Состояние нуклеолярного аппарата лимфоцитов крови при профессиональном воздействии металлов-аллергенов и электромагнитных полей диапазона радиочастот. 14. 00. 50 Медицина труда

Актуальность проблемы: В условиях современного технического прогресса работники подвергаются комбинированному, комплексному воздействию различного рода антропогенных раздражителей, сочетанному влиянию вредных промышленно-экологических факторов различной природы: химических, физических и биологических, способных вызвать гамму патологических изменений и обусловливающих нарушения реактивности организма (С.М. Федоров и др., 2001; Н.Ф. Измеров, 2005).

В настоящее время с каждым годом увеличивается количество химических веществ, с которыми контактирует человек и в быту и на производстве. Постоянно накапливаются данные о растущем загрязнении окружающей среды за счет промышленных выбросов и возможности сенсибилизации к металлам, содержащимся в предметах бытового предназначения, вследствие особенностей производственной технологии. Это относится к никельсодержащим предметам, бытовым красителям, пищевым продуктам, что влияет на иммунный статус населения. В настоящее время широкое применение металлов в составе сплавов в стоматологической практике способствует росту распространенности сенсибилизации к серебру (42-94%), никелю (18-32%), кобальту (2%), хрому (2%), меди (2%), цинку (2%) (А.В.Кудрин и соавт., 2000). Все это способствует росту заболеваемости контактными дерматитами (Н.Ф. Измеров и др., 1993; А.А. Антоньев и др., 1996; Ю.К. Скрипкин и др., 1998; И.В. Яцына и др., 2001; Н.И. Измерова, 1994, 2003). Установлено, что в 92% причиной профессиональных заболеваний кожи являются химические вещества. Из них 50-52% приходится на долю металлов-сенсибилизаторов (соли хрома, никеля, кобальта) (Adams R., 1990; А.А. Антоньев и др., 1996; И.В. Яцына и др., 2000, 2004; Н.И. Измерова и др., 1994, 2003).

В современной литературе накоплен значительный фактический материал о воздействии металлов на структуры клеточного ядра. Появился целый ряд данных о токсическом действии большинства металлов (Cr, Ni, Co, As, Be, Cd, Sn, Pb и др.) на клеточный цикл и механизмы клеточной гибели (А.В. Кудрин и соавт., 2000; Anderson et all, 1994).

Исследования Anderson et all (1994), изучавших действие металлов на геном показали, что генотоксические свойства Cr, Ni, Co проявляются в их способности проникать в ядро, подавлять синтез ДНК, приводя к дисбалансу генов, регулирующих клеточный цикл и к увеличению числа хромосомных аберраций в лимфоцитах.

Однако, механизм мутагенного, канцерогенного и токсического действия металлов и их соединений на геном изучен в основном в эксперименте.

Другой серьезной проблемой, которой обеспокоено современное общество – возможность неблагоприятного воздействия электромагнитных полей радиочастотного диапазона (ЭМП РЧ) (ВОЗ, 2004; Рубцова Н.Б., 2005). К критическим органам и системам относят центральную нервную и кроветворную системы, глаза, гонады. Описаны эффекты со стороны сердечно-сосудистой и нейроэндокринной систем, иммунитета, обменных процессов (ВОЗ, 1984; Измеров Н.Ф. и др., 1999; Никитина В.Н., 1990, 2004; Суворов Г.А. и др., 1998; Рубцова и др., 2003). В литературе имеются данные о повреждающем действии ЭМП СВЧ и РЧ на генетический аппарат в виде хромосомных и/или хроматидных аберраций (Ю.А. Семин и др., 1995; Л.А. Иванова и др. 2006). В последние годы появились данные об индуцирующем влиянии ЭМП на процессы канцерогенеза (Goldsmith J.R., 1995; Szmigielski S., 1991; Hardell L. et all, 2003).

