Состав и структура белков

Вид материала

Документы

Содержание Первичной структурой Неупорядоченная структура Четвертичная структура Физико-химические свойства белков Молекулярная масса белков. Оптические свойства. Амфотерность белков. Подвижность в электрическом поле. Растворимость белков. Денатурация белков. Цветные реакции на белки. Классификация белков Классификация, основанная на биологической функции белков. Классификация, основанная на растворимости белков В зависимости от состава белки разделяются на два основных класса: простые и сложные белки Сложные белки или протеиды Лабораторные работы по теме «белки» Приготовление раствора белка. Лабораторная работа 2. Приготовление раствора белка (с добавлением хлористого натрия). ... Полное содержание

Подобный материал:

• Контрольный тест 30 вопросов по теме: «Химический состав организмов», «Строение, структура, 25.96kb.
• Тема обмен белков. Вопросы лекции, 90.92kb.
• Биосинтез белков Интегрированный урок в 10-м классе(химия и биология). Цель урока, 27.63kb.
• В строении белков одно об­щее: они состоят из аминокислот. Все­го в состав молекул, 1313.07kb.
• Учебно-методический комплекс (структура, состав, учебно-методическая карта) для студентов, 2545.2kb.
• Высокомолекулярные азотосодержащие органические вещества, молекулы которых построены, 51.51kb.
• Тема: Аминокислоты, пептиды, белки, 124.2kb.
• Конспект по биологии в 10 «Б» классе по теме: Биосинтез белков, 89.67kb.
• Примерная структура выполнения отчёта по преддипломной производственной практике, 12.34kb.
• Тип урока: урок-лекция. Вопросы лекции: Белки высшая ступень развития вещества в природе, 34.46kb.

СОСТАВ И СТРУКТУРА БЕЛКОВ

Среди органических соединений, входящих в состав живой материи, важную роль играют белки.

Белки входят в состав всех клеток и тканей живых орга­низмов. Около 50% сухого веса клетки приходится на белки. Однако, не количественное содержание белка, а многообразие функций, которые выполняют белки, говорит о важности этого класса органических соединений в живом мире. Белки выполняют структурную, ферментативную, сократительную, защитную, гормональную, транспортную, питательную функции.

Это многообразие функций обеспечивается многообразием аминокислотных радикалов, входящих в состав белка, и, как следствие, способностью белковых молекул вступать в разнообразные физико-химические взаимодействия как между собой, так и с другими соединениями. Кроме того, гигантские молекулы белков отличаются неисчерпаемым разнообразием структуры при строгой ее специфичности у данного, конкретного белка.

Белки характеризуются определенным элементарным составом. Химический анализ показал наличие во всех белках углерода (50-55%), кислорода (21-24%), азота (15-18%), водорода (6-7%), серы (0,3-2,5%). В составе отдельных белков обнаружены также фосфор, йод, железо, медь и некоторые другие макро- и микроэлемен­ты, в различных, часто очень малых количествах.

По химическому составу белки представляют собой полимеры, построенные из остатков -аминокислот.

При изучении структуры белков было установлено, что все они построены по единому принципу и имеют четыре уровня организации: первичную, вторичную, третичную, а некоторые белки и четвертичную структуры.

Первичной структурой называют последовательность в расположении аминокислотных остатков в белковой молекуле. Остатки аминокислот в белках соеди­нены между собой пептидной связью, которая образуется между их амино- и карбоксильными группами.



По своей природе пептидная связь - это амидная связь, однако, «одинарная» CN-связь в пептидах примерно на 40% имеет характер двойной связи, а «двойная» СО-связь приблизительно на 40% является одинарной, поэтому пептидная связь является «полуторной». Это обстоятельство влечет за собой два важных следствия: 1) иминогруппа -NH-пептидной связи не обладает заметно выраженной способностью отщеплять или присоединять протон в интервале рН от 0 до 14; 2) свободное вращение вокруг CN-связи в пептидах отсутствует (т.е. связь планарна), и это ее свойство имеет важное значение для процесса формирования трехмерной структуры полипептидных цепей.

Зная первичную структуру белка, можно написать его химическую формулу. Именно первичная структура предопределяет образование вторичной, третичной и четвертичной структур, т.е. конформацию белковой молекулы.

Под вторичной структурой понимают пространственное расположение отдельных участков полипептидной цепи без учета типа и конформации боковых радикалов аминокислот. Она поддерживается водородными связями между карбонильной группой одной пептидной связи и группой –NH- другой пептидной связи соседних витков или участков полипептидных цепей. Различают несколько типов структуры белков: -спираль, -форму (структуру складчатого слоя) или неупорядоченную структуру.

-спираль возникает за счет внутрицепочечного образования водородных связей в разных участках одной и той же полипептидной цепи. Спираль является правозакрученной, поскольку все природные аминокислоты имеют L-конфигурацию. -спираль характерна для ферментов и всех глобулярных белков, однако, как правило, только часть полипептидной цепи спирализована (например, цепь миоглобина спирализована лишь на 75%).

-форма характерна для межцепочечного связывания. В -форме полипептидные цепи почти полностью вытянуты и расположены в виде слоев, изгибы которых похожи на складки ткани или бумаги. При этом водородные связи возникают между соседними участками одной или нескольких полипептидных цепей. Структура -складчатого слоя встречается в белках типа фиброина шелка или кератина волос.

Неупорядоченная структура характерна только для отдельных фрагментов цепи, которые чаще всего появляются между спирализованными и складчатыми участками белковой молекулы.

Под третичной структурой понимают характерное пространственное расположение полипептидной цепи в целом, которое возникает за счет типа и конформации боковых радикалов. Силами, стабилизирующими третичную структуру, являются: гидрофобное взаимодействие, которое возникает между неполярными радикалами аминокислот; водородные связи - между радикалами полярных аминокислот; дисульфидные мостики - между остатками цистеина; ионные взаимодействия - между радикалами основных и кислых аминокислот.

