Молекулярно-генетический анализ генофондов редких и исчезающих видов растений пермского края

Вид материала

Автореферат диссертации

Содержание Результаты и их обсуждение 3.1. Adonis vernalis L. 3.2. Adonis sibirica Patrin ex Ledeb. As1 составила 22 особи, в As2 1.3. Paeonia anomala L. 1.4. Adenophora lilifolia (L.) A.DC. 1.5. Digitalis grandiflora Mill. P. anomala 4.1. Анализ генетического разнообразия популяций двух видов рода Adonis A. vernalis A. sibirica A. sibirica 4.2. Анализ генетической изменчивости Adenophora lilifolia (L.) A.DC. Ad. lilifolia 4.3. Анализ генетической изменчивости популяций

Подобный материал:

• Красная книга, 61.32kb.
• Венции должны содействовать восстановлению исчезающих видов, в частности, путем разработки, 98.37kb.
• Молекулярно-генетический анализ тапеторетинальной абиотрофии в республике башкортостан, 292.82kb.
• «Путешествие по регионам Большого Алтая, 177.44kb.
• Международного Союза Охраны Природы Питеру Скотту. По его инициативе в мсоп в 1949, 1423.12kb.
• Темы Вашего учебного проекта, 61.28kb.
• Правительство Республики Казахстан постановляет : Утвердить прилагаемую сохранения, 754.5kb.
• Правительство Республики Казахстан постановляет: Утвердить прилагаемую программу сохранения, 712.05kb.
• Секция: Стратегия сохранения редких и исчезающих видов наземной фауны, 135.39kb.
• Об охране окружающей среды, 2522.13kb.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3. Биологические особенности редких реликтовых видов растений и характеристика избранных для изучения популяций


3.1. Adonis vernalis L.

В Пермском крае отмечено 19 местонахождений A. vernalis. За последние 15 лет общая численность этого вида сократилась на 20-25% (Боронникова, 2008). Показано, что основной вклад в семенное размножение A. vernalis вносят средневозрастные генеративные особи (), составляющие эффективную численность популяций. Установлено, что к популяциям с низкой общей численностью относятся Av3, Av6, Av7, Av8, Av10 (от 39 в Av7 до 184 особей в Av6), а к популяциям с высокой общей численностью – Av1,Av2, Av4, Av5, Av9 (от 248 в Av2 до 562 особей в Av1). Нами установлено, что в изученных популяциях A. vernalis с низкой общей численностью эффективная численность варьировала от 8 (Av7) до 64 особей (Av6), а в популяциях с высокой общей численностью эффективная численность – от 99 (Av4) до 194 (Av9) особей. Популяции Av3 , Av6, Av7 и Av10 находятся под антропогенным воздействием сильной степени, популяции Av, Av2, Av5 и Av8 – средней, а Av4 и Av9 – слабой степени.


3.2. Adonis sibirica Patrin ex Ledeb.

В Пермском крае выявлено 16 местонахождений A. sibirica. Размножение этого вида в естественных условиях происходит только семенным путем. Установлено, что как и у A. vernalis, так и у A. sibirica принимают участие в семенном размножении преимущественно средневозрастные генеративные особи (). Общая численность в As1 составила 22 особи, в As2 – 246, в As3 – 257 особей. В As1 к настоящему времени эффективная численность равна 3 особям, в As2 и As3 – 89 и 77 особям соответственно. C 1994 по 2008 гг. из-за строительства горнолыжной трассы общая численность As1 сократилась на 75.00 %, а эффективная численность – на 85.71% (рис. 1). Исследованные популяции находятся под антропогенным воздействием As1 сильной, As2 средней и As3 слабой степени.

1.3. Paeonia anomala L.

В северной части Пермского края P. anomala представлен популяциями с большой стабильной численностью. В центральной части края из-за антропогенного воздействия численность популяций сокращается. Общая численность Pa2 в 1988 составляла 562 особи (Боронникова, 2002), а в 2008 году – 377 особей, то есть за 20 лет сократилась на 41.04%. Эффективная численность популяции за этот же период сократилась с 402 до 224 особей, то есть на 44.28% (рис. 1). Одной из причин сокращения показателей численности Pa2 является усиление антропогенного воздействия в связи со строительством новой автомобильной трассы в 1 км от Pa2. В Pa1 общая численность составила 957, а эффективная – 190 особей. В Pa3 общая численность составила 441 особь, а эффективная численность – 146 особей. По нашим данным в природе P. anomala размножается только семенным путем (Боронникова, 2002). Нами установлено, что в семенном размножении у P. anomala принимают участие особи g₂ , редко g₃. Изученные популяции находятся под антропогенным воздействием средней степени, кроме Pa2, которая испытывает антропогенное воздействие сильной степени.

