Экспрессия гена и белка марганцевой супероксиддисмутазы в клетках с p53 (+/+) и p53 (-/-) геномом

Вид материала

Диплом

Содержание Глава 1. обзор литературы 5 Глава 2. материалы и методы исследования 29 Белок p53 как транскрипционный фактор. Роль p53 в регуляции клеточного цикла. 1.1.4. Роль p53 в регуляции гибели клеток. 1.1.5 P53 как «хранитель генома». 1.2.Антиоксидантная система. Таблица 1. Первичные радикалы, образующиеся в нашем организме Таблица 2. Вторичные радикалы Образуется в реакции Lo•+lh = loh+l• Гидроксильный радикал (ОН Синглетный кислород (О 1.2.3 Основные ферменты АОС. P53 зависимая регуляция гена супероксиддисмутазы. Глава 2. Материалы и методы исследования. 1 цикл +72С 3 мин Электрофорез ДНК 3.1.Активация экспрессии p53 в MCF-7. 3.2. Изменение экспрессия гена sod2 в клетках MCF-7 и H1299 при действии актиномицина D. Рис. 5. Зимограммы SOD в клетках MCF-7 ... Полное содержание

Подобный материал:

• Курс лекций 1999-2000, 11782.85kb.
• Николай Владимирович Максимович, Игорь Арсениевич Стогов, Андрей Эдуардович Фатеев,, 1978.73kb.
• Чистякова Елена Андреевна Открытый урок, 128.48kb.
• 1. 1 Природа генів, 282.45kb.
• Вопросы к экзамену по курсу «Молекулярная биология» (вечернее отделение), 36.64kb.
• Урок №94 тема. Основные этапы биосинтеза белка, 33.42kb.
• Методическая разработка урока по теме «Биосинтез белка», 59.93kb.
• Молекулярный уровень, 31.47kb.
• Всероссийская олимпиада школьников по обществознанию 2007/2008 гг. Региональный этап., 139.44kb.
• Лекция 2: Принцип Дирихле. Формулировка: Если в n "клетках", 166.11kb.

Министерство образования и науки Российской Федерации

Ивановский государственный университет


Кафедра физиологии человека и животных


ДИПЛОМНАЯ РАБОТА


Тема:

Экспрессия гена и белка марганцевой супероксиддисмутазы

в клетках с p53 (+/+) и p53 (-/-) геномом

при действии актиномицина D.


Дипломник Бородич Полина Борисовна

Руководитель к.б.н., А.А. Терентьев,

к.б.н., доцент В.Н.Зарипов


Допустить к защите:

Зав. кафедрой к.б.н., доцент В.Н. Зарипов

«___»_____________ 2005 г.


Иваново

2005

Оглавление


ВВЕДЕНИЕ 3

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5

1. Структура и функции p53 5
   

1. Структура белка p53 5
   
2. P53 как фактор транскрипции 7
   
3. Роль P53 в регуляции клеточного цикла 9
   
4. Роль p53 в регуляции клеточной гибели 11
   
5. P53 как «хранитель генома» 13
   
1. Антиоксидантная система 15
   

1.2.1. Активные формы кислорода: их происхождение и роль

биологических системах 15

1.2.2. Оксидативные повреждения клеток 20

1.2.3. Антиоксидантная система. Основные ферменты

антиоксидантной системы. Основные механизмы действия

супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы,

глутатионпероксидазы 22

3. Взаимодействие между антиоксидантной
   

системой и p53 25

1. Строение промотора марганцевой
   

супероксиддисмутазы 25

2. P53 зависимая регуляция гена супероксиддисмутазы 26
   

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 29

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И

ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 35

ВЫВОДЫ 45

ЛИТЕРАТУРА 47


Введение


Опухолевый супрессор белок p53 играет важную роль в регуляции экспрессии ряда генов и деления клеток [Чумаков П.М., 2000]. Более чем в половине опухолей человека (50-60%) обнаруживаются мутации гена p53 [Копнин Б.П., 2001]. В связи с этим большое значение имеет изучение механизмов функционирования и регуляции p53 для изучения процессов возникновения злокачественных заболеваний, их профилактики и терапии.