Четвертичная структура характерна для белков, состоящих из нескольких полипептидных цепей. Такие молекулы называют мультимерами, а составляющие их элементы – полипептидные цепи – протомерами или субъединицами. Под четвертичной структурой подразумевают способ расположения в пространстве взаимодействующих между собой полипептидных цепей мультимерного белка. Поддерживают эту структуру те же взаимодействия, что и при образовании третичной структуры, только возникают они в четвертичной структуре между субъединицами белковой молекулы.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Размер белковых молекул лежит в пределах 1 мкм до 1 нм и, следовательно, они яв­ляются коллоидными частицами, которые в воде образуют коллоидные растворы. Эти растворы характеризуются высокой вязкостью, низким значением осмотического давления, способностью рассеивать лучи видимого света, не проходят сквозь полупроницаемые мембраны, образуют гели и способны к набуханию. Рассмотрим свойства белков более подробно.

1. Молекулярная масса белков.
   

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и тысячи аминокислот, поэтому они имеют большие значения молекулярной массы (от 6 000 до 1 000 000 и выше). Для определения молекулярной массы используют различные физико-химические методы: седиментационный, осмометрический, гель-фильтрационный, вискозометрический, ультрафильтрационный, электрофоретический, оптический.

2. Оптические свойства.
   

Белки являются оптически активными веществами, так как состоят из оптически активных аминокислот. Они способны вращать плоскость поляризации света, рассеивать световые лучи видимой части спектра и поглощать ультрафиолетовые лучи. Эти свойства используют при коли­чественном определении белков, определении их конформации, молекулярной массы.

3. Белки способны адсорбировать на своей поверхности низкомолекулярные органические соединения и ионы (витамины, ионы железа, меди и др.), а иногда и захватывать их внутрь молекулы. С этим свойством белков связана их транспортная функция в организме.
   
4. Амфотерность белков.
   

Белки, также как и аминокислоты, являются амфотерными электролитами благодаря одновременному присутствию -СООН и –NH₂ групп. Диссоциация этих групп приводит к заряжению белковой молекулы. В зависимости от преобладания в молекуле белка моноаминодикарбоновых (глутаминовой, аспарагиновой) или диаминомонокарбоновых аминокислот (лизина, аргинина) белки в водных растворах обладают свойствами слабых кислот или слабых оснований, соответственно. Большинство природных белков имеют кислый характер (казеин, желатина, альбумины и др.) и в водном растворе несут отрицательный заряд, основные белки (гистоны, протамины) в водном растворе заряжены положительно. Свойство амфотерности лежит в основе буферных свойств белков и их участии в регуляции рН крови.

5. Подвижность в электрическом поле.
   

В связи с тем, что белки являются заряженными частицами, они двигаются в электрическом поле к катоду или аноду в зависимости от величины их суммарного заряда. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от величины рН среды. Изменяя значение рН среды, можно добиться такого состояния, когда количество положительно и отрицательно заряженных групп будет одинаково, заряд белка при этом равен нулю, и молекула белка не будет перемещаться в электрическом поле. Такое значение рН среды определяется как изоэлектрическая точка (рН_ИЭТ). Значение изоэлектрической точки зависит от аминокислотного состава и специфично для каждого белка, например, для казеина рН_ИЭТ = 4,7, для яичного альбумина – 4,8, яичного глобулина – 6,6, желатина – 4,9, зеина (кукурузного белка) – 6,2. Чем дальше будет отстоять значение рН среды от рН_ИЭТ, тем большим суммарным зарядом будут обладать молекулы белка и с большей скоростью двигаться в электрическом поле.

Это свойство положено в основу электрофоретического метода, используемого для идентификации и фракционирования белков, а также при исследовании физико-химических свойств белков.

6. Растворимость белков.
   

Белки сильно различаются по своей растворимости в водных системах. При растворении белков в воде вокруг их молекул образуется гидратная оболочка, которая наряду с зарядом белковых частиц является фактором устойчивости белковых растворов.

На растворимость белков существенное влияние оказывают следующие факторы: а) рН, б) ионная сила, в) диэлектрические свойства растворителя и г) температура.

а) Влияние рН раствора на растворимость белков.

При значении рН раствора, совпадающем с величиной рН_ИЭТ, белки будут обладают наименьшей растворимостью. Объясняется это тем, что в изоэлектрической точке суммарный заряд молекулы белка равен нулю, и, следовательно, между соседними молекулами белка отсутствует электростатическое отталкивание. При значениях рН, отличных от значений рН_ИЭТ, молекулы белка имеют суммарный заряд одного знака, вследствие чего они отталкиваются друг от друга. На этом свойстве основан метод изоэлектрического осаждения белков.

б) Влияние ионной силы на растворимость белков.

При добавлении к растворам белка солей небольших концентраций растворимость многих бел­ков повышается. Этот эффект зависит также от величины зарядов каждого из ионов, присутствующих в растворе: соли, содержащие двухзарядные ионы значительно эффективнее повы­шают растворимость белков, чем соли, содержащие однозарядные ионы.

При значительном повышении кон­центрации солей раство­римость белков начинает опять пони­жаться, и при очень высоких концентра­циях соли белок может полностью выпасть в осадок (если рН среды совпадает с рН_ИЭТ). Это явление называет­ся высаливанием.

Оба описанных эффекта, т.е. повы­шение растворимости белков при низких концентрациях соли и понижение при высоких концентрациях, широко исполь­зуются для разделения белковых фракций, очистки белков, получения их в кристаллическом виде.

в) Влияние растворителя на растворимость белков.

