Экспрессия эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в яичнике при синдроме поликистозных яичников / С. Л. Воскресенский, Е. Н. Грудницкая, И. В. Тарасюк, Т. Э. Владимирская // Репродуктивное здоровье в Беларуси. 2010

Вид материала

Документы

Содержание Материалы и методы Expreesion of oestrogen and progesterone receptors in ovary under the polycystic ovary syndrome.

Подобный материал:

• Восстановление фертильности у женщин с ожирением при синдроме поликистозных яичников, 261.85kb.
• Макарищев Алексей Яковлевич клиническое значение сосудистого эндотелиального фактора, 770.69kb.
• Реализация репродуктивной функции при синдроме поликистозных яичников и перитонеальном, 457.62kb.
• Молекулярно-генетические аспекты формирования эндокринно-метаболических нарушений при, 282.99kb.
• Опубликовано в журнале Репродуктивное здоровье в Беларуси 2009. №4 (04). С. 94-105, 259.83kb.
• Тема Лектор, 27.38kb.
• Методы видеолапароскопической хирургии в восстановлении менструальной и репродуктивной, 55.16kb.
• Дифференцированный подход к лечению больных с различными клиническими фенотипами синдрома, 1067.56kb.
• Кафедра акушерства и гинекологии, 373.09kb.
• Хакназарова матлуба Абдумаджидовна репродуктивное здоровье женщин при инфекциях, передающихся, 640.82kb.

1. Экспрессия эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в яичнике при синдроме поликистозных яичников / С.Л. Воскресенский, Е.Н. Грудницкая, И.В. Тарасюк, Т.Э. Владимирская // Репродуктивное здоровье в Беларуси. – 2010. – № 4. – С. 29–38.
   

ЭКСПРЕССИЯ ЭСТРОГЕНОВЫХ И ПРОГЕСТЕРОНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ

В ЯИЧНИКЕ ПРИ СИНДРОМЕ ПОЛИКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ


Воскресенский С. Л.¹ , Грудницкая E.Н.¹, Тарасюк И.В.², Владимирская Т. Э.²

(' Белорусская медицинская академия последипломного образования, кафедра акушерства и гинекологии; ² ЦНИЛ БелМАПО)


АННОТАЦИЯ

Проведено иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к рецепторам эстрадиола и прогестерона в строме яичников и стенках зреющих фолликулов у 15 пациенток с бесплодием, обусловленным синдромом поликистозных яичников и у 6 фертильных женщин.

Установлено, что у фертильных женщин экспрессия рецепторов к эстрадиолу и прогестерону в фолликулах и в строме яичников различная. В клетках фолликула все эстрогеновые и прогестероновые рецепторы были связаны эндогенными гормонами. В клетках стромы часть из них оставалась свободной, то есть потенциально активной.

При СПКЯ нарушалось взаимодействие рецепторов с гормонами. Наиболее значимые изменения в экспрессии рецепторов при СПКЯ в стенках фолликула относились к прогестерону. По отношению к норме реакция с прогестероном инвертировалась, что может быть связано с нарушением диффузии гормона через клеточные мембраны. Также существенно менялся характер взаимодействия рецептор-гормон: преобладающей становилась умеренна или выраженная реакция, против слабой в норме.

Сделан вывод, что характер рецепторного взаимодействия эстрогенов и прогестерона в фолликулах и строме яичников может играть существенную роль как непосредственно в фолликулогенезе, так и бесплодии.


Ключевые слова: синдром поликистозных яичников, рецепторы к эстрадиолу, рецепторы к прогестерону в яичниках, иммуногистохимия.


Наиболее общей причиной бесплодия при синдроме поликистозных яичников является нарушение фолликулогенеза и, в частности, превращение примордиальных фолликулов в доминантные. Этапы их трансформации до образования преантральных (первичных и вторичных) фолликулов считаются гормонально независимыми, а последующие - гормонально зависимыми.

Важным условием ответной реакции зреющего фолликула на гормональную стимуляцию является наличие эстрогеновых, прогестероновых рецепторов и их способность к взаимодействию с гормонами. В отсутствие последних рецепторы неактивны, но после диффузии гормонов через клеточную мембрану, возникает стероидно-рецепторный комплекс. Он активируется и подвергается конформационным изменениям. Конечным результатом взаимодействия рецепторов и гормонов является синтез специфических белков, участвующих в регуляции различных репродуктивных процессов [7, 8, 23, 16].