As1

Pa2

Рис. 1. Динамика общей и эффективной численности первой популяции (As1) A. sibirica и второй популяции (Pa2 ) P. anomala


1.4. Adenophora lilifolia (L.) A.DC.

Общая численность вида в крае сократилась за последние 10 лет в среднем на 15-20% (Боронникова, 2008). В изученных популяциях Ad. lilifolia этот показатель варьировал от 59 особей в Ad.lil.4 до 293 особей в Ad.lil.1, а эффективная численность – от 36 в в Ad.lil. 4 до 239 особей в Ad.lil.1. По нашим данным размножение вида в природе осуществляется и семенным и вегетативным, то есть комбинированным способом (Боронникова, 1999). Наибольший вклад в семенную продуктивность вносят особи g₂ и g₃, которые и определяют эффективную численность популяций. Сильную степень антропогенного воздействия испытывает популяция Ad.lil.4, среднюю – Ad.lil.1, а слабую – Ad.lil.2 и Ad.lil.3.

1.5. Digitalis grandiflora Mill.

D. grandiflora на территории Пермского края встречается, в основном, в островной Кунгурской лесостепи, где и отмечено 12 местонахождений этого вида. Общая численность изученных популяций D. grandiflora варьировала от 56 (Dg3) до 487 особей (Dg1), а эффективная – от 40 до 304 особей соответственно. Для вида характерен комбинированный (семенной и вегетативный) способ размножения. При анализе показателей семенной продуктивности особей D. grandiflora разных возрастных групп генеративного периода было отмечено, что у средневозрастных особей показатели выше, чем у особей остальных групп (Боронникова, 2009б). Эффективная численность у данного вида представлена особями g₂ и g₃. Изученные популяции D. grandiflora находятся под антропогенным воздействием сильной (Dg3), средней (Dg1, Dg2) и слабой степени (Dg4, Dg5).

Таким образом, избранные для изучения 5 редких реликтовых видов представлены в Пермском крае, кроме P. anomala, небольшим числом сравнительно малых по численности популяций. Три из изученных видов (A. vernalis, A. sibirica, P. anomala) размножаются только семенным путем. Для Ad. lilifolia и D. grandiflora характерен комбинированный (и семенной и вегетативный) способ размножения. Эффективная численность популяций выявлена благодаря изучению участия в семенном размножении особей разных возрастных групп генеративного периода. Самые низкие значения данного показателя характерны для видов рода Adonis (3 особи у A. sibirica и 8 особей у A. vernalis), а самые высокие – для P. anomala (от 146 до 224 особей).


4. Анализ генофондов редких видов растений на основании оценок полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными микросателлитными повторами (ISSR-PCR маркеры)


4.1. Анализ генетического разнообразия популяций двух видов рода Adonis

В изученных популяциях A. vernalis выявлено 109 амплифицированных ISSR-фрагментов ДНК, из которых 100 были полиморфными. Число амплифицированных фрагментов ДНК в общей выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 19 (М9) до 29 (М12). В среднем при ISSR-анализе у A. vernalis один праймер инициировал синтез 22 фрагментов ДНК. Число полиморфных ISSR-фрагментов A. vernalis варьировало от 16 до 29, а их размеры – от 210 до 1900 пн (рис. 2).



Рис. 2. ISSR-спектр популяции A.vernalis (Аv1) c праймером М1: цифрами обозначены номера проб, М - молекулярный маркер, стрелками указаны некоторые полиморфные фрагменты ДНК


Доля полиморфных локусов в общей выборке в среднем (при ) составила 91.74%. В популяциях данный показатель варьировал от 34.86% в Av2 до 62.39% в Av6. Ожидаемая гетерозиготность A. vernalis по локусам равна 0.313. Этот показатель самый высокий в Av4 (0.242), а низкий – в Av2 (0.147) (Боронникова и др., 2007; Боронникова и др., 2008). Абсолютное число аллелей на локус (в нашем случае на фрагмент ДНК) на общую выборку составило 1.973, а эффективное число аллелей на локус () – 1.521. Число редких аллелей (фрагментов ДНК с частотой <=0,05) варьировало по популяциям от 0 (Av4) до 8 (Av6).

Генетическая структура изученных популяций A. vernalis: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей популяции выше (=0.313), чем в субпопуляциях (=0.184). Коэффициент подразделенности популяций () показывает, что на межпопуляционную компоненту генетического разнообразия A. vernalis приходится 41.22% разнообразия, то есть изученные популяции сильно дифференцированы (Боронникова и др., 2009г). Наименьшее генетическое расстояние между исследуемыми популяциями A. vernalis отмечено между Av2 и Av6 (0.109), а наиболее генетически удаленными являются популяции Av1 и Av4 (0.305). На дендрограмме (рис. 3) популяции A. vernalis сформировали 3 кластера по 2 выборки, соответствующие исследованным популяциям. Узлы ветвления имеют высокую поддержку (индекс бутстрепа >50%).