Добавление смешивающихся с во­дой нейтральных органических раство­рителей уменьшает растворимость большинства белков в воде до такой степени, что они могут выпадать в осадок (если при этом рН раствора совпадает с рН_ИЭТ). Например, этанол или ацетон, являясь водоотнимающими веществами, понижают степень гидра­тации белков и уменьшают их растворимость. Кроме того, растворимость белков зависит от диэлектрической постоянной среды (при постоянных значениях рН и ионной силы). С уменьшением диэлектрической постоянной растворителя силы притяжения между двумя молекулами белка возрастают, что способствует агре­гации белков, т.е. снижает их растворимость. Эти закономерности используют для разделения белковых молекул.

г) Влияние температуры на растворимость белков.

В сравнительно узком интервале температур, приблизительно от 0 до 40°С, растворимость большинства белков возрастает с повышением температуры. При температурах, превышающих 40—50°С, большинство белков утрачивает стабильность, начинается их денатурация, сопровождающаяся обычно резким снижением растворимости.

7. Денатурация белков.
   

В настоящее время установлено, что для каждого белка характерна только одна пространственная структура, в которой он стабилен и проявляет биологическую активность. Эта структура носит название нативной конформации белка. Изменение нативной конформации белка, сопровождающееся потерей характерных для него свойств: растворимости, биологической активности, электрофоретической подвижности и др., называется денатурацией. Денатурация, как правило, затрагивает четвертичную, третичную и частично вторичную структуры бел­ковой молекулы и не сопровождается какими-либо изменениями пер­вичной структуры. Денатурацию могут вызывать различные физические и химические факторы: высокая температура, механические воздействия, действие ионизирующих излучений, обработка ультразвуком, действие органическими растворителями, растворами кислот, щелочей, солей тяжелых металлов.

Примером тепловой денатурации может служить «свертывание» белка при варке яиц. Денатурация белков происходит в желудке, где имеется сильнокислая среда и это способствует расщеплению белков протеолитическими ферментами. По мере старения организма происходит постепенная, хотя и чрезвычайно медленная, денатурация белков и снижение их гидрофильности.

При опре­деленных условиях денатурированный белок можно частично или пол­ностью вернуть к исходному нативному состоянию. Такой процесс называют ренатурацией, а белок – ренатурированным. Этот процесс происходит самопроизвольно при значениях рН и температуры, обеспечивающих стабильность нативной формы, и не требует подвода энергии извне. Ренатурацию обычно проводят в мягких условиях, медленно снимая воздействие.

8. Цветные реакции на белки.
   

а) Качественная реакция на белок – биуретовая реакция, которая обусловлена наличием пептидных связей в белковых молекулах. В щелочной среде белки образуют с ионами меди растворимое комплексное соединение сине-фиолетового цвета.

б) Реакции, которые обусловлены аминокислотным составом белков:

- универсальная (нингидриновая), которую дают все аминокислоты и, следовательно, белок любого состава;

- специфические, связанные с наличием определенных аминокислотных радикалов в белке (ксантопротеиновая, реакции Миллона, Адамкевича, Сакагучи, Паули, Фоля).

Цветные реакции используются для качественного и количественного определения белков и аминокислот, которые широко используются в биохимических анализах.

КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ

Несмотря на то, что белки являются наиболее изученным классом биоорганических соединений, до сих пор не создано единой номенклатуры и классификации белков.

В зависимости от положенного в основу признака различают несколько видов классификации белков:

I. Классификация, основанная на биологической функции белков.

II.Классификация, основанная на конформации белков. В зависимости от формы частиц белки делят на фибриллярные (волокнистые) и глобулярные (корпускулярные).

Фибриллярные белки - это устойчивые, нерастворимые в воде и в разбавленных солевых рас­творах вещества. Располагаясь параллельно друг другу вдоль одной оси, полипептидные цепи образуют длинные волокна (фибриллы) или слои с конформацией -структуры. Примеры фибриллярных белков: коллаген сухожилий и костной ткани, кератин волос, роговых образований, кожи, ногтей и перьев, эластин упругой соединитель­ной ткани.

Глобу­лярные белки – это соединения, полипептидные цепи которых плотно свернуты в компактные сферические или глобулярные структуры с конформацией -спирали. Большинство глобу­лярных белков растворимо в водных растворах и легко диффундирует. К ним относятся почти все известные в настоящее время ферменты, а также антитела, некоторые гормоны и многие белки, выполняющие транспортную функцию, например, сывороточный альбумин и гемо­глобин.

Некоторые белки принадлежат к промежуточному типу. Подобно фибриллярным белкам, они состоят из длинных, палочковидных структур, и в то же время они, как глобулярные белки, растворимы в водных солевых рас­творах. К таким белкам относятся: миозин - структурный элемент мышц, фибриноген - предшественник фибрина, участвующего в свертывании крови.

III. Классификация, основанная на растворимости белков.

По отношению к растворимости белков в различных растворителях среди белков различают альбумины, глобулины, прола­мины, протеиноиды.

К альбуминам относят белки, хорошо растворяющиеся в воде и солевых растворах умеренных концентраций. При пере­ходе к концентрированным растворам, вплоть до полностью насыщенных, альбумины высаливаются. Примерами их могут служить: яичный альбумин, сывороточный альбумин, альбумин мышечной ткани, молочный альбумин.

К глобулинам принадлежат белки, не растворимые в воде и соле­вых растворах умеренных концентраций, но растворяющиеся в очень слабых растворах солей. Характерным признаком глобулинов считают их полное осаждение при полунасыщении раствора. Примеры глобулинов: фибриноген, яичный глобулин, сывороточный глобулин, глобулин мышечной ткани.

Проламины представляют группу белков, растворимых в 60-80%-ном водном растворе этилового спирта. Представителем этих белков может служить глиадин, составляющий главную часть клейковины; находятся они в зернах различных хлебных злаков.

К протеиноидам относят белки, не растворяющиеся в обычных растворителях белков: воде, солевых и водно-спиртовых смесях, однако, хорошо растворящиеся в специ­фических реагентах. Так, например, фиброин шелка растворяется в дихлоруксусной кислоте, безводной плавиковой кислоте, в концентрирован­ном водном растворе роданида лития или бромида калия. К протеиноидам относятся почти все фибриллярные белки.

