При мужской инфертильности

Вид материала

Влияние репротоксических факторов на процессы свободнорадикального окисления в сперме мужчин с идиопатическим бесплодием
Влияние криоконсервации на процессы свободнорадикального окисления

Подобный материал:

1 2 3 4

Таблица 4

Содержание ПХДД/ПХДФ в сперме жителей

некоторых промышленных городов (пг ТЭ-ВОЗ/г липидов)

Поллютант		Город
		Уфа	Стерли-тамак	Салават		Ишим-бай	Туйма-зы	Благо-вещенск	Октябрь-ский
ТХДД		9,7	9,2	14,9		0	0	0	0
ПнХДД		25,9	19,0	29,7		1,3	1,0	7,5	451,3
ГкХДД		4,8	1,8	6,9		0,9	1,4	5,0	11,7
ГпХДД+ОХДД		1,0	1,0	1,0		0,6	0,1	3,8	4,3
ТХДФ+ ПнХДФ		40,5	19,2	56,4		79,4	135,1	276,1	285,9
ГкХДФ		19,8	5,2	23,8		53,9	43,6	92,6	67,7
ГпХДФ+ ОХДФ		3,0	1,3	3,2		3,1	1,3	8,0	10,0
Всего:		104,7	56,7	135,9		139,2	182,5	393,0	823,7
В среднем		262,4
	ГкХДД – гексахлордибензо-п-диоксин				ОХДД – октахлордибензо-п-диоксин
	ГпХДД – гептахлордибензо-п-диоксин				ОХДФ – октахлордибензофуран
	ГкХДФ – гексахлордибензофуран				ПнХДД – пентахлордибензо-п-диоксин
	ГпХДФ – гептахлордибензофуран				ПнХДФ – пентахлордибензофуран
	ТХДД – тетрахлордибензо-п-диоксин

Результаты исследования состояния репродуктивной функции жителей промышленных городов приведены в табл. 5. Сравнительный анализ качественных и количественных характеристик эякулята выявил ряд важных особенностей показателей спермограмм жителей индустриальных городов. Фактически у двух третей мужчин, включенных в группу наблюдения, имелся тот или иной вид патологии спермограммы. Так, в среднем по выборке доля подвижных сперматозоидов составляла 47,8 %, что несколько ниже рекомендованных значений, а в целом у жителей четырех из шести обследованных городов величина этого показателя не соответствовала норме. Практически те же изменения – на нижней границе нормативных значений – были характерны для другого параметра качества сперматозоидов – доли морфологически измененных клеток.

Таблица 5

Показатели эякулята и уровень патозооспермии у обследованных мужчин –

жителей промышленных городов (n=565)

Города РБ Показатели эякулята	Уфа	Стерлитамак	Салават	Ишимбай	Туймазы	Благовещенск	Октябрьский
Число наблюдений	222	126	58	34	59	33	33
Объем, мл	3,1 0,45	3,3 0,58	3,6 0,52	2,6 0,49	3,7 0,62	3,0 0,45	3,0 0,51
Концентрация сперматозоидов, млн/мл	40,7 5,2	38,8 4,3	30,5 5,6	45,2 7,3	40,9 6,3	34,7 4,2	33,8 5,1
Подвижность категории «а»+«б», %	53,2 4,6	49,9 4,1	43,8 6,0	52,4 5,8	41,4 5,4	44,3 3,6	45,9 4,8
Морфологически измененные формы, %	40,5 3,8	41,0 5,8	43,9 5,3	34,4 6,0	38,3 4,1	42,1 3,2	40,5 5,6
Патозооспермия,%	14,9	7,9	19,0	20,6	16,9	27,3	27,3

Далее был проведен анализ зависимости процента патозооспермии от поллютанта. Выявлена прямая зависимость между содержанием диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме и развитием патозооспермии (R=0,78, p=0,040).

Феномен загрязнения спермы диоксинами служит доказательством взаимосвязи между состоянием окружающей среды и изменениями репродуктивной функции и демонстрирует ценность данных маркеров как индикаторов влияния средовых и производственных факторов. Большая вариабельность показателей спермограммы у мужчин с бесплодием, наличие нормальных показателей спермограммы и в то же время неспособность мужчин к оплодотворению, заставляет искать дополнительные критерии для оценки качества сперматозоидов и спермоплазмы.

