Geum.ru

Полимеразная цепная реакция в определении активности микоплазменной инфекции урогенитального тракта

Вид материалаДокументы

Содержание


Материалы и методы.
Результаты и их обсуждение.
Подобный материал:
Полимеразная цепная реакция в определении активности микоплазменной инфекции урогенитального тракта

Бадыгина Н.А., Костюк С.А., Полуян О.С., Силич Т.В.

Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск

Актуальным остается проблема оценки активности микоплазменной инфекции урогенитального тракта с помощью современных молекулярно-биологических методов. Уреаплазмы и микоплазмы, наиболее часто поражающие урогенитальный тракт человека, могут вызывать негонококковый ссылка скрыта, спонтанные аборты, преждевременный разрыв плодных оболочек, послеродовую лихорадку [1-5]. Установлено, что количествый уровень микоплазм и уреаплазм определяет формирование воспалительных реакций в урогенитальном тракте [6].

В настоящей момент полимеразная цепная реакция (ПЦР) как одна из самых высокоспецифичных и высокочувствительных методик диагностики инфекций урогенитального тракта заняла прочные позиции в клинической лабораторной практике, причем наиболее распространенным подходом для идентификации амплифицированного фрагмента ДНК возбудителя является агарозный гель-электрофорез, основанный на разделении молекул ДНК по размеру [7]. В данном случае анализ наличия амплифицированной в ПЦР ДНК возбудителя проводится качественно по типу «да – нет». И если положительный результат качественной ПЦР при выявлении облигатных патогенов в достаточной степени однозначен, то при получении положительного ПЦР-анализа при диагностике условно-патогенных Mycoplasma hominis или Ureaplasma urealyticum в первую очередь возникает вопрос о количественном уровне данных возбудителей в урогенитальном тракте.

Количественный анализ при проведении ПЦР является более сложным по сравнению с качественной оценкой ПЦР-реакции, так как требует учета количественного результата на экспоненциальной стадии процесса амплификации [8]. Это условие трудно выполнимо при проведении качественной традиционной ПЦР с учетом результата амплификации по «конечной точке» [9]. В настоящее время данные условия могут быть соблюдены при проведении ПЦР в реальном времени [10].

Поэтому целью настоящего исследования было определение активности микоплазменного процесса урогенитального тракта с применением современной методики ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР).

Материалы и методы. На первом этапе было проведено качественное определение наличия специфических фрагментов ДНК возбудителей урогенитальных инфекций - Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum и Herpes simplex virus I, II типы в биологическом материале, полученном от 92 женщин с воспалительными процессами урогенитального тракта различной локализации (уретра, цервикальный канал) и 27 женщин группы контроля методом ПЦР, используя диагностические наборы «Амплисенс» (ЦНИИЭ МЗ РФ, Россия). Выделение ДНК из соскобов эпителиальных клеток проводили согласно протоколу набора «ДНК-сорб А» (ЦНИИЭ МЗ РФ). Амплификацию ДНК проводили в многоканальном амплификаторе «Терцик». Детекцию продуктов амплификации ДНК проводили методом электрофореза в 1,5 %-ном агарозном геле, содержащем 1%-ый бромистый этидий.

Для определения количественного уровня ДНК гена уреазного комплекса (ureB) Ureaplasma urealyticum и ДНК гена 16sРНК Mycoplasma hominis методом Real-Time PCR (амплификатор «RotorGene», Австралия) использовались диагностические наборы «Амплисенс FRT» (ЦНИИЭ МЗ РФ).

Стандартизация исследования проводилась относительно однокопийного гена человека NAGK, который локализован на участке р13.3 короткого плеча хромосомы 2, и кодирует N-ацетилглюкозамин киназу, являющуюся основным компонентом комплекса лизосомальных карбогидратов и конвертирует N-ацетилглюкозамин в N-ацетилглюкозамин-6-фосфат. (ссылка скрыта ).

Для построения калибровочных кривых использовали разработанные нами калибраторы стандартов с концентрацией ДНК Ureaplasma urealyticum или Mycoplasma hominis 1×107, 1×106, 1×105, 1×104 и 1×103 копий/мл, содержащих ДНК человека в концентрации 10,0, 1,0, 0,1, 0,01 и 0,001 мкг/мл [11]. Для каждой серии исследований калибровочная кривая строилась по 5 точкам в дублях и 2-ух контролей, не содержащих ДНК.

Результаты и их обсуждение. Методом ПЦР у женщин с воспалительными процессами урогенитального тракта (n=92) выявлены возбудители инфекций в 81,5 ± 4,04% случаев (n=75), причем наиболее часто выявлены Ureaplasma urealyticum (68,5 ± 4,8 %, n=63) и Trichomonas vaginalis (16,3±3,8%, n=15). ДНК Chlamydia trachomatis обнаружена в 42,4 ± 5,2 % (n=39) случаев, ДНК Mycoplasma hominis – 26,1 ± 4,6% (n=24), Mycoplasma genitalium – 10,9 ± 3,2% (n=10) и Herpes simplex virus I/II типы – 3,3 ± 1,9% (n=3). При проведении ПЦР диагностики возбудителей урогенитального тракта у пациентов группы контроля в 18,5±7,6% (n=5) случаев выявлена ДНК Ureaplasma urealyticum, ДНК Chlamydia trachomatis, в 7,4±5,1% Mycoplasma hominis (n=2) и Trichomonas vaginalis (7,4 ±5,1%, n=2). Сравнение результатов ПЦР – диагностики возбудителей ИППП в основной и контрольных группах установило, что этиологически значимым возбудителем (χ2, Р< 0,05) у женщин с воспалительными процессами является Ureaplasma urealyticum (68,5 ± 4,8 %, n=63) и Chlamydia trachomatis (42,4 ± 5,2 %, n=39).