IV. В зависимости от состава белки разделяются на два основных класса: простые и сложные белки.

Простые белки или протеины состоят только из белковой части и гидролизуются до аминокислот. К ним относятся альбу­мины и глобулины, а также протамины и гистоны - белки основ­ного характера, которые содержат много лизина и аргинина.

Сложные белки или протеиды кроме белковой час­ти содержат небелковую группу, которую называют простетической.

Сложные белки в зависимости от химической природы их простетической группы классифицируются на нуклеопротеиды, гликопротеиды, липопротеиды, фосфопротеиды, хромопротеиды.

Небелковая часть нуклеопротеидов состоит из молекул нуклеиновых кислот – дезоксирибонуклеиновой (ДНК) и рибонуклеиновой (РНК), белковая часть представлена гистонами и протаминами. Нуклеопротеиды участвуют в процессах деления клеток и передачи наследственных признаков, в процессах биосинтеза белка. Они входят в состав любой клетки, являются обязательными компонентами ядра, цитоплазмы. Также нуклеопротеидами по своей природе являются вирусы.

Гликопротеиды представляют собой сложные белки, простетическая группа кото­рых представлена производными углеводов. Гликопротеиды входят в состав клеточных мембран, участвуют в транспорте различ­ных веществ, в процессах свертывания крови, являются составными частями слизи и секретов желудочно-кишечного тракта.

Липопротеиды являются сложными белками, простетическая группа которых образована липидами. Это сферические частицы небольшого размера (150-200 нм), наружная оболочка которых образована белками, а внут­ренняя часть - липидами и их производными. Основная функция липоротеидов - осуществлять транс­порт по крови липидов.

Фосфопротеиды имеют в качестве небелкового компонента фосфорную кислоту. Эти белки входят в состав костной и нервной ткани, выполняют питательную функцию. Представителями данных белков являются казеин молока, вителлин (белок желтков яиц), ихтулин (белок икры рыб).

Хромопротеиды являются сложными белками, простетическая группа которых представлена окрашенными соединениями. К хромопротеидам относятся гемоглобин, миоглобин, ряд ферментов (каталаза, пероксидазы, цитохромы), а также хлоро­филл.

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ «БЕЛКИ»

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 1.

ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ.


Присутствие белка в биологических объектах и водных растворах можно определить методами качественного анализа. Методы качественного анализа белков основаны на двух типах реакций:

1) по пептидным связям белковой молекулы;

2) по аминокислотным радикалам.

Примером реакции первого типа является качественная реакция на пептидную связь – биуретовая реакция, второго – многочисленные цветные реакции на аминокислоты (нингидриновая, ксантопротеиновая, реакции Миллона, Адамкевича, Сакагучи, Паули, Фоля).

1. Биуретовая реакция.

Биуретовая реакция обусловлена наличием пептидных связей, однако, эту реакцию способны давать вещества, содержащие не менее двух пептидных связей. При добавлении к сильно щелочному раствору белка или продукту его неполного гидролиза ионов меди (II), образуются комплексные соединения, окрашенные в красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет.

Интенсивность окраски зависит от количества пептидных связей, поэтому биуретовая реакция используется для количественного определения белка в биологических объектах.

Биуретовую реакцию дают также некоторые аминокислоты (гистидин, треонин, серин, аспарагин).

Комплексной медно-натриевой соли пептидов приписывают следующее строение:




Реактивы: водный раствор яичного белка, 10%-ный раствор гидроксида натрия, 1%-ный раствор сульфата меди (II).

Приготовление раствора белка.

Белок одного куриного яйца отделяют от желтка, растворяют в 15-ти кратном объеме дистиллированной воды. Раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3-4 слоя. Хранят в холодильнике.

Выполнение работы. К 5 каплям 1%-ного раствора белка прибавляют 5 капель 10%-ного раствора гидроксида натрия и 1-2 капли 1%-ного раствора сульфата меди и перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовый цвет. В случае избытка сульфата меди образуется синий осадок гидроксида меди (II), который маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.

2. Реакции по аминокислотным радикалам - нингидриновая и ксантопротеиновая реакции, а также реакции Миллона, Фоля, Сакагучи, Адамкевича, Паули рассмотрены в методической разработке «Белковые аминокислоты».


Контрольные вопросы.

1. С помощью какой качественной реакции можно обнаружить пептидную связь в белках?
   
2. Охарактеризуйте цветные реакции по аминокислотным радикалам.
   
3. В чем заключается практическое значение цветных реакций на белки?
   
4. На чем основано разнообразие функций, выполняемых белками в живых организмах?
   

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 2.

РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ.


Большинство белков относятся к высокомолекулярным соединениям, которые хорошо растворяются в воде. Растворение белков в воде связано с гидратацией его молекул и образованием вокруг частиц белка гидратной оболочки.

Любые физические и химические факторы, нарушающие гидратацию молекул белка и нейтрализующие их заряд, приводят к понижению растворимости белка и способствуют выпадению его в осадок.

1. Осаждение белков при нагревании.

Воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в результате которой нарушается вторичная, третичная и четвертичная структуры белка. Свертывание большинства белков начинается при температуре 50-55⁰С. При кратковременном нагревании денатурация может и не произойти или проявится в слабой степени, дальнейшее же повышение температуры ведет к быстрому свертыванию белка.

На скорость и интенсивность процесса тепловой денатурации оказывают большое влияние рН раствора и присутствие электролитов. Быстро и наиболее полно белки свертываются в изоэлектрической точке. В сильно кислых и в сильно щелочных растворах осаждение белков при кипячении практически не происходит, так как молекулы белка приобретают положительный или отрицательный заряды соответственно.

Реактивы: водный раствор яичного белка, 1 и 10%-ные растворы уксусной кислоты, 10%-ный раствор гидроксида натрия, насыщенный раствор хлорида натрия.