Многочисленные сигнальные пути контролируют состояние клетки и в случае возникновения повреждений или сбоев вызывают активацию p53 [Чумаков П.М., 2000]. В ответ на стресс активированный p53 вызывает два крупных клеточных события: либо остановку клеточного цикла, либо запрограмированную клеточную смерть – апоптоз. Эти процессы предотвращают распространение клеток, содержащих поврежденную ДНК. Индукция этих процессов обусловлена действием p53 как активатора транскрипции. Кроме того, активация p53 может приводить к окислительному стрессу, ведущему к апоптозу [Polyak et all., 1997].

Митохондриальная марганцевая супероксиддисмутаза (MnSOD), продукт гена супероксиддисмутазы 2 (sod2), является одним из главных клеточных барьеров против окислительного стресса и основным ферментом антиоксидантной системы (АОС), которая регулирует уровень активных форм кислорода (АФК) в клетках [Дубинина Е.Е.,1989]. MnSOD, осуществляющая детоксикацию АФК, катализирует дисмутацию супероксид радикала в перекись водорода и кислород, осуществляя детоксикацию АФК.

Таким образом, p53 и Mn-СОД функционально взаимосвязаны. Целью данной работы является исследование реакции гена sod2 и белка SOD2 на ДНК-повреждающие воздействия в условиях функциональной и нефункциональной p53-зависимой системы.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить и вырастить культуры клеток MCF7 (p53 (+/+) геном) и H1299 (p53 (-/-) геном).
   
2. Создать условия для активации p53 путём обработки клеток ActD.
   
3. Исследовать реакцию p53 при действии ActD.
   
4. Исследовать экспрессию гена sod2 в клетках при действии ActD.
   
5. Исследовать активность белка MnSOD в клетках при действии ActD.
   

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Структура и функции белка p53.

1. Структура белка p53.
   

Продукт гена p53 человека имеет молекулярную массу 53 кДа и состоит из 393 аминокислотных остатков [Чумаков П.М., 2000]. Он образует тетрамерный комплекс, способный регулировать транскрипцию ряда генов, имеющих в своём составе специфические последовательности ДНК. Элемент ДНК, с которым связывается p53, состоит из двух расположенных друг за другом на расстоянии от 0 до 13 нуклеотидов "полусайтов", имеющих обобщённую структуру типа: PuPuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy (Pu – пурин, Py – пиримидин) [Kern S.E. et all, 1991; Funk W.D. et all, 1992].

На белковой молекуле p53 расположено несколько функционально-значимых доменов, играющих важную роль в осуществлении или регуляции его активности.

Участок на N-конце (1-50 аминокислоты) представляет собой домен, ответственный за транскрипционную активацию генов-мишеней [Tan M. et all, 1999]. Он обладает способностью связываться с компонентами базальных факторов транскрипции, в частности с субъединицами комплекса TFIID hTAFII3, hTAF₇₀, комплекса TFIID, а также с транскрипционным коактиватором транскрипции p300/CBP [Копнин Б.П., 2000]. Этот домен также участвует в белок-белковых взаимодействиях, регулирующих стабильность молекулы p53. Фосфолирирование нескольких остатков серина и треонина, расположенных в транскрипционном домене, повышает активность p53 [Чумаков П.М., 2000; Копнин Б.П., 2000]. В области между аминокислотами 43 и 73 расположен второй трансактивационный домен, активность которого требуется для активации некоторых мишеней p53 [Venot C., 1999].

Между аминокислотами 63 и 97 расположен пролин-богатый домен, который важен для полного проявления опухолесупрессорной активности p53 [Чумаков П.М., 2000].

Центральный домен p53 между аминокислотами 100 и 300 принимает непосредственное участие в узнавании ДНК и связывании со специфическими последовательностями ДНК-регулируемых генов [Tan M. et all, 1999].Структура данного домена играет исключительную роль в проявлении активности p53 в качестве транскрипционного фактора. Именно в этом домене локализуется большинство миссенс-мутаций p53, обнаруживаемых при различных злокачественных заболеваниях человека. При этом наблюдаются две характерные особенности. Во-первых, почти каждая аминокислота этого домена с той или иной частотой может мутировать в опухолях, и давать белок с нарушенной активностью. Этот факт свидетельствует об исключительной хрупкости конформации p53. Во-вторых, в центральном участке p53 выявлены области, по которым мутации происходят с повышенной частотой (горячие точки мутаций). Рентгеноструктурный анализ комплекса ДНК с ДНК-связывающим доменом p53 указывает на то, что именно аминокислоты горячих точек вовлечены в непосредственный контакт со специфической последовательностью ДНК [Копнин Б.П., 2000].

