При мужской инфертильности

Вид материала

Подобный материал:

1 2 3 4

Продолжение табл. 1

№	Этапы и задачи исследования	Объект и объем исследования	Методы исследования
Лабораторный раздел работы
1	Экспериментальное моделирование воздействия ПХБ на сперматогенез и процессы СРО в семенниках лабораторных животных; изучение действия препарата, влияющего на СРО и функциональную активность половых клеток, при хроническом оксидативном стрессе	90 белых (30 самцов, 60 самок) беспородных крыс, разделенных на три группы с учетом поставленных задач	Оценка плодовитости затравленных животных. Изучение морфологии сперматозоидов при помощи дифференциальной окраски клеток; гистологические изучение семенников исследуемых животных. Исследование люминолзависимой и Fe²⁺индуцированной ХЛ гомогенатов тестикул и придатков, лекарственного препарата и отравляющего вещества
2	Изучение влияния криоконсервации на процессы СРО в семенной жидкости	Семенная жидкость, полученная от 8 племенных быков	Регистрация люминолзависимой ХЛ, Fe²⁺индуцированной ХЛ семенной жидкости, клеток и спермоплазмы
3	Анализ результатов, для оценки фертильности	90 белых беспородных крыс; семенная жидкость, полученная от 8 племенных быков	Статистическая обработка данных с использованием t-критерия Стьюдента, сравнение показателей ХЛ и морфологических характеристик семенников, семенной жидкости исследуемых животных

С целью выявления патогенетических механизмов в условиях экзогенных воздействий было проведено изучение параметров СРО в семенной жидкости. Предварительно обследовано 4000 мужчин с 2002 по 2005 годы включительно, обратившихся в Республиканскую клиническую больницу им. Г.Г.Куватова и Республиканский перинатальный центр по проблеме бесплодия в браке. Проведено сопоставление уровней патозооспермии и удельного выброса загрязняющих веществ, приходящегося на единицу площади (по данным Государственного доклада «О состоянии окружающей природной среды Республики Башкортостан в 2000 году»).

Для определения в сперме уровня диоксинов исследована группа из 565 человек в возрасте 26-40 лет, проживающих в промышленных городах Башкирии (Уфа, Стерлитамак, Салават, Туймазы, Ишимбай, Октябрьский). Анализ суперэкотоксикантов производился с помощью комбинированного метода, сочетающего высокоэффективную газовую хроматографию с хроматомасс-спектрометрией высокого разрешения. Система измерения HRGC/HRMS состояла из хроматографа «Carlo Erba 8035» (Италия), хроматомасс-спектрометра «Autospec-Ultima VG» (Великобритания) и колонки DB-5 MS 60 м («J&W Scientific»). Контроль степени извлечения, уровня очистки и калибровки системы измерения был выполнен в соответствии с методикой Агентства США по охране окружающей среды (USEPA 1613) (EPA Method 1613. Tetra-through octa-chlorinated dioxins and furans by isotope dilution HRGC/HRMC., 1994). Поскольку суперэкотоксиканты в наибольшей степени накапливаются в липофильных матрицах, все результаты даны в пересчете на содержание липидов в образцах эякулята. Были сформированы 4 группы наблюдения. Каждая группа включала 30 человек, удовлетворяющих критериям отбора и исключения. Состав всех групп был однороден по возрасту, материально-бытовым условиям, обеспеченности квалифицированной медицинской помощью, продолжительности проживания в данном районе, а также здоровью и социальному положению.

Возраст пациентов колебался от 20 до 45 лет. Средний возраст мужчин в I группе составил 31,2±0,8 лет, во II группе - 30,3±0,8 лет, в III группе - 30,7±1,0 лет, в IV группе – 31,8±1,0 лет. Все обследованные мужчины состояли в бесплодном браке от 1 года до 10 лет. Первичное бесплодие было у 105 пациентов (87,5%), вторичное бесплодие выявлялось у 15 (12,5%) мужчин.

Всем пациентам проведено комплексное клинико-лабораторное обследование с применением инфекционного скрининга (путем полимеразной цепной реакции), гормональных методов диагностики (определение фолликулостимулирующего гормона, тестостерона, пролактина), трансректального ультразвукового исследования предстательной железы и семенных пузырьков, допплерографии сосудов мошонки. Всем пациентам проводились общеклинические исследования эякулята, включающие оценку семенной жидкости, полученную после периода полового покоя.

Изучение процессов генерации АФК спермы при нормо- и патозооспермии было выполнено у всех пациентов исследуемых групп по разработанной методике комплексного исследования состояния генерации АФК в сперме (патенты на изобретения № 2278382 от 20.06.2006г. и № 2272291 от 20.03.2006г., соавт.: Фархутдинов Р.Р., Галимов Ш.Н., Шемагонов Д.В.).