Выполнение работы. В пять пробирок наливают по 1 мл раствора белка. Белок в первой пробирке нагревают до кипения, при этом раствор мутнеет, но осадок не выпадает.

К раствору белка во второй пробирке добавляют одну каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают, при этом выпадает хлопьевидный осадок белка.

К раствору белка в третьей пробирке прибавляют 5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения, при этом осадок не образуется.

В четвертую пробирку прибавляют 5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и 6 капель насыщенного раствора хлорида натрия, нагревают до кипения - белок выпадает в осадок.

В пятую пробирку добавляют 5 капель 10%-ного раствора гидроксида натрия и нагревают до кипения, при этом осадок не выпадает.

Объяснить наблюдаемые явления, если известно, что в состав яичного белка входят: яичный альбумин с рН_ИЭТ = 4,8 и яичный глобулин с рН_ИЭТ = 6,6.


2. Осаждение белков органическими растворителями.

Органические растворители (спирт, эфир, ацетон и др.) разрушают гидратную оболочку белка, что приводит к понижению его устойчивости и выпадению белка в осадок.

Осаждение белков этанолом обратимо при кратковременном воздействии реагента и без нагревания. Длительный контакт белка со спиртом приводит к необратимой денатурации.

Реактивы: раствор яичного белка, этиловый спирт, ацетон.

Выполнение работы. К 1 мл раствора белка прибавляют 2 мл этилового спирта и взбалтывают. Выпадает осадок белка, который вновь растворяется при разбавлении водой.

К 1 мл того же раствора белка прибавляют 2 мл ацетона и энергично встряхивают. Раствор белка мутнеет.

3. Осаждение белков минеральными кислотами.

Концентрированные минеральные кислоты (азотная, серная, соляная) вызывают дегидратацию белковых частиц и нейтрализацию их заряда, при этом возможно образование комплексных соединений. Все это приводит к необратимой денатурации белка. Осадок белка, полученный под действием кислот, в избытке серной и соляной кислоты растворяется, но не растворяется в избытке азотной кислоты.

Реактивы: раствор яичного белка, концентрированные растворы соляной, серной и азотной кислот.

Выполнение работы. В три пробирки наливают по 1 мл раствора кислот: в первую – соляной, во вторую - серной, в третью – азотной. Осторожно по стенке пробирки, чтобы жидкости не смешивались, приливают равный объем раствора белка. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого кольца. Пробирки осторожно встряхивают, добавляют избыток кислот и наблюдают растворение осадков в первых двух пробирках.

4. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Белки осаждаются солями свинца, ртути, серебра, меди и других тяжелых металлов. В этом случае денатурация белка вызывается адсорбцией ионов тяжелых металлов на поверхности белковых молекул с образованием нерастворимых комплексов.

Избыток некоторых солей (сульфата меди, ацетата свинца и других) ведет к растворению осадка (пептизации).

Реактивы: раствор яичного белка, 1%-ный раствор сульфата меди, 5%-ный раствор ацетата свинца, 1%-ный раствор нитрата серебра.

Выполнение работы. В три пробирки наливают по 1 мл раствора яичного белка и по каплям добавляют растворы солей: в первую – сульфата меди, во вторую – ацетата свинца, в третью – нитрата серебра до выпадения осадков. Затем прибавляют избыток солей и наблюдают растворение осадков в первых двух пробирках. Осадок, образованный нитратом серебра, не растворяется в избытке соли.

5. Осаждение белков нейтральными солями (высаливание).

Выпадение белков в осадок при действии на них растворов нейтральных солей аммония, щелочных и щелочноземельных металлов называется высаливанием. Этот процесс основан на дегидратации белков и нейтрализации зарядов белковых частиц адсорбирующимися на них ионами соли. При этом белковые растворы теряют устойчивость, частицы белка слипаются и выпадают в осадок.

Изменяя концентрации солей, можно выделить различные белковые фракции. Так, в случае высаливания хлоридом натрия, глобулины (pH_ИЭТ = 6.6) осаждаются насыщенным раствором соли, а для осаждения альбуминов (pH_ИЭТ = 4.8) необходимо добавить 1%-ный раствор уксусной кислоты для нейтрализации заряда белка.

Реактивы: раствор яичного белка с хлоридом натрия, кристаллический хлорид натрия (тонко растертый порошок в виде пудры), 1%-ный раствор уксусной кислоты, 1%-ный раствор гидроксида натрия, 1%-ный раствор сульфата меди.

Приготовление раствора белка (с добавлением хлористого натрия).

Белки трех куриных яиц отделяют от желтков, растворяют в 7 мл дистиллированной воды и приливают 3 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3-4 слоя. Хранят в холодильнике.

Выполнение работы. В пробирку наливают 3 мл раствора яичного белка и добавляют до получения насыщенного раствора порошок хлорида натрия. Через 5-6 минут в пробирке наблюдается выпадение осадка глобулинов. Альбумины из нейтральных растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов не осаждаются. Содержимое пробирки отфильтровывают через бумажный фильтр.

В фильтрате остаются альбумины, для их осаждения раствор подкисляют 1%-ным раствором уксусной кислоты. Появившийся осадок отфильтровывают, а в фильтрате с помощью биуретовой реакции доказывают отсутствие белка.

Контрольные вопросы.

1. Дайте понятие нативного белка.
   
2. Какие факторы влияют на растворимость белков?
   
3. Что происходит при обратимом и необратимом осаждении белков?
   
4. Какими реактивами вызывается необратимое осаждение белков?
   
5. Какие органические растворители вызывают осаждение белков из растворов и почему?
   
6. Как влияет изоэлектрическое состояние на осаждение белков при нагревании?
   
7. Какие факторы вызывают денатурацию белков и почему?
   
8. Почему при тепловой денатурации яичного белка в сильно кислой или сильно щелочной среде белок не выпадает в осадок даже при нагревании?
   
