Лабораторная диагностика генитальных инфекций
| Вид материала | Документы |
СодержаниеКультура клеток |
- «клинико-лабораторная диагностика урогенитальных инфекций у женщин», 217.42kb.
- О. Г. Крамарь 2010 г. Тематический план, 50.75kb.
- О. Г. Крамарь «29» августа 2011 г. Тематический план, 27.12kb.
- Эпидемиологическая характеристика и лабораторная диагностика урогенитальных инфекций,, 298.26kb.
- Программа «Основы сестринского дела» для специальности: «Лабораторная диагностика», 272.46kb.
- Рабочая программа основы цитологии Индекс сд. 08 По специальности (название, код):, 700.41kb.
- Рабочая программа гистология с гистологической техникой Индекс сд. 03 По специальности, 1648.19kb.
- Методика исследования специального оборудования не требуется. Для сбора кала используют, 74.49kb.
- Требования к минимуму содержания основной профессиональной образовательной программы, 126.97kb.
- 1 курс Лабораторная диагностика 2011/2012 учебный год, 122.48kb.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ.
Неудачи применения репродукционных технологий могут зависеть, наряду с многими известными и пока неизвестными причинами, также и от микробных поражений половых органов мужчин и женщин. Диагностика их в силу частого бессимптомного течения инфекционного процесса базируется на лабораторных исследованиях. Если в отношении основных венерических болезней (сифилис, гонорея) существуют достаточно твердые диагностические критерии, то в отношении других агентов, передаваемых половым путем, такие критерии, хотя и существуют, но зачастую не выполняются.
Предпосылкой к лабораторной диагностике генитальных инфекций является знание нормальной микрофлоры половых органов, т.е. микробиоценоза гениталий. У женщин для определения микробиоценоза гениталий готовят препараты на предметных стеклах, обычно двух для двух способов окраски. На каждое из стекол помещают отделяемое заднего свода влагалища, шейки матки и дистального отдела уретры. Щеточкой, ватным тупфером или бактериологической петлей нанесенный материал распределяют тонким слоем. Одно стекло окрашивают по Граму, второе - 1% водным раствором метиленовой сини. Просмотр производят с помощью иммерсионного объектива ґ90 (окуляр ґ10 или ґ7). В нескольких полях зрения регистрируют количество клеток эпителия, лейкоцитов, слизи, наличие бактерий и их морфологические типы.
Нормальный физиологический микробиоценоз характеризуется присутствием слущенных клеток вагинального (цервикального или уретрального) эпителия, единичных в поле зрения лейкоцитов, умеренного количества слизи и доминированием среди бактерий крупных грамположительных палочек - лактобацилл. Это состояние с начала 20 столетия обозначают как I степень чистоты или R - I (R - Reinheit, от немецкого слова "чистота").
R - II, т.е. вторая степень чистоты характерна для женщин, отмечающих наличие белей негнойного характера. При микроскопии мазков у таких женщин видно умеренное количество клеток эпителия, 5 - 10 лейкоцитов в поле зрения, небольшое количество лактобацилл и разные морфологические типы бактерий - грамположительные и грамотрицательные палочки и кокки (так называемая смешанная микрофлора). Иногда лактобациллы совсем не видны, а количество смешанной микрофлоры велико, иногда видны извитые формы - вибрионы (Mobiluncus). При посеве определяется рост анаэробных бесспоровых палочек и кокков, генитальных микоплазм (M. hominis, U. urealyticum). В резко выраженной форме эта картина микробиоценоза соответствует диагнозу бактериальный вагиноз.
R - III, т.е. третья степень чистоты или третья картина микробиоценоза, клинически проявляет себя наличием гнойных влагалищных выделений. В мазках-препаратах все поле зрения занято большим количеством дегенерированных лейкоцитов и разнообразных морфотипов бактерий с преобладанием грамположительных кокков. Лактобациллы, как правило, отсутствуют. Эта картина микробиоценоза требует применения посевов выделений на питательные среды, чтобы установить виды, а иногда и типы бактерий.
У мужчин для установления микробиоценоза микроскопические исследования не применяются, производится посев эякулята на кровяной агар. Рост бактерий в количестве, не превышающем 103 КОЕ/мл эякулята считается нормой, рост бактерий в большем количестве служит показанием для уточнения видового состава бактерий. Для диагностики заболеваний, передаваемых половым путем, приняты рекомендации для всех лечебно-профилактических учреждений в России (1998 г.), материалы публикуются также в журнале "Инфекции, передаваемые половым путем". В этих методических материалах подчеркивается, что среди многочисленных видов микроорганизмов, передаваемых половым путем, приоритет отдается высоко значимым инфекциям. Не останавливаясь на диагностике сифилиса и СПИД, которыми занимаются специализированные лаборатории, обратим внимание на методы диагностики гонореи, хламидиоза, трихомоноза, генитального герпеса и венерических бородавок.
