата.
Иммунопреципитация в геле может быть полуколичественным и количественным методом. В первом случае используют последовательные разведения тестируемых антител или антигенов. Последнее разведение, в котором антитела или антигены способны давать положительную реакцию, называют титром. При использовании разных иммунологических методов титры могут меняться. Это зависит от чувствительности метода, то есть минимальной концентрации, в которой выявляются тестируемый антиген или антитела.
Существует несколько усовершенствованных модификаций иммунопреципитации в геле:
Радиальная иммунодиффузия. В этом случае подготавливается плоский гель, в котором один из компонентов системы антиген-антитело размещен равномерно по всей толще геля. Второй компонент, тестируемый в системе антиген-антитело, помещают в лунку в центре плоского геля. Последующая диффузия тестируемого компонента приводит к образованию кольца преципитации вокруг центральной лунки. Чем выше концентрация тестируемого компонента, тем больше диаметр образующегося кольца. При использовании соответствующих калибровочных образцов, то есть набора проб с известной концентрацией, может быть проведено количественное определение компонента, наносимого в центральную лунку (рис. 12).
Иммуноэлектрофорез. Метод является качественным. С его помощью можно одновременно в одной пробе определить наличие множества антигенов, выявляемых антителами. Проводят электрофорез тестируемого образца в агарозном геле, затем по сторонам геля параллельно направлению миграции антигенов делают длинные лунки (траншеи), в которые заливают антисыворотку, содержащую антитела к тестируемым антигенам. При наличии в тестируемом образце искомых антигенов образуются дуги преципитации в тех зонах, куда мигрировали при электрофорезе антигены. Этим же методом можно определить наличие антител к конкретному антигену, находящемуся в смеси с другими антигенами (рис. 13).
Агглютинация (от лат. agglutinatio — склеивание). В основе метода лежит формирование видимых невооруженным глазом конгломератов клеток или частиц при образовании между ними молекулярных мостиков. В качестве мостиков могут выступать антитела и антигены. В основе феномена агглютинации лежит поливалентность антител, дающая возможность одному антителу связаться с несколькими клетками или частицами одновременно.
Агглютинация может происходить между бактериальными клетками, между клетками крови, в частности эритроцитами, между латексными частицами. Бактериальные клетки несут поверхностные антигены. При добавлении к бактериальным клеткам антител против таких антигенов будет происходить их агглютинация. Определение групп крови с помощью соответствующих антисывороток также основано на феномене агглютинации. В этом случае образование конгломератов клеток с последующим их осаждением происходит в том случае, когда эритроциты несут на своей поверхности антигены (изоагглютинины), взаимодействующие с добавляемой к ним антисывороткой. При агглютинации эритроцитов метод называют гемагглютинацией (рис. 14).
Эритроциты и соответствующие им по размерам латексные частицы могут быть химически сшиты с каким-либо антигеном или антителом. Добавление к ним второго компонента системы «антиген-антитело» будет приводить к агглютинации, сопровождающейся быстрым выпадением в осадок больших конгломератов клеток. Метод гемагглютинации и латексной агглютинации широко используется для качественного и количественного определения различных антигенов и антител. Разработано множество модификаций метода. Он более чувствителен, чем иммунопреципитация, и позволяет выявлять антигены в концентрации, равной 10-100 нг/мл и выше. Однако в настоящее время разработаны более чувствительные методы, которым отдается предпочтение.
3.2. Методы, основанные на использовании специфической метки
Иммунофлуоресценция. Метод основан на применении в качестве метки флуоресцирующих соединений. Метку химически пришивают к антителу или антигену. Это позволяет регистрировать реакцию антиген-антитело с помощью соответствующих приборов и увеличивает чувствительность анализа. Чаще всего с помощью иммунофлюоресценции определяют антигены на поверхности клеток. С этой целью тестируемые бактериальные или эукариотические клетки обрабатывают антителами, мечеными флуоресцентной меткой, а затем оценивают реакцию с помощью люминесцентного микроскопа (рис. 15).
Иммунофлуоресцентный метод широко используется для