9. На чем основано разделение альбуминов и глобулинов?
   
10. На чем основан метод высаливания белков?
    
11. Предложите способ осаждения белков: пепсина (рН_ИЭТ=1,1), уреазы (рН_ИЭТ=4,9), каталазы (рН_ИЭТ=6,7).
    
12. На чем основаны методы извлечения белков?
    

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 3.

ОЧИСТКА БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ ОТ ПРИМЕСЕЙ

НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТОДОМ ДИАЛИЗА.


Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран.

Диализ широко используется для очистки белков от примесей низкомолекулярных соединений (соли, сахара и др.), которые легко проходят через поры полупроницаемых мембран. Белковые молекулы, обладая большим молекулярным весом, не способны проникать через искусственные или естественные мембраны (коллодий, пергамент, целлофан и другие).

Прибор, в котором проводят диализ, называется диализатором. Простейший диализатор представляет собой мешочек из полупроницаемого материала, в который заливается диализируемая жидкость. Мешочек опускается в сосуд с водой. Белок, помещенный в мешочек, остается в нем, а низкомолекулярные вещества в результате процесса диффузии проходят через мембрану во внешний раствор. Необходимый градиент концентрации поддерживают путем смены воды во внешнем сосуде.

Диализ можно ускорить более частой или непрерывной сменой воды, нагреванием (для растворов белков не выше 40⁰С), увеличением поверхности, через которую идет диализ, уменьшением слоя диализируемой жидкости.

Реактивы и оборудование: раствор яичного белка, насыщенный сульфатом аммония, 1%-ный раствор хлорида бария, 10%-ный раствор гидроксида натрия, 1%-ный раствор сульфата меди, пробирки: обыкновенные и мерная, химический стакан, целлофановый мешочек, штативы.

Приготовление раствора белка: белок одного куриного яйца отделить от желтка, смешать с 300 мл дистиллированной воды и 100 мл насыщенного раствора сульфата аммония и отфильтровать через марлю, сложенную в 3 слоя.

Выполнение работы. В простейший диализатор с помощью воронки вливают 10 мл раствора яичного белка. Целлофановый мешочек погружают в стакан с дистиллированной водой так, чтобы уровень жидкости в мешочке совпадал с уровнем воды во внешнем сосуде. Через каждые 10-15 минут меняют и анализируют воду из внешнего сосуда: в одной пробирке проводят биуретовую реакцию и убеждаются в том, что белки через мембрану не проходят, в другой пробирке проводят реакцию на ион SO₄^2-для установления проникновения соли через поры мембраны. Для этого к 1 мл анализируемого раствора добавляют 6-10 капель 1%-ного раствора хлорида бария. Если диализ проводился правильно, то должен выпадать белый мутноватый осадок BaSO₄.

Через 2 часа проба на сульфат-ионы становится отрицательной или очень слабой. Это свидетельствует о завершении диализа, т.е. о почти полной диффузии соли через целлофановую мембрану. В мешочке к этому времени прозрачный фильтрат мутнеет, вследствие выпадения в осадок глобулинов, нерастворимых в дистиллированной воде.

Контрольные вопросы.

1. Что называется диализом?
   
2. От каких факторов зависит скорость диализа? Как ее можно увеличить?
   
3. На чем основано отделение высокомолекулярных веществ от низкомолекулярных методом диализа?
   
4. Для чего используется диализ? В чем его достоинства и недостатки?
   

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 4.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ ЖЕЛАТИНА.


В изоэлектрической точке растворы белков неустойчивы и белок легко выпадает в осадок. Выпадение белка в осадок можно ускорить добавлением веществ, разрушающих гидратную оболочку белковых макромолекул (спирт, ацетон).

Реактивы и оборудование: 0,5%-ный раствор белка желатина, 0,1 н раствор уксусной кислоты, 0,1 н раствор уксуснокислого натрия, 96%-ный этиловый спирт, мерные пипетки на 2 мл.

Выполнение работы. Для определения изоэлектрической точки желатина в пять пробирок наливают растворы уксусной кислоты и уксуснокислого натрия в количествах, указанных в таблице 1. После чего в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора желатина и хорошо перемешивают, затем прибавляют по 4 мл этилового спирта и осторожно перемешивают стеклянной палочкой. Через 5-10 минут оценивают степень мутности каждой смеси по пятибалльной системе. рН наиболее мутной смеси соответствует изоэлектрической точке желатина. Результаты опыта записывают в таблицу 1.

Таблица 1. Определение изоэлектрической точки белка желатина.

№ про-бирки	Состав буферной смеси, мл		рН смеси	Объем раствора желати-на, мл	Объем этилового спирта, мл	Степень мутнос-ти
	0,1 н СН3СООH	0,1 н СН3СООNa
1 2 3 4 5	1,8 1,4 1,0 0,6 0,2	0,2 0,6 1,0 1,4 1,8	3,8 4,4 4,7 5,1 5,7	1 1 1 1 1	4 4 4 4 4

Контрольные вопросы.

1. Что такое изоэлектрическая точка белка?
   
2. Почему в изоэлектрической точке растворы белков неустойчивы?
   
3. Как влияет на осаждение белков добавление этанола?
   
4. Для каких целей при проведении лабораторной работы используется буферная смесь?
   

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 5.

НУКЛЕОПРОТЕИДЫ. ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ ИЗ ДРОЖЖЕЙ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИХ СОСТАВА.


Нуклеопротеиды - сложные белки, простетической группой которых являются нуклеиновые кислоты (дезоксирибонуклеиновая - ДНК и рибонуклеиновая - РНК). Они представляют собой слож­ные агрегаты, построенные из 1-2 молекул нуклеиновой кислоты и большого числа прикрепленных к ним белковых субъединиц. Связь между белком и нуклеиновыми кислотами осуществляется за счет ионных, водородных и гидрофобных взаимо­действий.