Участок, ответственный за ядерную локализацию, расположен между аминокислотами 305 и 323 [Чумаков П.М., 2000]. Далее следует α-спиральный домен, ответственный за тетрамеризацию молекул p53 (аминокислоты 323-356) [Чумаков П.М., 2000]. Утрата способности p53 к олигомеризации при нарушении структуры этого домена приводит к функциональной инактивации [Tarunina M., Jenkins J.R., 1993].

C-концевой участок p53 (аминокислоты 363-393) играет важную роль в регуляции активности p53. Этот домен является мишенью для целого ряда ферментов. Некоторые исследователи называют этот домен ингибиторным [Копнин Б.П., 2000], так как в немодифицированном состоянии он препятствует связыванию ДНК-связывающего домена со специфической последовательностью регулируемого гена. В этом случае молекула p53 находится в неактивном (латентном) состоянии. Фосфолирирование и ацетилирование p53 вызывают изменение конформации белковой молекулы и переход p53 из неактивного состояния в активное. В результате ДНК-связывающие домены освобождаются от блокирующего влияния ингибиторных доменов и приобретают способность узнавать на p53-связывающие элементы [Копнин Б.П., 2000].

Сложная организация доменов p53 и их многофункциональность делают белок p53 полифункциональным. Помимо активации транскрипции он может выступать как транскрипционный репрессор [Ginsberg D., 1991], фактор, ингибирующий трансляцию некоторых мРНК [Ewen M.E., Miller S.J., 1996]. Имеются сообщения о наличии у p53 способности непосредственно связываться с участками одноцепочечной ДНК, участками неспаренных оснований и однонитевых разрывов, что указывает на возможность его непосредственного участия в узнавании повреждённых участков ДНК и в репарационных процессах [Копнин Б.П., 2000]. Однако основной функцией p53, безусловно, является его способность служить фактором транскрипции.

2. Белок p53 как транскрипционный фактор.
   

Активация транскрипционных функций p53 наблюдается при самых разнообразных стрессах и внутриклеточных нарушениях: УФ- и γ-облучении, присутствии в клетке повреждённой ДНК, понижении внутриклеточного пула нуклеотидов, ингибировании ДНК- и РНК-полимераз, гиперэкспрессии онкогенов, вирусной инфекции, гипоксии, оксидативном стрессе и др. [Чумаков П.М., 2000].

Ключевую роль в стабилизации белка p53 и повышении его транскрипционной активности играют изменения взаимодействия p53 с белком-ингибитором Mdm2, ген которого является потенциальным онкогеном. Этот белок, представляющий собой p53-специфическую убиквитин-лигазу, связывается с N-концом молекулы p53 и стимулирует его убиквитинирование и, как результат, протеасомную деградацию белка p53. Кроме того, связываясь с N-концевым участком p53 в районе домена, взаимодействующего с базовыми факторами транскрипции, Mdm2 подавляет способность p53 транс-активировать гены-мишени [Копнин Б.П., 2000]. В результате, несмотря на то, что ген p53 постоянно транскрибируется и транслируется, сам белок быстро подвергается убиквитин-зависимой деградации, и при этом даже не успевший распасться p53 не проявляет активности [Чумаков П.М., 2000].

При возникновении повреждений ДНК происходит фосфолирирование p53 по сайтам Ser15, Ser20, Ser33,Ser37, расположенным в районе связывания гена с белком Mdm2. Такое фосфолирирование осуществляют спецефические киназы (ANV, ATR), которые активируются в ответ на разнообразные нарушения структуры ДНК [Копнин Б.П., 2000]. В результате конформация N-концевого участка p53 меняется таким образом, что он теряет способность связываться с Mdm2. Таким образом, p53 стабилизируется в ядре и приобретает способность связывать базальные транскрипционные факторы [Чумаков П.М., 2000].