Рис. 3. UPGMA дендрограмма генетического сходства популяций, построенная на основании полиморфизма ISSR-маркеров A.vernalis. Шкала сверху – генетические дистанции. На дендрограмме указаны значения бутстрепа (в %)


Среднее значение индексов разнообразия Шеннона () в изученных популяциях A. vernalis, рассчитанные по ISSR-праймерам, составило 0.278. Выше этот показатель в Av4. Индекс разнообразия Шеннона, рассчитанный на общую популяцию A. vernalis, равен 0.477. На долю внутрипопуляционного генетического разнообразия A. vernalis приходится 58.40%, а на долю межпопуляционного – 42.60%. Итак, оба подхода к определению генетического разнообразия, то есть определение показателя подразделенности популяций () и коэффициента разнообразия Шеннона () у A. vernalis дали близкие результаты.

Таким образом, самые высокие показатели генетического разнообразия отмечены в популяциях Октябрского района (Av4, Av5, Av6), а самые низкие показатели – в самой северной популяции на Спасской горе (Av2). Высокое число редких аллелей в Av2 (=7) указывает на необходимость сохранения данной популяции в качестве генетически уникальной.

Полиморфизм структурных элементов генома A. sibirica был выявлен с использованием тех же ISSR-праймеров, что и у A. vernalis. В трех изученных популяциях A. sibirica ISSR-праймеры инициировали синтез меньшего, чем у A. vernalis, числа ампликонов, равного 74, из которых 66 были полиморфными ( =89.19%). Размеры ампликонов в A. sibirica варьировали от 270 до 1620 пн. В среднем при ISSR-анализе у A. sibirica один праймер инициировал синтез 14.8 фрагментов ДНК, что значительно меньше, чем у A. vernalis (22 ампликона). Высокий процент полиморфизма ISSR-маркеров отмечен в As3 (=81.08%), а самый низкий – в As1 (=35.13%). Низкие значения ожидаемой гетерозиготности () отмечены в As1 (0.142), а высокие – в As2 (0.243). В общей популяции A. sibirica ожидаемая гетерозиготность выше и составила 0.356. Абсолютное число аллелей на локус на общую выборку A. sibirica составило 1.914. Этот параметр выше в As2 и ниже в As1. Эффективное число аллелей на локус () на общую популяцию составило 1.608. Наибольшее значение данного показателя отмечено в As3 (1.409), а его резкое снижение – в As1 (1.257). Наибольшее число редких аллелей отмечено в As3 (=11). Редкие аллели отсутствуют в As1, что свидетельствует об обеднение генофонда этой популяции. Генетическая структура популяций A. sibirica такова: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов выше в общей популяции (=0.334), чем в субпопуляциях (=0.214). Показатель генетической подразделенности популяций () A. sibirica равен 0.358. Генетически более гетерогенна As3 (=81.08%; =0.235; =1.409), а наименьшие основные показатели генетической изменчивости отмечены в As1 (=35.13%; =0.145; =1.257). Таким образом, на межпопуляционную изменчивость у A. sibirica приходится 35.77% генетического разнообразия. Наибольшее генетическое расстояние отмечено между As2 и As3 (0.290), а наименьшее между As1 и As2 (0.166). Кластерный анализ показал, что As1 генетически ближе к As2. Третья популяция (As3) находится на большем генетическом расстоянии от первых двух популяций и характеризуется наименьшей степенью родства с ними. Среднее значение индексов разнообразия Шеннона () в изученных популяциях A. sibirica, рассчитанные по ISSR-праймерам, составило 0.292. Выше этот показатель в As3. Индекс Шеннона, рассчитанный на общую популяцию A. sibirica, равен 0.504. На долю внутрипопуляционного генетического разнообразия A. sibirica приходится 59.55%, а на долю межпопуляционного – 40.45% разнообразия.

Таким образом, молекулярно-генетический анализ двух видов рода Adonis показал, что полиморфизм ISSR-маркеров высок у обоих видов (91.74% у A.vermalis и 89.19% у A. sibirica). У A. vernalis большая часть генетической изменчивости (по данным G-статистики) является внутрипопуляционной (58.78%), на межпопуляционную изменчивость приходится 41.22 % генетического разнообразия. У A. sibirica сохраняется та же тенденция: внутрипопуляционная изменчивость составляет большую часть (64.20%), на межпопуляционную изменчивость данного вида приходится 35.77% генетического разнообразия. Среди изученных популяций A. vernalis тенденция к обеднению генофонда отмечена в Av2 (=34.86%; =0.122; =1.199; =7) и Av3 (=40.37%; =0.139; =1.125). Среди изученных популяций A. sibirica деградация генофонда выявлена у As1 (=35.13%; =0.145; =1.257). Данная популяция находится в критическом состоянии и требует экстренных мер охраны.