Влияние репротоксических факторов на процессы свободнорадикального окисления в сперме мужчин с идиопатическим бесплодием

Для проведения исследования было сформировано 4 группы соматически здоровых, сексуально активных мужчин, состоящих в бесплодном браке:

I - Коренные жители районов с высоким уровнем содержания диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме с нормозооспермией на момент исследования;

II - Коренные жители районов с высоким уровнем содержания диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме с патозооспермией на момент исследования;

III - Коренные жители районов с низким уровнем содержания диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме с нормозооспермией на момент исследования;

IV - Коренные жители районов с низким уровнем содержания диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме с патозооспермией на момент исследования.

Патозооспермия, выявленная во второй и четвертой группах наблюдения, носила идиопатический характер. Достоверных различий по основным параметрам спермограммы между группами I и III (нормозооспермия в экологически неблагополучных и благополучных районах) и группами II и IV (патозооспермия в экологически неблагополучных и благополучных районах) не было выявлено.

При исследовании люминолзависимой ХЛ семенной жидкости пациентов определяли уровень АФК, генерируемых половыми клетками (рис.3). Антиокислительные свойства спермоплазмы (Fe²⁺-индуцированная ХЛ)- оценивали в процентах от величины угнетения свечения модельной системы, при добавлении к последней 0,1мл спермоплазмы (рис. 4.)

Рис. 3. Пример записи ЛЗХЛ эякулятов пациентов исследуемых групп. Нумерация кривых соответствует номеру группы (кривая I-IV)

Рис. 4. Запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК (кривая М), и модельной системы, генерирующей АФК, с добавлением 0,1мл спермоплазмы пациентов I, II, III, IV групп (кривая I-IV)

Достоверных различий по показателю светосуммы, спонтанной светимости, максимальной светимости между всеми группами не было выявлено. Показатели ЛЗХЛ по группам представлены в табл. 6. Обращает на себя внимание факт выявления низкой антиокислительной активности (29,1±1,96%) во второй группе наблюдения (группа с патозооспермией в регионе с неблагоприятной экологической обстановкой), причем наибольшая разница получена с группой III (38,3±2,43%), куда были включены пациенты с нормозооспермией, проживающие в относительно благополучных по экологической обстановке районах.

Таблица 6

Уровень ЛЗХЛ семенной жидкости в группах наблюдения (n=120)

_{Показатели ЛЗХЛ}	_{Группы обследованных пациентов}
_{Показатели ЛЗХЛ}	_I _группа	_II _группа	_III _группа	_IV _группа
_{светосумма,} _отн.ед.	_6,6±1,99	_12,0±2,08	_6,6±1,85	_9,5±1,87
_{спонтанная} _{светимость, отн.ед.}	_1,8±0,32	_1,9±0,22	_1,6±0,27	_1,9±0,36
_{максимальная} _{светимость, отн.ед.}	_2,7±0,43	_3,4±0,37	_2,5±0,50	_3,1±0,39

Также получены достоверные различия между I (31,4±1,69%) и III (38,3±2,43%) группами. Данные различия свидетельствуют о том, что при идиопатической форме патозооспермии в регионе с повышенным риском экзогенного воздействия токсических факторов наблюдается снижение защитных свойств спермоплазмы в виде снижения уровня суммарной антиокислительной активности.

При сопоставлении данных, полученных при исследовании люминолзависимой ХЛ и Fe²⁺-индуцированной ХЛ в группах наблюдения, особенно обращает на себя внимание тот факт, что во второй группе наблюдения уровень светосуммы в исследуемых образцах спермы имел наивысшее значение при уменьшении угнетения свечения модельной системы, генерирующей АФК. Причем снижение уровня антиокислительной активности спермоплазмы у этих пациентов было более выражено. Таким образом, можно выдвинуть гипотезу о влиянии экзогенных факторов на процессы свободнорадикального окисления в семенной жидкости, что проявляется в виде падения уровня суммарной антиокислительной активности спермоплазмы и повышенного образования АФК морфологически или функционально неполноценными клетками, которое сочетается с развитием идиопатической патозооспермии.