Нуклеиновые кислоты характеризуют­ся определенным составом и распадаются:

- при неполном ферментатив­ном гидролизе РНК и ДНК, щелочном гидролизе РНК (ДНК не гидролизуются под действием щелочей) до структурных единиц нуклеиновых кислот – мононуклеотидов.

- при полном гидролизе мононуклеотидов до пуриновых (аденина, гуанина) и пиримидиновых (цитозина, тимина – только в ДНК, урацила – только в РНК) азотистых оснований, пентоз (рибозы – в РНК, дезоксирибозы – в ДНК) и фосфорной кислоты.

Нуклеопротеидами богаты печень, селезенка, поджелудочная железа, почки. Доступным и удобным объектом, особенно богатым нуклеопротеидами, являются дрожжи. Нуклеопротеиды извлекаются из дрожжевых клеток при механическом разрушении клеток. Дальнейшее их выделение связано со свойством нуклеопротеидов растворяться в разбавленных растворах щелочей и легко осаждаться при подкислении раствора. При непродолжительном гидролизе дрожжевой массы или выделенных из нее нуклеопротеидов последние распадаются на полипептиды, пуриновые и пиримидиновые основания, рибозу и дезоксирибозу , фосфорную кислоту.

Продукты гидролиза нуклеопротеидов могут быть обнаружены в гидролизате специфическими для каждого соединения реакциями.

Реактивы и оборудование: дрожжи, диэтиловый эфир, 5%-ный раствор уксусной кислоты, 0,4, 10, 30%-ные растворы гидроксида натрия, 10%-ный раствор серной кислоты, 25%-ный раствор аммиака, 1%-ный раствор нитрата серебра, 1, 7%-ные растворы сульфата меди, этанол, молибденовый реактив (3,75 г молибдата аммония растворяют в 50 мл воды и добавляют 50 мл 32%-ного раствора азотной кислоты), ступки с пестиками, центрифуга, центрифужные пробирки, технические весы, пипетки, стеклянный лом, стеклянные палочки, фарфоровые чашки, бумажные фильтры, воронки, воздушный холодильник, электрическая плитка, спиртовки, пробирки.

Выполнение работы.

I. Извлечение нуклеопротеидов из дрожжей.

Навеску 1 г сухих дрожжей помещают в ступку, добавляют туда 0,5 г стеклянного лома, диэтилового эфира и воды по каплям и тщательно растирают до образования пластичной массы. Затем в ступку добавляют 5 мл 0,4%-ного раствора едкого натрия и продолжают растирать еще в течение 15-20 минут. Содержимое ступки центрифугируют в течение 10 минут (при 2000 оборотах в минуту). После центрифугирования надосадочную жидкость осторожно пипеткой переносят в фарфоровую чашку и по каплям прибавляют 2 мл 5%-ного раствора уксусной кислоты. При добавлении уксусной кислоты происходит выпадение нуклеопротеидов в осадок, который отделяют центрифугированием. Затем надосадочную жидкость сливают, а осадок используют для дальнейшего гидролиза.

II. Кислотный гидролиз нуклеопротеидов.

В колбу для гидролиза (с обратным воздушным холодильником) помещают осадок нуклеопротеидов, заливают 10-15 мл 10%-ного раствора серной кислоты и кипятят в течение 1,5 ч, поддерживая только слабое кипение. После кипячения колбу охлаждают, содержимое ее фильтруют через бумажный фильтр, а фильтрат подвергают дальнейшему анализу.

III. Анализ гидролизата.

Охлажденный гидролизат используют для качественного анализа на полипептиды, пуриновые основания, пентозы и фосфорную кислоту.

Белки обнаруживают с помощью биуретовой реакции.

Пуриновые основания обнаруживают по их реакции с аммиачным раствором нитрата серебра.

10 капель гидролизата нейтрализуют по каплям 25%-ным раствором аммиака (до рН=4 по универсальному индикатору, так как серебрянный комплекс пуриновых оснований выпадает в слабокислой среде) и затем добавляют 5 капель 1%-ного раствора нитрата серебра. Наблюдается образование комплекса серебра с пуриновыми основаниями в виде желтовато-белого аморфного осадка.

Пентозы обнаруживают по реакции Троммера.

5 капель гидролизата нейтрализуют 15 каплями 30%-ного раствора гидроксида натрия (до рН=9), затем добавляют 1 каплю 7%-ного раствора сульфата меди (избыток сульфата меди меняет окраску). Раствор при этом окрашивается в фиолетовый цвет, так как образуется алкоголят меди. Пробирку с раствором нагревают до кипения и наблюдают выпадение бурого осадка, так как медь (II) окисляется до оксида меди (I), имеющего красно-кирпичный цвет.

Фосфорную кислоту обнаруживают по реакции с молибдатом аммония:

12(NH₄)₂MoO₄ + H₃PO₄ + 21HNO₃ → (NH₄)₃PO₄·12MoO₃↓ + 21NH₄NO₃ + 12H₂O.

К 1-2 мл гидролизата приливают 2-3 мл молибденового реактива, нагревают до кипения. Образуется желтый осадок фосфоромолибдата аммония (NH₄)₃PO₄·12MoO₃.

Контрольные вопросы.

1. Что такое нуклеопротеиды? К какому классу биомолекул они относятся?
   
2. В каких участках клетки локализуются нуклеопротеиды?
   
3. При каких условиях нуклеопротеиды распадаются на нуклеиновые кислоты и белки?
   
4. Какие продукты полного гидролиза нуклеопротедов? Какими качественными реакциями их можно обнаружить?
   

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 6.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ.

Для количественного определения белков применяют биологические, физические и химические методы.

Биологические методы количественного определения белков основаны на измерении степени биологической активности препарата и, поэтому, применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Эти методы не дают абсолютных результатов.