Известно, что функциональное состояние клеток и, в частности, лимфоцитов можно оценивать, изучая морфологические особенности этих клеток (Погорелов В.М., 1992). Ядрышки или нуклеолы, как морфологическая структура ядра клетки, являются местом синтеза рибосомной РНК - функции рибосомных генов, локализованных в спутничных нитях ядрышкообразующих районов (ЯОР) акроцентрических хромосом групп D и G. Они образуются в интерфазе и реорганизуются в митозе. Их количество, форма и размеры отражают транскрипцию рибосомных генов, которая зависит от интенсивности клеточного метаболизма, степени клеточной дифференцировки и стадий клеточного цикла, а сами они определяют процессы синтеза белка на рибосомах ( Kamel et all., 1990).

В клинических условиях нарушения нуклеологенеза изучены в работах В.М.Погорелова, Г.И.Козинца (1992; 2002) на модели клеток опухолей из лимфоидной ткани. В.Н.Минеев с соавт. (2003) изучали апоптоз и активность рибосомных цистронов лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови при бронхиальной астме. Д.Ф.Каюмова (1993) выявила особенности нуклеолярного аппарата интерфазных лимфоцитов крови у лиц, занятых в производстве резино-технических изделий и ликвидаторов аварии на Чернобольской АЭС.

Однако, в доступной нам литературе не встретилось работ, посвященных изучению морфо-функциональных особенностей ядрышкового аппарата лимфоцитов при действии таких распространенных факторов химической и физической природы, особенно актуальных в настоящее время, как металлы-аллергены и ЭМП диапазона радиочастот. Это определило актуальность проведения исследований нуклеолярного аппарата лимфоцитов крови на модели профаллергодерматов от воздействия металлов-аллергенов (соединения хрома, никеля, кобальта) и при профессиональном воздействии электромагнитных полей диапазона радиочастот для выявления раннего воздействия неблагоприятных факторов производственной среды на организм на уровне генетического аппарата клетки.

Диссертационная работа выполнена в рамках госбюджетной темы ГУ НИИ медицины труда РАМН №0203 «Новые клеточные технологии в клинике основных форм профессиональных заболеваний (патогенез, диагностика, лечение, профилактика)», темы №9027 «Изучение клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе патоморфоза заболеваний, возникающих в современных условиях промышленной экологии окружающей среды» и рамках НИР «Аналитическая цитохимия вариантов острых лейкозов» (совместно с лабораторией гемоцитологии ГНЦ РАМН)


Цель работы: изучить состояние нуклеолярного аппарата и морфометрические параметры лимфоцитов периферической крови у больных профаллергодерматозами от воздействия металлов-аллергенов (соединения Сr, Ni, Co) и у лиц, подвергавшихся профессиональному воздействию электромагнитных полей диапазона радиочастот.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Определить параметры нуклеологенеза в лимфоцитах крови методом цитохимической реакции с нитратом серебра у обследованных контингентов: больных профаллергодерматозами и у лиц, подвергавшихся профессиональному воздействию электромагнитных полей диапазона радиочастот.
   
2. Используя метод компьютерного анализа клеточного изображения, оценить геометрические и цветояркостные параметры лимфоцитов крови (площади клетки и ядерных структур) в обследованных группах.
   
3. По результатам определения ферментов, локализованных в цитоплазматических структурах клетки, оценить активность биоэнергетических процессов, уровень свободных радикалов и антиоксидантной защиты клетки, а также клеточную аллергическую и воспалительную реакции крови в обследованных группах.
   
4. Провести сопоставление полученных параметров нуклеологенеза в обследованных группах больных профаллергодерматозами и у лиц, подвергавшихся воздействию электромагнитных полей радиочастот с результатами клинического обследования, и данными гематологических и цитохимических исследований.
   
5. Оценить перспективность использования параметров нуклеолярного аппарата как критериев повреждающего действия вредных факторов промышленной природы у лиц, имевших контакт с промышленными аллергенами и электромагнитными полями диапазона радиочастот.
   

Научная новизна работы

- В результате проведенных исследований получены новые данные о повреждающем действии вредных производственных факторов физической и химической природы на организм, на уровне рибосомных цистронов лимфоцитов крови.