Экспериментальные модели повреждающего действия экзогенных факторов на сперматогенез. Оценка влияния хронической интоксикации на сперматогенез и процессы свободнорадикального окисления

Для подтверждения гипотезы о нарушении процессов свободнорадикального окисления при действии стойких органических загрязнителей на половые клетки была проведена экспериментальная оценка влияния хронической интоксикации на сперматогенез белых крыс. Животные были разделены на три группы (первая, вторая и контрольная).

Предварительно было проведено изучение влияния на СРО «ПропоФлана» по изменению ХЛ при добавлении к модельной системе, генерирующей АФК (рис.5.), и к модели, в которой протекают реакции ПОЛ, содержащей липидно-белковые комплексы из гомогенизированного куриного желтка (рис.6.).

1

2

1

2

Рис.5. Антиокислительная активность «ПропоФлана»: 1 - запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК; 2 - запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК, с добавлением «ПропоФлана»

Рис.6. Влияние «ПропоФлана» на хемилюминесценцию желточных липопротеидов: 1 - контороль; 2 – контроль с добавлением 0,4мл «ПропоФлана»

Полученные данные свидетельствуют о высокой антиокислительной активности «ПропоФлана», препарат способен взаимодействовать с АФК и подавлять ПОЛ in vitro.

При ежедневном введении «Совтола» в течение 3 месяцев в суммарной дозе 0,05 LD₅₀ величины индексов фертильности, гестации и плодовитости составили 20, 75 и 4,3 соответственно, что в 5, 1,3 и 2,1 раза меньше, чем в контрольной группе. Наименьшие изменения претерпевал показатель индекса гестации, несущий информацию преимущественно о способности к вынашиванию беременности. Во второй группе животных уменьшалось как число беременных и родивших самок, так и количество рожденных крысят, что сопровождалось снижением величин индекса фертильности и плодовитости в 2 и 1,6 раза, соответственно. Индекс гестации не претерпевал изменений. Что касается соотношения полов крысят, то не удалось обнаружить значительных сдвигов величины этого параметра.

Таким образом, продолжительное введение стойких органических загрязнителей приводит к развитию у половозрелых самцов крыс нарушения фертильности. Параллельное введение антиоксиданта «ПропоФлана» нивелирует отрицательный эффект «Совтола», увеличивая индексы фертильности, гестации и плодовитости.

После окончания затравки животные забивались. Сперматозоиды извлекали из хвостовой части придатка яичка после продольного его разрезания, дозированным вымыванием физиологическим раствором натрия хлорида в течение 2 мин. Концентрацию клеток в образцах доводили до 10 млн/мл, после чего проводилась дифференциальная окраска сперматозоидов с последующей оценкой строгой морфологии. При оценке дифференциальной окраски сперматозоидов выявлялась достоверно большая частота патоспермии (патология головки - 48,4±8,4%) в первой группе крыс по сравнению с группой контроля (патология головки - 21,3±2,4%)(данные представлены в табл. 7).

Во второй группе отмечалось относительное уменьшение патологических форм сперматозоидов по сравнению с первой группой, но различия не были достоверны ни с первой группой, ни с группой контроля.

Таблица 7

Уровень патоспермии в группах наблюдения

Показатели, %	I группа	II группа	контрольная
Патологические формы сперматозоидов	66,1±5,7*	51,7±3,3	43,3±3,3
Патология головки	48,4±8,4*	29,7±3,3	21,3±2,4
Патология шейки	9,2±3,5	14,0±1,2	10,9±1,1
Патология хвоста	8,5±2,1	8,0±0,3	11,1±1,3

Примечание: * - р< 0,05 по сравнению с контрольной группой

По уровню ТБК-АП не выявлено достоверной разницы при исследовании гомогенатов придатков яичек (I группа - 0,5±0,05 нМ/мг белка, II группа - 0,4±0,02 нМ/мг белка, контрольная группа - 0,4±0,01 нМ/мг белка) (рис. 7).

В то же время достоверная разница получена при исследовании ТБК-АП в гомогенатах ткани яичек: I группа - 0,4±0,04 нМ/мг белка, II группа - 0,2±0,01 нМ/мг белка (р<0,001 по сравнению с I группой), контрольная группа - 0,3±0,03 нМ/мг белка (р<0,05 по сравнению с I группой) (рис. 8). Таким образом, происходит накопление продуктов ПОЛ в тестикулярной ткани самцов крыс после воздействия репротоксиканта.