Более точными являются физические методы количественного определения белков. Наибольшее распространение из них получили три: рефрактометрический (по показателю преломления белковых растворов), спектрофотометрический (по интенсивности светопоглощения в ультрафиолетовой области спектра) и полярографический (по полярографическим кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок).

Химические методы количественного определения белков разнообразны. Самым распространенным и наиболее точным является фотоколориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности светопоглощения, которая зависит от количества белка в исследуемой пробе.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

РЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Рефрактометрический метод анализа белка основан на измерении показателя преломления белкового раствора, зависящего от его кон­центрации, температуры, длины волны падающего света и природы ве­щества.

Между показателем преломления (n) и концентрацией белка в растворе характерна прямо пропорциональная зависимость. Поэтому концентрацию белка в исследуемом растворе находят по показателю преломления с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору белка.

Измерения проводят с помощью специального прибора – рефрактометра, с устройством которого можно ознакомиться по инструкции, прилагаемой к прибору.

Реактивы и оборудование: стандартный раствор белка, раствор исследуемого белка, рефрактометр, пипетки мерные на 1, 2, 5 мл, колба мерная на 100 мл, стеклянные палочки, фильтровальная бумага.

Выполнение работы. В колбах на 100 мл готовят серию (5-6) стандартных растворов белка с концентрациями 1 – 8 мг/мл, измеряют их показатели преломления (n) с помощью реф­рактометра, предварительно установив ноль по воде (показатель преломления воды при температуре 20°С равен 1,333). Если во время проведения измерений температура не равна 20°С, то в полученное значение показателя преломления вносят поправку 0.0001 на каждый градус. В случае более низкой температуры поправку вычитают, более высокой – прибавляют. После этого строят график зависимости в координатах n - f (c). Затем, измерив показатель преломления исследуемого раствора, по построенной калибровочной кривой определяют его концент­рацию. Результат пересчитывают на 100 г продукта.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Фотоколориметрический метод анализа белка основан на измерении оптической плотности белкового раствора, зависящей от его кон­центрации, температуры, интенсивности падающего света и природы ве­щества. Эта зависимость выражается основным законом светопоглощения - законом Бугера-Ламберта-Бера: D = lg (I₀ / I) =  · c · l, где D - оптическая плотность (экстинкция); I₀ - интенсивность падающего света; I - интенсивность прошедшего через раствор света;  - молярный коэффициент поглощения; c - концентрация вещества, моль/л; 1 - толщина слоя раствора, погло­щающего свет.

Биуретовый фотоколориметрический метод количественного определения белка в исследуемом материале основан на проведении биуретовой реакции. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна количеству пептидных связей, а, следовательно, и концентрации белка в растворе.

Оптическая плотность измеряется на фотоэлектроколориметре (ФЭК), с устройством которого можно ознакомиться по инструкции, прилагаемой к прибору. По оптической плотности исследуемого раствора с помощью калибровочной кривой находят концентрацию белка в растворе.

Реактивы и оборудование: раствор стандартного белка, раствор исследуемого белка, биуретовый реактив, 0,9%-ный раствор хлорида натрия, ФЭК, кювета на 10 мм, пипетки мерные на 1, 2, 5 мл, колбы мерные на 100, 200, 500 мл, фильтровальная бумага.

Приготовление биуретового реактива.

В колбе на 200 мл растворяют 9 г сегнетовой соли, после растворения добляют 3 г сульфата меди и 1 г иодида калия и доводят до метки 0,2 н раствором гидроксида натрия, к полученному раствору добавляют 300 мл 0,5%-ного раствора иодида калия.

Выполнение работы. При анализе яичного белка, белка сыворотки крови исследуемые растворы предварительно разбавляют 0,9%-ным раствором хлорида натрия (яичный белок в 50 раз, сыворотку крови - в 100 раз). Готовят серию (5-6) стандартных растворов белка с концентрациями 1 – 8 мг/мл. Разведение до необходимых концентраций белка осуществляют раствором, который использовали для разбавления исследуемого материала. В пробирки отбирают по 1 мл приготовленных стандартных растворов и добавляют 5 мл биуретового реактива. Пробы перемешивают, оставляют на 30 минут при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность (D) с помощью ФЭКа при 540 нм в кювете на 10 мм против контроля. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду. По полученным значениям D строят калибровочный график в координатах D - f (c). Затем, измеряют аналогично оптическую плотность исследуемого раствора белка, смешав 1 мл исследуемого раствора и 5 мл биуретового реактива, и по построенной калибровочной кривой определяют его концент­рацию. Результат пересчитывают на 100 г продукта.

Контрольные вопросы.

1. Какие существуют методы количественного определения белков?
   
2. На чем основаны рефрактометрический и фотоколориметрический методы анализа белковых молекул?
   
3. В чем заключается принцип биуретового метода?
   
4. От чего зависят оптическая плотность и показатель преломления белковых растворов?
   
5. Для чего и как составляют калибровочный график?
   

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков.- М.: Высшая школа.-1996.
   
2. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. - М.: Высшая школа.- 1985.
   
3. Жура Н.А. Методическая разработка к изучению темы «Белковые аминокислоты».- Изд-во Могилевского гос. ун-та.-1999.
   
4. Шапиро Д.К. Практикум по биологической химии. – Минск.-1976.
   
5. Филлипович Ю.Б. Биохимия белка и нуклеиновых кислот. - М.: Просвещение.- 1978.
   
6. Ленинджер А. Биохимия. - М.: Мир.-1999.
   
7. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия.- М.: Высшая школа.-1996.
   
8. Березов Т.Т. Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.-М.: Медицина.-1998.
   
9. Р. Марри, Д. Греннер, П.Мейес, В. Родуэлл Биохимия человека.- М.: Мир.- Т.1,2.- 1993.
   
10. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. - М.: Просвещение.- 1975.
    
11. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Щеголева Л.И. Упражнения и задания по биологической химии. - М.: Просвещение.- 1986.