- Впервые проведена комплексная оценка нуклеолярного аппарата лимфоцитов в сочетании с изменениями биохимического гомеостаза лимфоцитов.

• Выявлены особенности изменений рибосомного хроматина лимфоцитов у больных профаллергодерматозами и у лиц, подвергавшихся воздействию электромагнитных полей диапазона радиочастот.
  
• Выявлена взаимосвязь между изменениями нуклеолярного аппарата и уровнем активности биоэнергетических, свободно-радикальных процессов, антиоксидантной клеточной защиты.
  

Практическая значимость работы

• Сформирован комплекс лабораторных методов, характеризующих клетки на уровне генетического аппарата и функции цитоплазматических структур, который позволяет выявить повреждающее действие вредных факторов промышленной природы при воздействии на организм соединений металлов-аллергенов и ЭМП радиочастот.
  
• По данным изменений нуклеолярного аппарата лимфоцитов крови предложены критерии выявления биологического эффекта воздействия металлов-аллергенов и ЭМП радиочастот.
  
• Представленные в работе методы и предложенные диагностические критерии могут быть внедрены в практику предварительных и периодических медицинский осмотров для оценки повреждающего действия на организм вредных производственных факторов, для ранней диагностики и оценки тяжести заболевания при обследовании больных профаллергодерматозами.
  

Материалы исследований легли в основу:

• Проекта пособия для врачей «Клинико-лабораторная оценка нуклеолярного аппарата и апоптоза лимфоцитов крови при профессиональном воздействии вредных химических и физических факторов»
  
• Проекта программы послевузовской профессиональной подготовки (образовательная программа, учебная программа, тестовые задания) по специальности «клиническая лабораторная диагностика» (шифр – 040107) (клиническая ординатура, 3456 часов)
  

Апробация работы проведена на заседании специалистов клинического отдела по изучению клинико-патогенетических основ профессиональных и производственно обусловленных заболеваний ГУ НИИ медицины труда РАМН (28.06.20006). Материалы диссертации представлены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005); на IV Всероссийском конгрессе «Профессия и здоровье» (Москва, 2005); на 9-ом конгрессе ЕНА (Женева, Швейцария, 2004); на 28-ом Международном конгрессе по медицине труда (Милан, Италия, 2006); на заседаниях Ученого Совета ГУ НИИ медицины труда РАМН (Москва, 2005, 2006).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем и структура работы: Работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка используемой литературы, содержащего 171 источников, из них 111 отечественных и 60 зарубежных авторов. Диссертация изложена на страницах ___машинописного текста, иллюстрирована___таблицами и ___рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В механизмах повреждающего действия металлов-аллергенов и ЭМП радиочастот важную роль играет нарушение структурно-биохимического гомеостаза, в основе которого лежит активация рибосомных цистронов, биоэнергетических, свободно-радикальных процессов и снижение антиоксидантной защиты клеток.
   
2. Высокая транскрипционная активность рибосомных цистронов, отражающая пролиферативный и белоксинтезирующий потенциал клетки отмечена у больных с распространенными формами профаллергодерматозов с выраженными клиническими проявлениями кожи.
   
3. Для оценки риска развития, ранней диагностики и оценки тяжести течения профзаболеваний целесообразно использование методического комплекса, характеризующего клетки на уровне генетического аппарата и функции цитоплазматических структур.
   

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных задач проведено клинико-лабораторное обследование 127 человек, из которых: 72 - больные профаллергодерматозами от воздействия металлов-аллергенов (Cr, Ni, Co); 35 - подвергались профессиональному воздействию электромагнитных полей (ЭМП) диапазона радиочастот. В группу контроля вошли 20 практически здоровых людей.