Для полной транскрипционной активации p53. Для усиления необходима модификация C-концевого участка p53. Эти изменения "запускаются" дефосфолирированием Ser376, которое также происходит при возникновении повреждений ДНК, а также ацетилированием p53 [Копнин Б.П., 2000].

Таким образом, последовательные пост-трансляционные модификации N-концевого и C-концевого участков p53 вызывают увеличение количества белка p53 в клетке, приобретение им способности связывать специфичные элементы и поставлять к генам-мишеням базальные факторы транскрипции (компоненты комплекса TFIID РНК-полимеразы II и гистоновые ацетилазы p300/CBP, деконденсирующие хроматин), стимулируя тем самым их транскрипцию.

2. Роль p53 в регуляции клеточного цикла.
   

Известно, что продвижение по клеточному циклу обеспечивается сменяющими друг друга активностями различных циклин-зависимых киназ (Cdk) [Копнин Б.П., 2000].

Циклин-зависимые киназы – это семейство АТФ-зависимых протеинкиназ, схожих по структуре и функции. Главная структурная особенность семейства – это наличие определённых конформационных препятствий, не позволяющих Cdk самостоятельно связывать субстраты в активном центре. Для связывания субстратов необходимо взаимодействие этих киназ с циклинами. При взаимодействии циклина с Cdk конформация последней меняется таким образом, что активный центр «открывается», и аминокислотные остатки, ответственные за связывание ATP, перемещаются к активному центру [Morgan D.O., 1997].

Для каждой Cdk существует один или несколько циклинов, способных образовывать с ней комплексы. Уровень циклинов периодически меняется в ходе клеточного цикла: в каждой стадии активен определённый комплекс циклин-Cdk. Так, комплекс циклин D-Cdk4 (или циклин D-Cdk6, в зависимости от типа клеток) активируется при переходе из покоящегося состояния (G0) к пролиферации. Комплекс циклин E-Cdc2 активен в поздней G1, а циклин A-Cdk2 – в фазах S и G2. Поздняя G2 и переход к митозу контролируется комплексом циклин B-Сdc2.

Одним из мощных ингибиторов Cdk является эффекторный ген p53 – белок p21^Waf1/Cip1 из семейства Cip/Kip [Tailor S.J., Shalloway D., 1996]. Повышение его экспрессии в ответ на гиперэкспрессию p53 [Furuno N., den Elzen N., Pines J., 1999] и повреждение ДНК [Thjmpson L.J., Fields A.P., 1996] вызывает остановку клеточного цикла в поздней G1 фазе. P21^waf1/cip1 связывается с комплексами циклин E/Cdc2, тем самым подавляя их способность фосфорилировать белки семейства Rb-негативных регуляторов транскрипционных факторов семейства E2F, активность которых необходима для входа клеток в S фазу [Tailor S.J., Shalloway D., 1996].

Дублирующим механизмом остановки перехода из G1 в S фазу является подавление активированным p53 транскрипции гена DP1 – транскрипционного фактора, который связывается с E2F и образует активный комплекс, собственно и активирующий синтез продуктов, необходимых для входа в S фазу. Многие исследователи [Копнин Б.П., 2001] обнаружили, что p53 повышает экспрессию гена Siah1, продукт которого стимулирует деградацию b-катенина – транскрипционного фактора, активирующего транскрипцию гена циклина D и онкогена Myc, что вносит дополнительный вклад в остановку клеточного цикла в G1.

Центральную роль в протекании S фазы играет ДНК – полимераза δ, которая ответственна за репликацию ядерной ДНК. P21^waf1/cip1 может взаимодействовать с C-концевым доменом “ядерного антигена пролиферирующих клеток” (PCNA) и таким образом может уменьшать процессивность ДНК – полимеразы [Luo Y., Hurwitz J., Massague J., 1995]. Возможно, следствием этого является переключение репликативного синтеза на преимущественно репаративный [Gamard J.et all, 1994].