С целью изучения интенсивности свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности проводился хемилюминесцентный анализ спермы. Регистрацию ХЛ эякулята проводили на аппарате «Хемилюминомер – 003» с компьютерным обеспечением. Об интенсивности люминолзависимой ХЛ судили по ряду параметров, в первую очередь, по светосумме и максимальной амплитуде свечения, которые соответствовали скорости образования АФК. Перед измерением свечения определенный исследуемый объем спермы смешивали с 2 мл физиологического раствора, содержащего люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) в конечной концентрации 10^-5 М, и помещали в светоизолированную камеру прибора. Тщательно перемешивали и вели запись ХЛ при 37 °C в течение 5 мин.

Для оценки антиокислительной активности 0,1 мл спермоплазмы добавляли к модельной системе. В качестве модельной системы использовали 20 мл фосфатного буфера (KH₂PO₄ – 20 mM, KCl – 105 mM, рН 7,45) с цитратом (50 mM) и люминолом (10^-5M). В течение 10 секунд записывали темновой ток, после чего вносили инициатор образования АФК – 1 мл 50 mM раствора сернокислого железа (FeSO₄×7H₂O). Конечная концентрация FeSO₄ в среде инкубации составляла 2,5 mM. Запись свечения проводили в течение 5 минут при постоянном перемешивании. При оценке Fe²⁺-индуцированной ХЛ определяли величину спонтанного свечения, продолжительности латентного периода от момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки. Также оценивали амплитуды быстрой и медленной вспышек.

С целью определения источника АФК в эякуляте проводили разделение клеток спермы в градиенте плотности.

Опыты выполнены на 90 белых беспородных крысах репродуктивного возраста массой 200-260 г (30 самцов и 60 самок). Моделью отравления было выбрано пероральное введение полихлорированных бифенилов (ПХБ) – раствора «Совтол». Хроническая интоксикация подопытных животных первой группы (10 самцов) моделировалась введением раствора «Совтол» в течение 3 месяцев в суммарной дозе 0,3 г/кг (0,05 LD₅₀).

Вторую группу составили животные (10 самцов), которым на фоне проведения затравки в дозировке, аналогичной с первой группой, дополнительно в желудок вводили комплекс биофлавоноидов прополиса в виде биологически активной добавки «ПропоФлан» (Свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.5621.11.04. от 10.11.2004; ТУ 9354-002-55832354-04), изготовленной в ЗАО «Фармацевтическая компания «БИОНОРМ», Россия, в дозировке 30 мг/кг. Препарат разработан с целью патогенетической коррекции нарушений мужской репродуктивной функции (Галимов Ш.Н., Мухамедзянов Р.М., 2005). Антиокислительную активность препарата оценивали в модельных системах, генерирующих АФК и ПОЛ, при добавлении «ПропоФлана» к липидам, полученным из куриного желтка, содержащего липопротеиновые комплексы, сходные с липидами крови (Фархутдинов Р.Р., Тевдорадзе С.И., 2005).

Контрольной группе животных (10 самцов) вводили в желудок взамен «Совтола» физиологический раствор (0,9% раствор хлорида натрия).

Проводили оценку оплодотворяющей способности самцов крыс, для чего их подсаживали к интактным самкам (по 2 самки на самца). Вычисляли 3 основных показателя, дающих количественную характеристику гонадотропных эффектов токсиканта: индекс фертильности = (число беременных самок/общее число самок) х100; индекс гестации = (число родивших самок/число беременных самок) х100; индекс плодовитости = число родившихся крысят/число родивших самок (Куценко С.А., 2004).

Оценивали состояние сперматогенеза, жизнеспособность сперматозоидов, интенсивность свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности. Выполнялась дифференциальная окраска сперматозоидов с последующей оценкой строгой морфологии, исследовалось содержание ТБК-активных продуктов в семенниках животных (Владимиров Ю.А., 1972).

Исследование процессов свободнорадикального окисления до и после криоконсервации спермы было проведено на материале, полученном от племенных быков-производителей Уфимского племенного хозяйства. Исследовали люминолзависимую и Fe²⁺-индуцированную хемилюминесценцию по Владимирову Ю.А. (1989).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась на персональном компьютере с применением программного обеспечения Microsoft Excel (Microsoft corp., 2003), Statistica Inc Ver. 7 (StatSoft, STATISTICA for Windows). Степень взаимосвязи между признаками оценивали по Пирсону. В качестве описательных статистик использованы средняя (М) и ошибка средней (m). Исследуемые группы сравнивались при помощи t-критерия Стьюдента для независимых переменных после выполнения следующих условий: нормальность распределения (тест Лильефорса) и равенства дисперсий обеих выборок.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ параметров семенной жидкости у мужчин с бесплодием

В предварительном исследовании были представлены жители всех 54 районов Республики Башкортостан. За 2002 год были проанализированы данные 1341 мужчины, что составило 33,5% от общего количества обследованных пациентов в данном исследовании, за 2003 год - 977 (24,4%), за 2004 год – 1269 (31,7%), за 2005 год - 413 (10,3%). Основные показатели спермограмм по годам наблюдений представлены в таблице 2.