Наличие рецепторов к эстрадиолу и прогестерону в фолликуле и в строме яичника [2] является важным регулятором формирования доминантного фолликула. В то же время особенности их взаимодействия с гормоном, в том числе и при поликистозе яичников, пока находятся в стадии исследования.

Созревание яйцеклетки является определяющим в процессе репродукции. Поэтому исследование особенностей распределения рецепторов в ткани яичников и непосредственно в стенке фолликулов является важным в раскрытии патогенетических механизмов развития патологии фолликулогенеза при СПКЯ.

Целью данного исследования явилась оценка взаимодействия (экспрессии) рецепторов с эстрадиолом, прогестероном в стенках фолликула и строме яичника у пациенток с нормальной репродуктивной функцией и у больных бесплодием, обусловленным СПКЯ.

Материалы и методы

В исследование включены 15 пациенток с бесплодием, обусловленным синдромом поликистозных яичников, которым после безуспешного консервативного лечения, была произведена клиновидная резекция яичников (основная группа).

Группу контроля составили 6 фертильных женщин, которым была произведена резекция яичников в связи с плановым хирургическим лечением кистом яичников.

Оперативные вмешательства выполнялись в период с 2008 по 2009 гг. в гинекологическом отделении №1 УЗ «Родильный дом Минской области». Все операции были выполнены в I фазу менструального цикла.

Сравнение групп по возрасту, образовательному цензу, семейному положению, времени появления менструаций, по имевшимся генитальным (эрозия шейки матки, миома матки, генитальный эндометриоз, киста яичника, гиперплазии эндометрия) и экстрагенитальным заболеваниям (болезни легочной, эндокринной, сердечно-сосудистой, мочевыводящей систем, заболевания желудчно-кишечного тракта, ожирение), а также перенесенным ранее операциям по поводу генитальной и экстрагенитальной патологии статистически значимых различий не выявило.

В частности, возраст женщин основной группы был 26 (25-30) лет, контрольной - 36 (26-44) лет (р = 0,051). В браке состояло 15 (100%) женщин основной группы и 5 (83%) в группе контроля (р = 0,796). Менархе наступило в возрасте 13 (12-14) лет в основной и 14 (12-14) лет в контрольной (р = 0,533).

Однако в основной группе ни у одной из женщин не было родов, несмотря на то, что все они были замужние. А представительницы контрольной группы ранее имели беременности (от 2 до 4), и в момент обследования воспитывали своих детей (от 1 до 2).

То есть, обследованные группы женщин, являясь однородными по основным клиническим признакам, но отличались между собой по качеству функционирования репродуктивной системы.

Определение экспрессии рецепторов к эстрадиолу и прогестерону осуществлялось иммуногистохимическим методом. Исследование выполнялись на базе ЦНИЛ БелМАПО, в патоморфологической группе.

Гистологический материал фиксировали в формалине и заключали в парафин. Парафиновые блоки нарезали толщиной 3-4 мкм. После депарафинизации и дегидратации полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Для дальнейшего иммуногистохимического исследования отбирались участки яичниковой ткани с фолликулярным аппаратом. Так как при синдроме поликистозных яичников рост фолликулов останавливается на уровне первичных или малых зреющих фолликулов (диаметр 0,5-1,0 см в окружении 8-10 слоев фолликулярного эпителия), то в обеих группах изучению подвергались участки яичниковой ткани, содержащие именно такие фолликулы и подлежащая к ним строма.

Иммуногистохимическая реакция проводилось с использованием моноклональных антител к рецепторам эстрадиола и прогестерона (Anti-Human ER-рецептор, clon 1D5 и Anti-Human PR-рецептор, clon PgK 636 производство Dako Cytomation, Дания). Для того, что бы увидеть произошедшую иммуногистохимическую реакцию под микроскопом использовали систему En Vision: Dako REAL Detection System Peroxidase, хромоген DAB (Dako Cytomation, Дания) [4]. Визуализация клеток, в которых произошла реакция антител с ядерными рецепторами, проводилась с применением светового микроскопа «Leica» (увеличение x 40).