Идентифицирован также ряд генов-мишений p53, продукты которых вызывают остановку в фазе G2. Задержка в ней наблюдается в случае, когда p53 активировался уже после того, как клетка прошла G1 фазу [Копнин Б.П., 2001]. Активированный p53 подавляет функцию комплекса циклин B/Cdc2. Во-первых, он трансактивирует ген 14-3-3σ, белковый продукт которого связывает и транспортирует комплексы циклин B/Cdc2 в цитоплазму [Chan T.A. et all, 1999]. Во-вторых, p53 трансактивирует ген GADD45, белковый продукт которого обладает способностью связывать Cdc2, разрушая таким образом комплексы циклин B/Cdc2 [Zhang H.S. et all, 2000]. В-третьих, p53 репрессирует транскрипцию генов циклина B и Cdc2, что уменьшает синтез их продуктов [D'Santos C.S. et all, 1999].

Следует заметить, что, как и в случае остановки клеточного цикла в G1 фазе, задержка в G2 фазе при повреждении ДНК наблюдается и в клетках с инактивированным p53: она происходит в результате подавления функций фосфатаз Cdc25 (Cdc25А при остановке в G1 и Cdc25С при остановке в G2), активирующих соответствующие циклинзависимые киназы. Однако в клетках с нарушенной функцией p53 происходит лишь кратковременная задержка в клеточного цикла, а активация p53 обеспечивает его длительную остановку, предотвращающую размножение клеток с поврежденной ДНКдо исправления дефекта.


1.1.4. Роль p53 в регуляции гибели клеток.

Число p53-регулируемых генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, невелико, в отличии от огромного и до сих пор растущего числа потенциальных медиаторов p53-зависимого апоптоза. Такое многообразие объясняется тем, что в клетках разных тканей, а также в клетках, находящихся в различных физиологических условиях, могут реализоваться альтернативные программы p53-зависимого апоптоза. При этом p53 контролирует синтез двух основных путей индукции апоптоза: митохондриального и стимулируемого «рецепторами смерти» [Копнин Б.П., 2000].

Одним из генов, принимающих участие в индукции митохондриального апоптоза, является ген BAX. Продукт этого гена кодирует проапоптический белок семейства Bcl2 [Oltvai Z.N., Korsmeyer S.J., 1994], который способствует выбросу из митохондрий цитохрома C [Rosse T. Et all, 1998]. В комплексе с APAF1 цитохром c принимает участие в активации каспазы 9, запускающей апоптозный каскад [Srinivasula S.M., 1998]. Повышение проницаемости митохондриальной мембраны для цитохрома c достигается и трансактивацией гена p53AIP1 (его продукт локализуется в митохондриальной мембране и уменьшает мембранный потенциал) и группы генов PIG [McCurrach M.E., 1997]. Гены этой группы вызывают образование в клетке радикалов активного кислорода, которые приводят к повреждению мембран митохондрий и запуску апоптоза [Чумаков П.М., 2000]. В одном из этих генов (PIG3) был обнаружен p53-связывающий элемент, который в отличие от большинства известных p53 элементов, требует для своей активации пролин-богатый домен белка p53 [Venot C., 1998].

Стимуляция апоптоза, запускаемого “рецепторами смерти” достигается трансактивацией генов двух из таких рецепторов – Fas и Killer/DR5. Активация гена Fas-рецептора (APOI1) повышает чувствительность клеток к Fas-лиганду, который вызывает тримеризацию Fas/APOI1, после чего его цитоплазматический «домен смерти» связывается с адаптерной молекулой FADD [Owen-Schaub L.B., 1995]. В результате происходит активация в комплекс прокаспазы 8, которая, инициирует апоптозный каскад. Доказано, что p53 может инициировать апоптоз с участием Fas/APOI1-рецептора и по независимому от транскрипции механизму, вызывая быструю транслокацию APOI1 из аппарата Гольджи на поверхность клетки [Bennett M., 1998]. Killer/DR5 является одним из рецепторов, активируемых TRAIL-лигандом [Ashkenazi A., Dixit V.M., 1997]. Так же как и представители других рецепторных индукторов апоптоза, Killer/DR5 инициирует запуск каспазного каскада.