Рис.7. Уровень ТБК-АП в ткани придатка яичка крысы

Рис.8. Уровень ТБК-АП в ткани яичка крысы

Оценка люминолзависимой ХЛ гомогенатов семенников лабораторных животных не выявила разницы между исследуемыми группами. Образцы гомогенатов, полученные от интактных животных, отличались очень низкой скоростью образования АФК. Получены статистически достоверные различия по уровню светосуммы между первой (1,8±0,28 отн.ед.) и контрольной (0,9±0,18 отн.ед.) группами (р<0,05), что говорит об увеличении образования АФК в тестикулах животных, подвергнутых хронической затравке. В то же время достоверных различий между второй (1,1±0,15 отн.ед.) и контрольной (0,9±0,18 отн.ед.), а также второй (1,1±0,15 отн.ед.) и первой (1,8±0,28 отн.ед.) группами получено не было, хотя отмечалась тенденция к снижению скорости окислительных реакций после добавления крысам в рацион «ПропоФлана».

При исследовании Fe²⁺-индуцированной ХЛ гомогенатов семенников исследуемых групп крыс отмечено наличие антиокислительной активности в тестикулярной ткани контрольной группы животных, и прооксидантной активности ткани придатка (рис. 9). В группах животных, подвергшихся затравке, теряется антиокислительная активность тестикулярной ткани (рис.10).

Рис.9. Антиокислительная активность гомогенатов тканей семенника и придатка крысы группы контроля: 1 - запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК; 2 - запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК, с добавлением гомогената тестикул; 3 - запись ХЛ модельной системы с добавлением гомогената придатка

Рис. 10. Антиокислительная активность гомогенатов тканей семенника и придатка крысы первой группы: 1 - запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК; 2 - запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК, с добавлением гомогената тестикул; 3 - запись ХЛ модельной системы с добавлением гомогената придатка

Этот факт свидетельствует о том, что дозревание половых клеток в придатке здорового животного протекает при относительно высоком уровне продукции АФК и низкой суммарной антиокислительной активности, что, вероятно, является одним из факторов формирования нормальной функциональной активности зрелой половой клетки.

Антиокислительная активность, выявленная в ткани яичка, говорит о подавляющем действии данной системы на активность половых клеток, что позволяет полноценно сформировать еще незрелые сперматозоиды. В группе животных, подвергавшихся затравке, отмечена потеря антиокислительной активности гомогенатами тестикул при неизменном уровне Fe²⁺-индуцированной ХЛ в гомогенатах придатков. Гомогенат, полученный из тестикул животного, повергавшегося затравке, теряет антиокислительную активность, а гомогенат придатка усиливает свечение модельной системы, генерирующей АФК. Достоверной разницы между первой и второй группами по уровню антиокислительной активности получено не было. Показатели Fe²⁺-индуцированной ХЛ в гомогенатах яичек и придатков яичек графически представлены на рис. 11.

Рис. 11. Антиокислительная активность гомогенатов тканей семенников и придатков крыс в группах наблюдения (I, II и контрольная). За горизонтальную ось с нулевым значением на данном рисунке принята светосумма модельной системы, генерирующей АФК

Таким образом, одним из механизмов, приводящих к развитию патоспермии при действии стойких органических загрязнителей, является нарушение процессов свободнорадикального окисления. Данные изменения проявляются в виде снижения уровня суммарной антиокислительной активности на уровне тестикул, что приводит к ранней активации и незрелости сперматозоидов, и, как следствие, морфологическим изменениям половых клеток и снижению их функциональных характеристик. То есть, дисбаланс между реакциями свободнорадикального окисления и антиокислительной ёмкостью клеток может быть ответственен за возникновение нарушений генеративной функции.