При взаимодействии моноклональных антител с рецепторами эстрадиола или прогестерона возникало окрашивание. Обнаружение окрашенных клеток считали положительным результатом. Он градировался по количеству вступивших в реакцию клеток: от 1 до 10 - слабоположительный, от 11 до 20 - умеренный, а более 20 - выраженный. Результат оценивали в полях зрения, с наибольшим скоплением окрашенных клеток.

Если реакции взаимодействия в препарате не было, то результат считался отрицательным.

Статистическое обеспечение работы выполнено с использованием U-критерия Манна-Уитни (Mann-Whitney), для независимых групп и критерия Уилкоксона (Wilcoxon) для зависимых (ненормальное распределение данных и малочисленность групп). Для сравнения качественных данных применили двухсторонний критерий Фишера (Fisher, two-tailed) [12, 13]. Статистически значимыми различия считались при р<0,05 [3, 9].


Результаты и обсуждение

Согласно полученным данным у фертильных женщин в стенках фолликулов реакции взаимодействия эстрогеновых и прогестероновых рецепторов с моноклональными антителами не было (Таблица). Это означает, что в норме в стенках фолликулов все рецепторы к эстрадиолу и прогестерону занимаются соответствующими гормонами. То есть эстрогенная и прогестероновая насыщенность организма у фертильных женщин была сбалансирована с рецепторной активностью.

В клетках стромы яичников фертильных женщин (контрольная группа) также отмечалась однонаправленная реакция взаимодействия рецепторов как с эстрадиолом, так и прогестероном. Но в отличие от реакции в стенках фолликула (отрицательной во всех наблюдениях), она была положительной, хотя и слабо выраженной. Умеренно и выраженной реакции не было зафиксировано ни в одном случае.

То есть в контрольной группе (фертильные женщины) в стенках фолликулов и в строме яичников эстрадиоловые и прогестероновые рецепторы с моноклональными антителами взаимодействовали одинаково: либо положительно, либо отрицательно. При этом экспрессия рецепторов в строме и в фолликулах была разнонаправленной. В фолликулах все рецепторы как эстрадиолу, так и прогестерону были заняты, а в строме часть рецепторов оставалась свободной (слабоположительная реакция).

У больных СПКЯ в стенках фолликулов экспрессия рецепторов к эстрадиолу была аналогична таковой в контроле, то есть все рецепторы были связаны. Свободных не было. Прогестероновые рецепторы, напротив, преимущественно (93%) были свободные, в противовес контролю, в котором они все (100%) были занятые. При этом у 73% пациенток основной группы, реакция взаимодействия была умеренной и выраженной.

В строме яичников преобладала положительная реакция как для эстрадиола (80%), так и прогестерона (80%), что в целом совпадало с данными по связыванию рецепторов в группе контроля (100%). Однако в отличие от фертильных женщин, у которых выраженность реакции оценивалась как слабая для всех наблюдений (100%), у больных СПКЯ она была слабоположительной лишь у 27%, а у оставшихся 53% женщин - умеренной и выраженной для эстрадиола, а для прогестерона 20% и 60% соответственно.

То есть при СПКЯ в стенках фолликулов реакция взаимодействия рецепторов к эстрадиолу была не нарушена, а к прогестерону - инвертирована по отношению к контролю. В строме яичников реакция рецептор-антитело как к прогестерону, так и эстрадиолу, в целом, была аналогична таковой у фертильных женщин, однако распределение экспрессии было существенно изменено. У больных СПКЯ она была существенно выше, чем у фертильных женщин.

У пациенток с синдромом поликистозных яичников наблюдается нарушение стероидогенеза, проявляющееся в увеличении выработки андрогенов, нарушении продуцируемого соотношения эстрогенов и прогестерона [15, 17, 20].

Гормональные влияния реализуются через рецепторный комплекс, находящийся в гормонально зависимом органе. При этом сами гормоны являются “инициаторами” роста своих же рецепторов. Комплекс гормон-рецептор запускает каскад внутриклеточных процессов, обеспечивающих физиологические ответы, в том числе и стимулирующий сигнал для секреции гонадотропин-рилизинг гормона и ответной секреции фолликулостимулирующего гормона.