Многочисленные диагностические тесты, предложенные производственными предприятиями и фирмами, по большей части из-за высокой стоимости, недоступны для большинства диагностических лабораторий, поэтому рассмотрим наиболее простые, относительно недорогие, приемлемые для большинства лечебно-профилактических учреждений.
При диагностике гонореи скрининговым тестом признана микроскопия мазков, окрашенных по Граму и метиленовой синью. При обнаружении грамотрицательных кокков, располагающихся внутриклеточно в цитоплазме лейкоцитов, диагноз считается установленным. Подтверждение возможно культуральным методом (мы пользуемся посевом на среду "Биокульт", фирмы Лабсистемс, Финляндия), а также применением ПЦР (используем наборы реактивов фирмы Литех, Москва).
В диагностике урогенитального хламидиоза много ложноположительных результатов, что может быть обусловлено неправильным взятием материалов для исследования, неправильным хранением до начала исследования и неадекватной обработкой материалов. Важно применять хорошие люминесцирующие моноклональные антитела для прямой иммунофлюоресценции (ПИФ). Наилучшие результаты дают наборы
Chlamyset antigen FA фирмы Орион (Финляндия) и Syva MicroTrak (США). Отечественные диагностические наборы уступают по качеству перечисленным зарубежным. Ложноположительные результаты получают при неправильной оценке характера люминесценции за счет неспецифической абсорбции конъюгата на разрушенные клеточные элементы. Выбор метода исследования и способ проверки результатов имеют важное значение. В таблице приводим сравнительные данные использования основных методов диагностики урогенитального хламидиоза (прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), культурального метода, иммуноферментного исследования (ИФА) и ПЦР).
Как следует из таблицы, выбор метода исследования зависит от того, какие участки тела надлежит исследовать. Иммуноферментные методы, например, нельзя применять при исследовании секционных материалов. При всех методах исследования решающее значение имеет правильность взятия материала, в частности, захват не только жидких выделений, но и клеток эпителия, поскольку хламидии - внутриклеточные паразиты. При использовании ПИФ правильность взятия материалов определяют по наличию в препарате клеток эпителия, а при использовании ПЦР - по присутствию в образце ДНК. Принимается во внимание обеспеченность специальным оборудованием с учетом сложности обработки исследуемого материала и чтения результатов теста. Чтение теста зависит от квалификации исследователя, к тому же микроскопия при использовании иммерсионного объектива утомляет зрение и вносит элемент субъективизма в оценку результата. Именно поэтому иммуноферментные методы и ПЦР, дающие возможность объективного чтения теста, наиболее приемлемы для скрининга, хотя чувствительность иммуноферментного метода считается недостаточно высокой.
Таблица 1. Достоинства и недостатки различных методов обнаружения C. trachomatis
| | ПИФ | Культура клеток | Иммуноферментные методы | ПЦР |
| Участки тела, которые можно обследовать | Любые | Большинство | Ограничения из-за неспецифичности реакций | Любые |
| Значение правильности взятия проб | Решающее | Решающее | Решающее | Решающее |
| Условия транспортировки проб | Если препарат фиксирован - условия не важны | Быстрая доставка или хранение при низкой температуре | Не имеет значения, если проба взята в буферный раствор | Быстрая доставка или хранение при низкой температуре; менее важно, чем для культуры клеток |
| Условия хранения | На короткое время - при +4 °С, на длительное - при -20 °С +4 °С - сутки. | Длительное хранение в жидком азоте 3-5 дней при +4 °С. | Замораживание снижает чувствительность | На короткое время +4 °С. На длительное - в жидком азоте |
| Проверка адекватности взятия материала | Мазки оценивают во время тестирования | Не практикуется | Не практикуется | Определяется, присутствует ли ДНК |
| Потребность в специальном оборудовании | Люминесцентный микроскоп | Центрифуга | Комплект для ИФА | Амплификатор и оборудование для электрофореза |
| Обработка проб | Простая | Трудоемкая | Становится проще для новых тестов | Требует строгой предосторожности, чтобы не контаминировать ДНК |
| Чтение теста | Субъективное и утомительное | Субъективное, умеренно утомительное | Объективное, простое | Объективное, простое |
| Время выполнения | 30 минут | 12-72 часа | 3 часа | 12-24 часа |
| Способы проверки результата | Повторный просмотр | Повторный просмотр | Повторение теста | Повторная проба или переваривание эндонуклеазой |
| Результат зависит от | опыта микроскописта | чувствительности клеточной культуры | присущей мощности теста | хорошего контроля и отсутствия контаминации |
| Использование как контроля лечения | Ограниченно | Рекомендуется | Ограниченно | Не практикуется |
| Способность к поддержанию штамма хламидий | нет | да | нет | нет |
Высокая чувствительность ПЦР привлекает все больше внимания к использованию ДНК - диагностики, однако следует помнить о необходимости соблюдения предосторожностей, чтобы не контаминировать посторонними ДНК исследуемых материалов. В таблице представлено время, необходимое для выполнения теста, а также способы проверки результата - обычно это повторение просмотра или повторение теста, иногда, как при использовании ПЦР - ферментное переваривание ДНК эндонуклеазой.