При исследовании морфологии семенников крыс срезы готовились отдельно из придатков и тестикулярной ткани. При оценке гистологических срезов полученных биоптатов учитывали диаметр канальцев, толщину собственной пластинки, высоту зародышевого эпителия. Наглядных различий по диаметру канальцев, толщине собственной пластинки, высоте зародышевого эпителия между всеми группами не было замечено. Отсутствие структурных отклонений со стороны зародышевого эпителия в исследуемых группах свидетельствует о возможной обратимости патологического процесса после удаления поллютанта из тестикулярной ткани, то есть изменения носили функциональный характер. При исследовании ткани придатков отмечено расширение просвета канальцев вследствие сгущения секрета внутри канальца, что приводит к уплощению канальцевого эпителия и потере его многорядности в первой и второй группах животных. Данные изменения были видны при сравнении срезов с группой контроля, где диаметр канальцев в некоторых случаях в два раза меньше, по сравнению с канальцами крыс первой группы. Также обращало на себя внимание уменьшение высоты канальцевого эпителия в группе затравленных крыс.

Таким образом, на фоне хронической затравки диоксиноподобным соединением отмечено увеличение количества морфологически неполноценных клеток, сочетающееся с повышением генерации АФК в тестикулярной ткани и снижением уровня антиокислительной активности тканей яичка. О высоком уровне процессов ПОЛ в яичке свидетельствует также увеличение уровня ТБК-активных продуктов, определяемого в тестикулярной ткани затравленных животных. Выявленные морфологические изменения не затрагивают клетки сперматогенного эпителия, что свидетельствует об обратимости наступивших изменений.

Сбалансированное соотношение уровня выработки АФК и антиокислительной активности на этапах развития половых клеток формирует полноценные сперматозоиды, обладающие способностью оплодотворять яйцеклетку. В яичке созревание сперматозоида происходит под антиоксидантной защитой. Затем сперматозоид проходит в придаток яичка, где антиоксидантная защита ослабевает и несомненную роль в дозревании клетки играет уровень АФК в придатке. Именно в придатке яичка сперматозоиды приобретают способность к самостоятельной генерации АФК, что играет важную роль в их оплодотворяющей способности (процесс капацитации и акросомальной реакции). А при снижении антиокислительной активности в яичке происходит раннее взаимодействие незрелых половых клеток со свободными радикалами, что приводит к преждевременному приобретению способности морфологически неполноценными клетками генерировать АФК.

_{Влияние криоконсервации на процессы свободнорадикального окисления}

С целью изучения процессов _{свободнорадикального окисления}, протекающих в сперме при воздействии резких температурных перепадов, проведено изучение люминолзависимой ХЛ и Fe²⁺-индуцированной ХЛ. Материалом для исследования послужила сперма, полученная от восьми племенных быков, т.е. эякулят с доказанной фертильностью. Проведена оценка люминолзависимой ХЛ после добавления криопротектора до и после криоконсервации.

Проведенные исследования не выявили достоверных различий по показателям люминолзависимой ХЛ при технически правильно выполненной криоконсервации. Сперматозоиды отличаются низким уровнем значения светосуммы и низкой амплитудой свечения, т.е. минимальной скоростью образования АФК как до, так и после криоконсервации. Из рис. 12 следует, что различий по уровню светосуммы свечения как интегрального показателя генерации АФК в сперме быков до и после криоконсервации не наблюдается.

Рис. 12. Изменение светосуммы свечения в сперме быков до и после криоконсервации

Криоконсервация не повлияла на способность спермоплазмы подавлять свечение модельной системы, генерирующей АФК: после размораживания уровень антиокислительной активности оставался практически неизменным – 38% (до заморозки – 38,5%).

Правомерно утверждать, что отличительной особенностью метаболизма в семенной жидкости, полученной от быков – производителей, являются уравновешенность прооксидантных и антиоксидантных систем вне зависимости от воздействия крайне низких температур при последовательной методике замораживания с криопротектором. Данный факт позволяет рекомендовать криоконсервацию для более широкого использования в практической медицине.

С учетом вышеизложенного, разработан алгоритм диагностического поиска при бесплодии в браке, основанный на исследовании эякулята (рис.13). Таким образом, воздействие стойких органических загрязнителей играет важную роль в формировании мужской инфертильности. Одним из механизмов повреждающего действия является дисбаланс между прооксидантным и антиоксидантным звеньями СРО. Разработанный экспресс-метод определения АФК в сперме, основанный на регистрации ХЛ, позволяет выявить изменения в эякуляте, вызванные оксидативным стрессом.

Бесплодие в браке