4.2. Анализ генетической изменчивости Adenophora lilifolia (L.) A.DC.

У Ad. lilifolia, выявлено 56 амплифицированных ISSR-фрагментов ДНК, из которых 46 были полиморфными. Число амплифицированных фрагментов ДНК в общей выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 9 (праймеры М8, Х10) до 15 (праймер М1), а их размеры – от 279 до 1370 пн. В среднем один праймер инициировал синтез 11 фрагментов ДНК. Доля полиморфных локусов в общей выборке в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 75.00% до 90.91% и, в среднем, составила =82.14 %. Данный показатель выше в Ad.lil.1 и ниже в Ad.lil.4. Ожидаемая гетерозиготность по локусам Ad. lilifolia составила 0.228. Абсолютное число аллелей на локус равно 1.930, а эффективное число аллелей на локус () – 1.412. Ожидаемая гетерозиготность выше в Ad.lil.3 и значительно ниже в Ad.lil.4. Абсолютное число аллелей () на локус выше в Ad.lil.1, а эффективное число аллелей на локус () и ожидаемая гетерозиготность () выше в Ad.lil.3. Наименьшие значения эти показатели имеют в Ad.lil.4. Ожидаемая доля гетерозиготных генотипов на общую популяцию Ad. lilifolia () составила 0.270; а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляциях () равна 0.228. Итак, среднее выборочное генетическое разнообразие по популяциям ниже, чем общее генетическое разнообразие в общей популяции. Коэффициент подразделенности популяций () показал, что на межпопуляционную компоненту Ad. lilifolia приходится 15.51% разнообразия (Боронникова, 2009г).

Таким образом, при молекулярно-генетическом анализе Ad. lilifolia установлено, что доля полиморфных локусов и абсолютное число аллелей выше в Ad.lil.1, а эффективное число аллелей и ожидаемая гетерозиготность – в Ad.lil.3. Все выше перечисленные показатели генетического разнообразия достоверно ниже в Ad.lil.4.

4.3. Анализ генетической изменчивости популяций

Digitalis grandiflora Mill.

При ISSR-анализе структурных элементов генома D. grandiflora выявлено 111 амплифицированных фрагмента ДНК, из которых 90 были полиморфными (81.08%). Число амплифицированных фрагментов ДНК в общей выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 15 (X10) до 24 (M9), а их размеры – от 200 до 2200 пн. В среднем, при ISSR-анализе D.grandiflora один праймер инициировал синтез 22.2 фрагментов ДНК. Число полиморфных фрагментов в общей выборке варьировало от 14 до 22. Доля полиморфных локусов и в Dg1 и в Dg2 составила 66.36%, а в Dg3 – 50.45%. Ожидаемая гетерозиготность () D. grandiflora равна 0.237. Данный показатель выше в Dg1 (0.207). Абсолютное число аллелей на локус () у D. grandiflora равно 1.991, а эффективное число аллелей на локус () – 1.394. Абсолютное число аллелей на локус ниже в Dg1, а эффективное число аллелей на локус ниже в Dg2 и Dg3. Число редких аллелей у D. grandiflora выше, чем у других изученных видов и равно 18. Наименьшее их число отмечено в Dg1 (=3), а наибольшее – в Dg3 (=17).

Анализ генетической структуры популяций показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов на всю подразделенную популяцию D. grandiflora () равна 0.261, а в субпопуляциях () – 0.190. Показатель генетической подразделенности популяций () D. grandiflora равен 0.272. Таким образом, на межпопуляционную изменчивость у данного вида приходится 27.22% генетического разнообразия. Среднее значение индексов разнообразия Шеннона () в изученных популяциях D. grandiflora, рассчитанные по ISSR-праймерам, составило 0.292. Кластерный анализ показал, что Dg2 генетически ближе к Dg3 (=0.076). Dg1 находится на большем генетическом расстоянии от Dg2 (=0.269) и Dg3 (=0.329). Среди изученных популяций D. grandiflora тенденция к обеднению генофонда отмечена в Dg3 (=50.45%; =0.181; =1.281).

Таким образом, ISSR-маркеры позволяют получить ценные сведения о генетическом полиморфизме участков генома, фланкированных микросателлитными повторами, определить основные параметры генетического разнообразия и дифференциации популяций, на основании которых установить основные характеристики генофондов редких и исчезающих видов растений.