Таблица 2

Параметры семенной жидкости у мужчин за 2002-2005 годы (n=4000)

Показатели эякулята		Год (число наблюдений)
Показатели эякулята		2002 (n=1341)	2003 (n=977)	2004 (n=1269)	2005 (n=413)
Объем эякулята, мл		3,3±0,04	3,2±0,05*	3,3±0,04	3,3±0,08
рН		7,6±0,01	7,7±0,01***	7,2±0,01***	7,4±0,01***
Концентрация сперматозоидов, млн/мл		32,7±0,80	28,5±0,83***	58,8±1,57***	63,9±2,83
Подвижность сперматозоидов, %	категории «А»	29,3±0,53	22,4±0,48***	27,7±0,57***	26,8±0,92
	категории «B»	12,8±0,29	14,4±0,31***	9,9±0,18***	10,5±0,29
	категории «C»	14,4±0,35	21,6±0,41***	18,5±0,36***	21,5±0,65***
	категории «D»	36,3±0,55	31,6±0,55***	36,3±0,47***	33,2±0,79***
Морфологически полноценные формы, %		40,8±0,51	52,2±0,73***	50,9±0,60	40,8±1,73***
Клетки сперматогенеза, млн/мл		0,33±0,01	0,6±0,03***	0,1±0,01***	0,15±0,03
Лейкоциты, млн/мл		0,2±0,01	0,2±0,02**	0,2±0,02	0,3±0,03

Примечание: здесь и далее * - р<0,05; ** - р<0,01; ***- р<0,001 в сравнении с предыдущим годом

При анализе данных о количестве, морфологии и подвижности мужских половых клеток за 2002-2005 годы в Республике Башкортостан у пациентов, состоящих в бесплодном браке, было отмечено возрастание концентрации сперматозоидов при ухудшении подвижности (за счет уменьшения фракции «В»). Из 4000 обследованных мужчин с бесплодием у 2810 человек была выявлена патозооспермия, что составило 70,25% (рис.1). Примечательным является тот факт, что выявляемый уровень азооспермии в среднем составляет 8%, это соответствует литературным данным.

Прирост патозооспермии обусловлен, прежде всего, увеличением количества субфертильных эякулятов, отклонения в которых близки к нормативным значениям, о чем свидетельствуют уровни подвижности и морфологических характеристик сперматозоидов. Это наводит на мысль о возможной обратимости данных изменений.

Рис.1. Уровни общей патоспермии и азооспермии за период наблюдения

Для определения характера распределения патоспермии по районам Республики Башкортостан проведен подробный анализ всех случаев. С целью выявления причин патозооспермии были проанализированы заключительные диагнозы по данным амбулаторных карт (рис.2).

Рис. 2. Причины бесплодия по заключительным диагнозам

Из представленных данных обращает на себя очень высокий процент идиопатического бесплодия (идиопатическая олигозооспермия, астенозооспермия, тератозооспермия - 45,3%) у мужчин с патоспермией, что можно объяснить или несовершенством диагностического поиска, или имеющимися экзогенными воздействиями, вызывающими изолированную патоспермию. Исходя из этого, проведена оценка взаимосвязи развития патологии детородной функции у мужчин с экологической обстановкой в районах Республики Башкортостан.

В конце 80-х годов прошлого века Башкортостан входил в пятерку регионов России, лидирующих по выбросам загрязняющих веществ в атмосферу и в десятку - по сбросам загрязненных стоков. Сегодня республика по выбросам в атмосферу и сбросам загрязняющих веществ находится во втором десятке среди субъектов Федерации. Все районы РБ были условно разделены на относительно «благополучные» (с удельным выбросом загрязняющих веществ, приходящимся на единицу площади от 0 до 2000 кг/га (удовлетворительный), 2000-4000 (напряженный)), и на относительно «неблагополучные» (где аналогичный показатель колеблется в диапазоне 4000-8000 кг/га (критический), 6000-8000 кг/га (экологически чрезвычайная ситуация), 8000 и более кг/га (экологическое бедствие)). Параметры приведены из Государственного доклада «О состоянии окружающей природной среды Республики Башкортостан в 2000 году», в последующих ежегодных докладах (2001-2004гг.) эти данные не анализировались.