Выявлены и другие p53-респонсивные гены: IGF-BP3, PAG608, p85, циклин G.[Чумаков П.М., 2000]. Белок-ингибитор инсулиноподобного фактора роста IGF-BP3 кодируется p53-зависимым геном. Цитокин IGF является мощным антиапоптозным фактором [Harrington E.A., Fanidi A., Evan G.I., 1994]. IGF индуцирует Mdm2 , вызывая понижение активности p53 [Leri A., 1999]. IGF-BP3 снимает его эффекты и тем самым индуцирует апоптоз. Одновременно с активацией IGF-BP3 p53 подавляет экспрессию самого IGF [Prisco M., 1997]. PAG608 относится к группе белков, содержащих домен «цинковый палец». Он преимущественно локализуется в ядрышках и вызывает при гиперэкспрессии морфологические изменения, характерные для апоптоза [Чумаков П.М., 2000]. Белок p85 является регуляторной субъеденицей P13 киназы [Yin Y., 1998]. P85 требуется для P53-зависимого апоптоза, хотя детали его участия в этом процессе остаются неясными [Чумаков П.М., 2000]. Гиперэкспрессия гена циклина G приводит к подавлению пролиферации и усилению апоптоза, вызванного разными воздействиями [Okamoto K., Prives C., 1999].

P53 может индуцировать апоптоз и через другие механизмы, не связанные с его способностью изменять экспрессию генов-мишений. Например, мутантные p53, утратившие транскрипционную активность (в результате делеции C-концевого участка или мутаций в кодонах 22-23), сохраняют тем не менее способность индуцировать апоптоз в некоторых типах клеток. Предполагается, что это явление обусловлено белок-белковыми взаимодействиями p53 [Копнин Б.П., 2000].

Таким образом, при повышении функциональной активности белка p53 происходит одновременно активация нескольких путей индукции апоптоза, что, по-видимому, обеспечивает надёжность его реализации.


1.1.5 P53 как «хранитель генома».

Многие исследователи часто дают гену p53 образное название «страж генома», так как этот ген координирует все основные процессы поддержания стабильности генома многоклеточного организма [Копнин Б.П, 2001; Чумаков П.М., 2000; Tan M. et all, 1999].

Молекулы белка p53 могут находиться в различных конформационных состояниях, в которых они обладают разными биохимическими активностями и выполняют разные физиологические функции. Как известно, в обычных условиях p53 находится в неактивной (латентной) форме, в которой он обладает слабой транскрипционной активностью. Но в такой форме p53 способен связывать белки репарационной машины, проявляет активность 3’–5’-экзонуклеазы и стимулирует рекомбинацию и репарацию ДНК [Чумаков П.М., 2000].

При различных стрессах и внутриклеточных повреждениях происходят пост-трансляционные модификации, такие как фосфолирирование и ацетилирование определённых аминокислот молекулы p53, определяющие её переход в так называемую стрессовую конформацию [Копнин Б.П, 2001]. Такая форма белка p53 является более стабильной и эффективно трансактивирует или трансрепрессирует специфические гены-мишени, следствием чего является остановка клеточного цикла или апоптоз. Кроме того, активация p53 ведёт к изменению экспрессии генов некоторых секретируемых факторов, в результате может изменяться размножение и миграция не только повреждённой, но и окружающих клеток. При этом, находясь в стрессовой конформации, p53 в значительной степени утрачивает активности, стимулирующие рекомбинацию или репарацию ДНК [Копнин Б.П, 2001; Чумаков П.М., 2000].

Многие процессы в клетке имеют тканеспецефический характер. Соответственно этому в разных клетках могут меняться требования к p53-зависимому контролю. Например, высокая пролиферативная активность клеток кишечного эпителия и органов кроветворения требует настройки p53 на повышенную степень готовности. В таких клетках даже незначительные повреждения ДНК могут проводит к p53-зависимому апоптозу. Но в редко делящихся клетках, например гепатоцитах, в физиологических условиях роль p53 менее заметна [Чумаков П.М., 2000].