Но если гормональная рецепция нарушена, можно ожидать отсутствие соответствующей реакции или ее извращение. Поэтому можно полагать, что и измененная рецепторная активность может быть важным фактором в патологии фолликулогенеза или даже более того быть существенным этиологическим фактором, вызывающим по механизму обратной связи нарушение интенсивности и качества гормональной регуляции репродуктивного процесса.


Таблица. Экспрессия рецепторов к эстрадиолу в стенке фолликула и ткани яичника при синдроме поликистозных яичников и у фертильных женщин

Экспрессия рецепторов	Основная группа, n=15, %	Контрольная группа, n=6, %	p	Основная группа, n=15, %	Контрольная группа, n=6, %	p
Стенка фолликула		эстрадиол			прогестерон
отрицательная	10021	10040	>0,05	76,8	10040	<0,05
положительная	021	040	>0,05	936,8	040	<0,05
слабая	-	-		2010,6	-
умеренная	-	-		138,9	-
выраженная	-	-		6013	-
р< 0,05
Строма яичника		эстрадиол			прогестерон
отрицательная	2010,6	040	>0,05	2010,6	040	>0,05
положительная	8010,6	10040	>0,05	8010,6	10040	>0,05
слабая	2711,8	10040		2711,8	10040
умеренная	2010,6	040		2010,6	0 40
выраженная	3312,5	040		3312,5	0 40
р< 0,05

Наши исследования выявили два интересных, с точки зрения физиологии репродуктивного процесса, факта. Первый связан с различиями экспрессии в строме и в фолликулах не только при патологии, но и в норме, а второй - с дифференцированными нарушением экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов при СПКЯ.

Как весь яичник, так и его составные элементы: строма и фолликул, находятся в едином гормональном “поле”, целостного организма. Тем не менее, согласно полученным результатам рецепторы стромы яичника и фолликулов, то есть включения стромы, имеют особенности по связыванию со специфическими для них гормонами.

С позиций морфологии и функционального назначения - это разные образования. Но рецепторы к эстрадиолу и прогестерону, находящиеся в них одинаковы. Так же одинаков гормональный состав крови, омывающей эти структуры.

Возможное объяснение этому парадоксу может быть связано с различиями в интенсивности биохимических процессов в сформированном образовании - яичнике и вновь образующемся - созревающем фолликуле.

Строма яичника - это морфологическая структура, которая существует, пока живет организм. Все происходящие в ней биохимические процессы носят “плановый” характер. Это относится и к естественной замене рецепторов. А для предотвращения срывов в гормональной регуляции вследствие дефицита рецепторов, то есть обеспечения бесперебойной работы органа при любых обстоятельствах, синтезируется их некоторый избыток. Следствием этого является слабоположительная реакция на эстрадиол и прогестерон в строме яичника у фертильных женщин.

В отличие от стромы в фолликулах биохимические процессы носят взрывной характер вследствие ограничения по времени существования I фазы менструального цикла, когда функционирует фолликул. Вновь образующиеся рецепторы тут же занимаются гормонами, чтобы обеспечить, в том числе, и возникновение новых рецепторов. Вероятно, существует даже определенный дефицит рецепторов, поскольку вся систем работает “с колес”. То есть интенсивность биохимических процессов в созревающем фолликуле, с одной стороны, приводит к тому, что свободных рецепторов там не остается, а с другой является гарантом нормального репродуктивного цикла. Отсюда и возникают различия в рецепторной активности фолликулов и стромы у фертильных женщин, которая и была выявлена в ходе проведенных исследований.

При СПКЯ взаимодействие рецепторов с эстрадиолом и прогестероном существенно отличались от таковых в контроле, однако, не по всем исследованным позициям. В частности, в стенках фолликулов экспрессия рецепторов к эстрадиолу в норме и при патологии была одинаковой (отрицательной).

В отношении прогестерона рецепция в стенках фолликула была противоположной таковой у фертильных женщин. Если у первых все рецепторы к прогестерону, также как и к эстрадиолу были заняты, то при патологии значительная часть рецепторов оказывалась свободной. То есть, имел место явный преизбыток рецепторов по отношению к прогестерону, вступившему в реакцию взаимодействия. Поскольку гормоны попадают в клетку путем проникновения через клеточные мембраны путем диффузии, то можно предположить, что при СПКЯ нарушается проницаемость мембран для некоторых биохимических соединений, в частности, прогестерона. При этом проницаемость для эстрадиола сохраняется.