Возрастной состав обследованных больных профаллеродерматозами был однородный. Преимущественно это были женщины от 40 до 60 лет. Общее клиническое обследование больных проводилось в дерматологическом отделении клиники ГУ НИИ медицины труда РАМН (зав. - проф. Измерова Н.И.). Обследованные больные профаллергодерматозами являлись работниками различных предприятий г. Москвы и Московской области, имевшими различные профессии. В число обследованных вошли строительные рабочие и работники производства строительных материалов (формовщики, бетонщики, плиточники, отделочники, маляры, штукатуры), а также работники, занятые обработкой металла (слесари, шлифовщики, токари, гальваники). Согласно санитарно-гигиеническим характеристикам условий труда основным фактором вредности у всех больных являлись металлы-сенсибилизаторы: соединения хрома, никеля, кобальта, входящие в состав цемента и различных легированных сталей. Диагноз профессионального заболевания кожи основывался на результатах осмотра кожных покровов, характеристике барьерной функции кожи с учетом профессионального маршрута больного, санитарно-гигиенической характеристики условий труда, выявленной повышенной чувствительности к промышленным аллергенам при кожном тестировании. Результаты кожного тестирования были подтверждены in vitro НСТ-тестом, стимулированным аллергенами (Cr, Ni, Co).

Обследованные больные профаллергодерматозами были разделены на две группы в зависимости от распространенности и выраженности патологического кожного процесса, характеристике барьерной функции кожи. Таким образом, в первую группу вошли 52 больных с локализованными формами профаллергодерматозов, а вторую группу составили 20 человек с распространенными формами профаллергодерматозов.

Группа лиц, без клинических проявлений, подвергавшихся профессиональному воздействию ЭМП радиочастот как физического фактора воздействия, состояла из 35 человек: 25 женщин и 10 мужчин в возрасте 35-50 лет (профессиональных пользователей ПЭВМ и использующих мобильные телефоны как средство профессиональной коммуникации). Все эти лица подвергались воздействию комплекса факторов, ведущим из которых является ЭМП радиочастот в сочетании с изменяющимися микроклиматическими условиями, шумом и высокой степенью психо-эмоционального напряжения. Уровни потока энергии (УПЭ) модулированного ЭМП у головы пользователя составляла 31-1400 мкВт/см², что свидетельствует о превышении в отдельных случаях установленных временных допустимых уровнях ЭМП.

В настоящей работе был использован комплекс клинико-лабораторных методов исследования, включающих гематологические, цитохимические, исследование нуклеолярного аппарата лимфоцитов методом серебрения, компьютерный анализ клеточного изображения.

Проведенные гематологические исследования включали количественную, морфологическую и функциональную оценку клеток периферической крови. Пробы капиллярной крови обследованных групп были исследованы при помощи гематологического счетчика НЕМА-screen 10. Наряду с подсчетом форменных элементов в обследованных группах проводилось морфологическое исследование клеток крови и подсчет лейкоцитарной формулы по общепринятой методике.

Активность нуклеолярного аппарата исследовали методом импрегнации ядерного хроматина серебром (Ag-ЯОР-реакция) по стандартной методике (Howell и Black,1980) в модификации В.М. Погорелова (1992). Метод является высокоспецифичным для выявления активных ядрышкообразующих районов (ЯОР).

В основе реакции лежит специфическое связывание ионов металла с нуклеолярными кислыми негистоновыми белками, среди которых наиболее изученными являются: нуклеолин (С23), нуклеофозмин ( В23), фибриллярин (В36), белок 100кД, РНК-полимераза-1 и др. Эти аргентофильные белки маркируют активные рибосомные гены, участвуют в процессах транскрипции и процессинга 45S пре-РНК до 18S и 28S субъединиц, формируя структуру ядрышка в интерфазе, и осуществляет транспорт прерибосомных частиц в цитоплазму. Продукт реакции выявляется в световом микроскопе в виде темно-коричневых преципитатов серебра (гранул), а ядрышки приобретают коричневый цвет. Анализировалось 50 клеток в каждом случае.