На долю микст-инфекции приходилось 65,33% случаев (n=49). В подавляющем большинстве случаев в соскобах эпителиальных клеток из уретры и цервикального канала была обнаружена смешанная мико-уреаплазменная (38,78%, n=19) и уреаплазменно-хламидийная (30,61%, n=15) инфекция.

В результате микроскопического исследования гинекологических мазков в группе пациенток с воспалительными процессами урогенитального тракта (n=92) установлена наибольшая частота (76,09%, n=70) встречаемости III-IV степени чистоты влагалища, что свидетельствует о выраженном нарушении биоценоза влагалища.

Клиническое наблюдение за течением различных форм смешанных инфекций установило, что наличие ассоциаций возбудителей приводит к отягощению клинических проявлений инфекций (наличие жалоб, III-IV степень чистоты влагалища, поражения шейки матки), вызывая тем самым более выраженные изменения в тканях и органах и более активное течение воспалительного процесса.

Количественное определение ДНК гена уреазного комплекса (ureB) Ureaplasma urealyticum, ДНК гена 16sРНК Mycoplasma hominis и однокопийного гена человека NAGK проводили относительно калибровочных кривых в ДНК - Ureaplasma urealyticum - позитивных пробах (n=63) и/или ДНК - Mycoplasma hominis -позитивных пробах (n=24). В соскобах эпителиальных клеток, содержащих ДНК Ureaplasma urealyticum и/или Mycoplasma hominis (n=88), методом РТ-ПЦР была определена относительная концентрация Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis и ДНК гена человека NAGK. При этом относительная концентрация копий гена ureB Ureaplasma urealyticum и гена 16SРНК Mycoplasma hominis в 1 мл раствора нуклеиновых кислот составила 2,33×105±2,11×104 (n=63) и 2,45×106± 8,34×105 (n=24). Учитывая тот факт, что гены ureB Ureaplasma urealyticum и 16SРНК Mycoplasma hominis однокопийные, можно рассчитать число мико-уреаплазм, приходящихся на 1 эпителиальную клетку. Количество клеток уреаплазмы на 1 клетку человека составило 0,28±0,05, а микоплазмы – 2,34±0,82.

Нами установлено увеличение относительной концентрации копий ДНК Ureaplasma urealyticum и/или Mycoplasma hominis (≥ 105 копий/мл) в растворе нуклеиновых кислот при ассоциациях данных возбудителей в сравнении с концентрацией ДНК Ureaplasma urealyticum и/или Mycoplasma hominis при моно-инфекции (U - тест, Р < 0,05), что свидетельствует об усилении патогенных свойств мико-уреаплазм при наличии микст-инфекции урогенитального тракта. В тоже время у пациенток с выявленной моно-микоплазменной инфекцией отмечены минимальные клинические проявления (отсутствие жалоб, II степень чистоты влагалища, отсутствие поражения шейки матки) с уровнем копий ДНК в 1 мл раствора нуклеиновых кислот < 105 или < 0,3 клеток микоплазм, приходящихся на 1 эпителиальную клетку.

Проведенные исследования продемонстрировали актуальность определения активности микоплазменной инфекции в урогенитальном тракте с использованием РТ-ПЦР при выявлении ДНК Ureaplasma urealyticum и/или Mycoplasma hominis в моно–состоянии, а также позволяют рекомендовать практическим врачам при наличии смешанной урогенитальной инфекции проводить комплексную клинико-инструментальную оценку выраженности ее клинических проявлений.

Литература.
  1. Mycoplasma genitalium in males with nongonococcal urethritis: prevalence and clinical efficacy of eradication / D. I Gambini [et al.] // Sex. Transm. Dis. - 2000 - №27.- P. 226-229.
  2. Association of Mycoplasma genitalium with nongonococcal urethritis in heterosexual men / P. A.Totten [et al.] // J. Infect. Dis. –2001- N. 183: p. 269-276.
  3. Ureaplasma urealyticum, in the development of postpartum endometritis /W. Chaim [et al.] // European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. – 2003. - № 109.- Р.145-148.
  4. High-density vaginal Ureaplasma urealyticum colonization as a risk factor for chorioamnionitis and preterm delivery / M. Abele Horn [et al.] // Acta. Obstet. Gynecol. Scand. – 2000. –Vol. 79, № 11. – Р. 973–978.
  5. Relationship of bacterial vaginosis and micoplasmas to the risk of spontaneous abortion / G.G. Donders [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2000. – Vol. 183, № 2. – Р. 431–437.
  6. Прозоровский, С.В. Медицинская микоплазмология / С.В. Прозоровский, И.В. Раковская, Ю.В. Вульфович; РАМН. – М. : Медицина, 1995. – 288 с.
  7. Костюк, С.А. Новые подходы к совершенствованию метода ДНК-диагностики урогенитальных инфекций, обусловленных Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum / С.А. Костюк // Медицина. –2003. – № 4. – С. 40–43.
  8. Момыналиев, К.Т. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. Часть 1 (лекция) / К.Т. Момыналиев, В.М.Говорун // Клиническая лабораторная диагностика. – 2000. – №4. С. 25–32.
  9. Определение количеств ДНК уреаплазм с помощью конкурентной и мультиплексной ПЦР / В.А. Рар [и др.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2003. – №3. – С. 22–25.
  10. Kim, D.W. Real-time quantitative PCR / D.W. Kim // Exp. Mol.Med. – 2001. – Vol. 31, № 1. – P.101–109.
  11. Бадыгина. Н.А. Определение относительной концентрации микоуреаплазм методом полимеразной цепной реакции в реальном времени / Н.А. Бадыгина, С.А. Костюк // Медицинские новости. – 2006. – № 10 (136). – С. 106–110.