При СПКЯ в строме яичников существенно нарушается экспрессия к эстрогенам и прогестерону. Если у фертильных женщин преобладала слабоположительная реакция, то при СПКЯ на первое место вышла умеренная и выраженная экспрессия.

Таким образом, можно полагать, что отмеченные нарушения в образовании комплексов гормон-рецептор в клетках фолликула и строме яичника являются одной из составляющих причин нарушения фолликулогенеза при СПКЯ как причины бесплодия, а также нарушения регуляции системы гипоталамус - яичники.

Выводы

1. У фертильных женщин экспрессия рецепторов к эстрадиолу и прогестерону в фолликулах и в строме яичников различные. Если в клетках фолликула все эстрогеновые и прогестероновые рецепторы связаны эндогенными гормонами, то в клетках стромы часть из них остается свободной, то есть потенциально активной, что, вероятно, связано с особенностями метаболических процессов в этих составляющих единого для данных структурных элементов органа.

2. При СПКЯ экспрессия рецепторов к эстрадиолу и прогестерону теряет установленную в норме однозначность. Как для реакций в стенках фолликула, так и в строме появляются разные варианты взаимодействия и его выраженности.

3. Наиболее значимые изменения в экспрессии рецепторов при СПКЯ в стенках фолликула относятся к прогестерону. По отношению к норме она инвертируется. Если в норме все рецепторы блокированы эндогенными гормонами, то при СПКЯ их значительная часть остается свободной, что может быть связано с нарушением диффузии гормонов через клеточные мембраны.

4. В строме яичников направленность реакции взаимодействия рецептор-гормон как для эстрадиола, так и прогестерона у больных СПКЯ и фертильных женщин совпадала. Она была положительной или преимущественно положительной. Однако при СПКЯ существенно менялся характер взаимодействия. Преобладающей при СПКЯ становилась умеренна или выраженная реакция, против слабой в норме.

5. Характер рецепторного взаимодействия эстрогенов и прогестерона в фолликулах и строме яичников может играть существенную роль непосредственно в фолликулогенезе и бесплодии.


Expreesion of oestrogen and progesterone receptors in ovary under the polycystic ovary syndrome.

Vosckresenskiy S. L. ¹, Hrudnitskaya E. N. ¹, Tarasuk I. V.² , Vladimirskaya T. E. ²

(¹ Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, ² Department of obstetrics and gynecology, Central Scientific Research Laboratory)


Summary


The immunohistochemical trial with the using of mononuclear antibodies to the estradiol and progesterone receptors in ovary stroma and maturing follicle wall in 15 female patients with infertility due to polycystic ovary syndrome and in 6 fertil women was performed.

 There was revealed that the receptor expressions to the estradiol and to the progesterone in follicles and in ovary stroma are different.In follicle cells all oestrogen and progesterone receptors were bound by endogenous hormones. In stroma cells the part of them were released, i.e. active.

 Under the polycystic ovary syndrome the interaction of receptors and hormones was altered. The most prominent cahges in receptor expression under the PCOS were refered to the progesterone.

 Concerning the standard the reaction with the progesterone was being inverted that could have been related to the hormone diffusion alteration through the cell membranes. The character of "hormone-receptor" interaction was changed substantially also:the moderate or prominent reactions was predominating against the mild reaction within the normal range.

The following conclusion was done: the character of oestrogen and progesterone receptor interaction in follicle and ovary stroma can play the important role both in folliculogenesis and in infertility.

 Key words: Polycystic ovary syndrome, receptors to the oestrogen, receptors to the progesterone in ovary, immunohistochemistry.

 

 


Литература

1. Беляева, Л.Е. Гинекологическая эндокринология: патофизиологические основы / Л.Е. Беляева, В.И. Шебеко. – М.: Мед. лит., 2009. – 256 с.
   
2. Боярский, К.Ю. Молекулярные основы фолликулогенеза. Часть I. От первичных половых клеток до антральных фолликулов / К.Ю. Боярский // Проблемы репродукции. - 2006. –№ 4. - С.61-67.
   