Активность p53 регулируется сложными и тонкими механизмами. Если рассматривать p53-зависимую систему элиминации патологических клеток в виде сигнального пути, то на верхних «этажах» будут располагаться процессы распознавания повреждений, стрессов и сбоев. Далее эти воздействия должны сходиться на p53 , вызывая качественные и количественные изменения его экспрессии и активности. Нижние «этажи» этого пути будут включать эффекторные гены, на которые влияет p53 в том или ином состоянии. В результате разворачивания процессов, опосредуемых генами-мишенями p53, клетка подвергается апоптозу или окончательному прекращению делений, вступая в состояние преждевременного клеточного старения [Чумаков П.М., 2000].

Таким образом, p53 играет важную охранную роль. Одна из основных его функций, по видимому, заключается в распознавании и исправлении ошибок, неизменно возникающих в ходе репликации ДНК. При масштабных повреждениях ДНК, внутриклеточных нарушениях или угрозе их возникновения происходит переключение функций p53: приобретая транскрипционную активность и изменяя экспрессию генов-мишеней, он вызывает либо остановку размножения патологических клеток, либо их гибель. В результате устраняется возможность накопления в организме генетически изменённых клеток. Повреждения в ДНК могут возникать не только при действии внешних факторов. Существуют эндогенные факторы, приводящие к повреждениям клеточных мембран, белков и ДНК – активные формы кислорода (АФК). Защита от АФК осуществляется антиоксидантной системой клеток.


1.2.Антиоксидантная система.

1.2.1. Активные формы кислорода: значение в биологических системах и происхождение.

Кислород играет ключевую роль в биоэнергетике большинства живых существ. Он служит окислителем питательных веществ при дыхании животных, растений, грибов и бактерий. Наряду с окислительным фосфорилированием, в которое вовлекается 90% потребляемого кислорода, в живых организмах постоянно протекают реакции с образованием активных форм кислорода (АФК).

Активные формы кислорода – группа свободнорадикальных молекул, являющихся частично восстановленными производными кислорода (О₂^-) и обладающих очень мощной окислительной способностью. Отличительными особенностями данных свободнорадикальных молекул является наличие неспаренного электрона на внешнем энергетическом уровне, высокая химическая активность, малое время жизни и способность инициировать цепные реакции окисления [Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., 1992].

В норме АФК вырабатываются при аутоокислении катехоламинов, флавинов, хинонов, тиолов, при окислении гемоглобина, в процессе синтеза простагландинов, лейкотриенов, тромбоксанов, в результате респираторного взрыва фагоцитирующих клеток [Ленинджер А.,1985], при восстановлении О₂ в дыхательной цепи митохондрий, а также при окислении ксенобиотиков и эндогенных субстратов в митохондриальной цепи транспорта электронов. Существуют экзогенные источники АФК – ионизирующее излучение, табачный дым, пестициды, консерванты и некоторые питательные вещества [Дубинина Е.Е., 1989]. Изменение редокс-статуса клетки при действии АФК или других свободных радикалов, приводящее к специфическим ответам, патологии или разрушению клеточных структур, называется окислительным стрессом [Комов В.П., 2004].

Все радикалы, образующиеся в организме, можно разделить на природные, которые постоянно образуются в клетках, и чужеродные, появляющиеся при таких воздействиях, как ионизирующее излучение, ультрафиолетовое облучение или даже освещение интенсивным видимым светом, например, светом лазера. В свою очередь природные радикалы можно разделить на первичные, вторичные и третичные. Образование первичных радикалов осуществляется при участии определенных ферментных систем; эти радикалы выполняют «полезные» для организма функции. Из первичного радикала – супероксида, а также в результате других реакций в организме могут образоваться очень активные молекулярные соединения: перекись водорода, гипохлорит и гидроперекиси липидов. Под действием ионов металлов переменной валентности, в первую очередь – ионов Fe²⁺, из этих веществ образуются вторичные свободные радикалы, такие как радикал гидроксила и радикалы липидов, которые оказывают разрушительное действие на клеточные структуры [Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., 1992].

Основными свободными радикалами в организме являются следующие активные формы кислорода:

О₂^- – супероксидный анион радикал;

О₂¹ – синглетная форма кислорода;

ОН^• – гидроксильный радикал;

Н₂О₂ – перекись водорода.