Для анализа изображений лимфоцитов в окрашенных мазках периферической крови использовалась исследовательская версия прибора автоматического скрининга клеток периферической крови (АСПЕК). Прибор создан совместно Радиотехническим институтом им. А.Л. Минца и лабораторией гемоцитологии (зав. –профессор Г.И. Козинец) ГНЦ РАМН. Версия настроена на сегментацию, измерение и распознавание клеток, ядер и ядрышек и способна снабжать исследователя информацией о геометрических, цветояркостных, текстурных и популяционных характеристиках клеток препарата. Прибор формирует из них графические диагностические образы.

В настоящей работе нами была предпринята попытка оценить изменения геометрических и цветояркостных параметров цифровых изображений лимфоцитов и их внутриклеточных структур (нуклеолярный аппарат) с точки зрения их применимости для автоматизации и объективизации процесса исследования. Для математического анализа цветояркостных характеристик ядрышек нами впервые апробированы модели цветовых пространств RGB и HSV.

Для оценки состояния ферментативной активности клеток крови использовали цитохимические методы определения ферментов. Состояние энергетического метаболизма лимфоцитов оценивали по активности ферментов, характеризующих энергетический обмен в клетках - сукцинатдегидрогеназы (СДГ) – ключевого фермента цикла Кребса, маркера митохондрий и митохондриальной а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) – фермента цикла Кребса и компонента глицерофосфатного шунта, осуществляющего преемственность гликолиза и биологического окисления. Для характеристики системы «свободно-радикальные процессы – антиоксидантная защита клеток»: функциональную активность нейтрофилов, способность их микробицидных систем генерировать активные формы кислорода, оценивали цитохимическим методом бессубстратного восстановления нитросинего тетразолия до формазана (НСТ-тест по методу Park и соавт., 1987). Ключевым ферментом антиоксидантной защиты является миелопероксидаза (МП), которая обезвреживает перекиси и гидроперекиси, образующиеся при свободно-радикальных реакциях из ненасыщенных жирных кислот на мембранах нейтрофилов при фагоцитозе и таким образом участвует в защите клеток от токсического воздействия. Для характеристики клеточной воспалительной и аллергической реакции крови оценивали активность щелочной и кислой фосфатаз. Щелочная фосфатаза (ЩФ) – маркер гидролазосом – является одним из основных звеньев микробицидной интралейкоцитарной системы, осуществляет гидролиз нуклеиновых кислот и фосфопротеинов клеточной оболочки. В настоящее время доказана информативность щелочной фосфатазы нейтрофилов как цитохимического критерия в выявлении инфекционного воспалительного процесса. Кислая фосфатаза (КФ) – маркер лизосом - осуществляет кислотный гидролиз бактерий, метаболитов, различных антигенов, с ней связан цитолитический эффект лимфоцитов при реализации аллергической реакции. Активность кислой и щелочной фосфатаз определяли по Goldberg и Barka (1987), миелопероксидазы – по Sato (1987). Активность дегидрогеназ определяли по Р.П. Нарциссову (1969).

Для характеристики иммунологических реакций при профаллергодерматозах с использованием цитохимических методов идентификации субпопуляции лимфоцитов (Л.А. Иванова, 1991) определяли абсолютное количества субпопуляций Т-клеток, осуществляющих реакции клеточного иммунитета, и В-лимфоцитов, которые, синтезируя антитела, участвуют в реакциях гуморальной системы иммунитета.

Статистическая обработка результатов включала использование стандартных методов вариационной статистики. Для выявления и подтверждения достоверности различий показателей в сравниваемых группах, с учетом объема выборки и неопределенности характера распределения, использовался непараметрический U-тест по Манн-Уитни. Для обнаружения и установления характера и силы связей между изучаемыми показателями использовался корреляционный анализ (вычисление коэффициентов корреляции Спирмена).

Статистический анализ полученных результатов в разделе морфометрических исследований проводили с помощью компьютерной программы «АСПЕК», результаты анализа автоматически импортировались в Excel.


РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ


Гематологические исследования.


Как показали результаты исследования, при профессиональном воздействии таких изучаемых факторов, как металлы- аллергены и электромагнитные поля радиочастотного диапазона, гематологические показатели (количество клеток крови и морфологический состав) остаются в пределах нормальных значений (табл.1).