По данным многих авторов обследование различных групп населения в регионах, подверженных и не подверженных воздействию токсинов и веществ, загрязняющих окружающую среду, выявило стойкую тенденцию к снижению концентрации сперматозоидов (Aitken R., Sawyer D., 2003). В табл. 3 представлены данные об удельном выбросе загрязняющих веществ по районам РБ наряду с уровнем патозооспермии. Большинство районов РБ относится к относительно «благополучной» зоне – 35 районов (64,8%). Сравнение показателей патологии репродуктивной функции мужчин с массой выбрасываемых загрязняющих веществ, приходящейся на единицу площади, не выявило корреляционной связи ни по уровню патозооспермии (R = - 0,0283, p = 0,84), ни по уровню астенозооспермии (R = - 0,0559, p = 0,69), ни по уровню олигозооспермии (R = 0,2699, p = 0,05), ни по уровню тератозооспермии (R = 0,0329, p = 0,81).

Таблица 3

Частота встречаемости патозооспермии и масса выбрасываемых загрязняющих веществ, приходящаяся на единицу площади, в Республике Башкортостан (n=2810)

№	Районы РБ	Уровень патозоо- спермии	Удельный выброс (кг/га)	№	Районы РБ	Уровень патозоо- спермии	Удельный выброс (кг/га)
1	Абзелиловски	64,0	2000-4000	28	Ишимбайский	75,3	0-2000 4,1
2	Альшеевский	63,4	6000-8000	29	Калтасинский	54,5	4000-6000 4,5
3	Архангельский	80,0	0-2000	30	Караидельский	80,0	0-2000 8,0
4	Аскинский	77,3	0-2000	31	Кармаскалинский	66,0	8000 и > 14,9
5	Аургазинский	74,4	0-2000	32	Кигинский	77,8	0-2000 11,1
6	Баймакский	76,4	0-2000	33	Краснокамский	59,8	8000 и > 5,6
7	Бакалинский	78,1	4000-6000	34	Кугарчинский	72,2	0-2000 0,0
8	Балтачевский	53,8	2000-4000	35	Кушнаренковский	77,3	6000-8000 9,1
9	Белебеевский	75,3	2000-4000	36	Куюргазинский	76,9	8000 и > 11,5
10	Белокатайский	50,0	2000-4000	37	Мелеузовский	72,2	2000-4000 0,0
11	Белорецкий	61,9	0-2000	38	Мечетлинский	60,0	0-2000 0,0
12	Бижбулякский	78,9	2000-4000	39	Мишкинский	64,7	0-2000 5,9
13	Бирский	67,3	4000-6000	40	Миякинский	74,3	0-2000 2,9
14	Благоварский	66,7	6000-8000	41	Нуримановский	75,0	0-2000 10,0
15	Благовещенский	67,5	8000 и >	42	Салаватский	70,4	2000-4000 11,1
16	Буздякский	77,8	8000 и >	43	Стерлибашев	46,7	0-2000 0,0
17	Бураевский	65,0	0-2000	44	Стерлитамакский	78,6	8000 и > 10,7
18	Бурзянский	89,5	0-2000	45	Татышлинский	75,0	0-2000 0,0
19	Гафурийский	72,0	2000-4000	46	Туймазинский	72,6	4000-6000 4,8
20	Давлекановский	71,8	8000 и >	47	Уфимский	68,4	8000 и > 7,4
21	Дуванский	81,0	2000-4000	48	Учалинский	62,5	0-2000 5,0
22	Дюртюлинский	72,0	8000 и >	49	Федоровский	60,0	0-2000
23	Ермекеевский	91,7	0-2000	50	Хайбуллинский	61,1	0-2000 22,2
24	Зианчуринский	68,4	0-2000	51	Чекмагушевский	90,9	2000-4000 15,2
25	Зилаирский	80,0	0-2000	52	Чишминский	63,8	6000-8000 14,9
26	Иглинский	76,5	2000-4000	53	Шаранский	77,8	8000 и > 5,6
27	Илишевский	94,7	2000-4000	54	Янаульский	79,4	8000 и > 8,8

С целью определения возможных репротоксических воздействий на мужское население Башкортостана было проведено дальнейшее исследование (оценка влияния на сперматогенез стойких органических загрязнителей) с учетом особенностей региона. Содержание диоксинов и диоксиноподобных соединений в пересчете на токсические эквиваленты (ТЭ/TEQ ВОЗ) в суммарных пробах спермы мужчин, проживающих в индустриальных городах, находилось в пределах от 56,7 до 823,7 пг/г липидов и составило в среднем 262,4 пг/г(данные представлены в таблице 4), при соответствующих уровнях в крови тех же мужчин от 67 до 324 пг/г.

Blog

При мужской инфертильности

Анализ результатов, для оценки фертильности