3. Гланс, С. Медицинская статистика / С. Гланс // Пер. с англ. С-Пб: Питер, 2000. – 495 с.
   
4. Иммуногистохимические методы определения прогностических факторов при раке молочной железы: № 134-1108: Утв. Мин-во. Здравоохр. РБ 05.03.09 / М-во здравоохранения РБ.— Минск, 2009.— 15 с.
   
5. Иммуногистохимические особенности фиброаденом молочной железы / М.В. Самойлов [и др.] // Архив патологии. – 2007. – № 4. – С.41-42.
   
6. Линде, В.А. Фолликулогенез: от примордиальной зародышевой клетки до белого тела (обзор литературы) / В.А. Линде, А.В. Иванов // Проблемы репродукции. - 2007. – № 4. - С.21-25.
   
7. Морфологические и иммуногистохимические параллели при гиперплазиях эндометрия / Е.А. Коган [и др.] // Архив патологии. – 2007. - № 6. – С.21-24.
   
8. Подзолкова, Н.М. Селективные модуляторы стероидных рецепторов (обзор литературы) / Н.М. Подзолкова, Ю.А. Колода // Проблемы репродукции. - 2005. –№ 3. - С.6-13.
   
9. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STSTISTICA / О.Ю. Реброва. – М.: Медиа Сфера, 2006. – 312 с.
   
10. Рецепторы половых гормонов в пролактиномах гипофиза у больных разного пола / В.Н. Бабичев [и др.] // Проблемы эндокринологии. - 2007. – № 1. - С.42-46.
    
11. Рецепторы эстрогенов в диагностике и лечении гормонозависимых опухолей / В.Н. Бабичев [и др.] // Проблемы эндокринологии. - 2009. – № 4. - С.34-36.
    
12. Статистические методы анализа в клинической практике. Часть I. Одномерный статистический анализ / П.О. Румянцев [и др.] // Проблемы эндокринологии. – 2009. – № 5. – С.48-55.
    
13. Статистические методы анализа в клинической практике. Часть II. Анализ выживаемости и многомерная статистика / П.О. Румянцев [и др.] // Проблемы эндокринологии. – 2009. – № 6. – С.48-56.
    
14. Стероидные рецепторы нормального эндометрия / Н.М. Побединский [и др.] // Акушерство и гениекология. – 2000. - № 3. – С.5-8.
    
15. Чагай, Н.Б. Функция коры надпочечников при синдроме поликистозных яичников / Н.Б. Чагай, М.А. Геворкян // Проблемы репродукции. - 2007. - № 4. - С.35-39.
    
16. Androgen, estrogen and progesterone receptor expression in the human uterus during menstrual cycle / H.J.M.M. Mertens [et al] // Eur. J. Obst. Gynec. Reprod. Biol. – 2001. - № 98. – P.58-65.
    
17. Azziz, R. High level of androgens is a main feature of polycystic ovary syndrome / R. Azziz // Fertil. Steril. – 2005. – Vol. 80. – P.323-331.
    
18. Bryant, H.U. Selective estrogen receptor modulators / H.U. Bryant // Rev. Endocr. Metab. Dis. – 2002. - № 3. – P.231-241.
    
19. Deroo, B.J. Estrogen receptors and human disease / B.J. Deroo, K.S. Korach // J. Clin. Invest. – 2006. – Vol. 116, № 3. – P. 561-570.
    
20. Erman, D.A. Polycystic Ovary Syndrome / D.A. Erman // N. Engl. J. Med. – 2005. – Vol. 352, № 12. – P.1223-1236.
    
21. Gonadotropin induction of ovulation and corpus luteum formation in young estrogen receptor-alpha knockout mice / C.S. Rosenfeld [et al] // Biol. Reprod. – 2000. - № 62. – P.599-605.
    
22. Madhabananda, S. Differential expression of estrogen receptor-β and estrogen receptor-α in the rat ovary / S. Madhabananda, F. Welsch / Endocrinol. – 2010. – Vol. 140, № 2. – P. 963-971.
    
23. Sar, M. Differential expression of estrogen receptor-beta and estrogen receptor-alpha in the rat ovary / M. Sar, F. Welsch // Endocrinology. – 1999. – Vol. 140. – P. 963-971.