Весьма важным является вопрос о том, как можно и как нельзя использовать различные методы выявления хламидий при контроле лечения. Главным надежным методом установления эффективности проведенного лечения является культуральный метод (через 14 дней после окончания лечения). Следует помнить, что ПИФ и ИФА могут выявить еще не элиминированные антигенные субстанции Chlamydia trachomatis, поэтому применение этих методов ограничено и проводится через 3-4 недели после окончания лечения. Не рекомендуется использование для целей контроля лечения ПЦР.
Изложенное свидетельствует о том, что в диагностике урогенитального хламидиоза не всегда можно ограничиться одним методом исследования, и во всяком случае - однократным исследованием материала. В особенности, если речь идет о заболевании внутренних гениталий, например, о хламидийном поражении маточных труб и связанном с ним бесплодием. Серологические методы диагностики могут дать опору в установлении хламидийной этиологии процесса по наличию и концентрации антихламидийных антител. Обычно титр антител в этих случаях бывает высоким (1/128 - 1/256) за счет IgG.
Урогенитальный трихомоноз относится к числу сексуально трансмиссибельных инфекций и встречается в виде неосложненных и осложненных форм. Не осложненные формы - вульвовагинит у женщин и уретрит у мужчин - диагностировать относительно просто, т. к. взятие материала для исследования не представляет трудностей. Осложненные формы - эндометрит, сактосальпинкс, киста яичников у женщин и простатит, везикулит, эпидидимит, куперит у мужчин - требуют участия клиницистов гинекологов, урологов, лапароскопистов для получения клинических образцов для исследования.
Что касается методов исследования при трихомонозе, то предпочтение отдается микроскопии. Исследуются нативные препараты (висячая или раздавленная капля), распознавание в которых трихомонад облегчается характерной их подвижностью. Можно исследовать мазки, окрашенные 1% раствором метиленовой сини или по Граму. При диагностике осложненных форм полученный с трудом материал исследуют всеми возможными методами, включая культуральный метод и ПЦР. При выполнении культурального метода мы используем наборы "Вагикульт" фирмы Лабсистемс, Финляндия, при постановке ПЦР - наборы фирмы Литех, Москва.
К числу весьма распространенных в настоящее время генитальных инфекций относятся генитальный герпес и генитальная цитомегалия. Передача вирусов - возбудителей этих инфекций происходит при половом контакте. Несмотря на то, что подавляющее большинство взрослых людей имеют антитела к этим вирусам, иммунитета к реинфекции нет, а само заболевание носит рецидивирующий характер. Несмотря на возможность применения культурального метода исследования, все же для диагностики этих заболеваний (или состояний) используют метод прямой иммунофлюоресценции и ПЦР. По нашим данным, выявление данных вирусов в гениталиях женщин отмечено у 4% обследованных пациенток с одинаковой частотой при использовании ПИФ и ПЦР.
В диагностических целях используют также цитоморфологический метод - просмотр препаратов, окрашенных по Романовскому-Гимзе или гематоксилин- эозином. Наличие многоядерных гигантских клеток, характерных для герпетических поражений, и крупных клеток с характерными внутриядерными включениями ("совиный глаз") при цитомегалии позволяют поставить диагноз.
Среди вирусных инфекций гениталий за последние 10 лет большое внимание уделено папилломавирусной инфекции. Вирусы папилломы человека, вызывающие генитальные бородавки и кондиломы, в настоящее время принято рассматривать как трансформирующие агенты, причастные к опухолевому росту, в частности, к возникновению рака шейки матки и, возможно, других раковых образований. В диагностике папилломавирусной инфекции имеет значение определение типа папилломавирусов, т.к. лишь определенные типы вирусов причастны к опухолевой трансформации клеток. В диагностике папилломавирусов высокого онкогенного риска, осуществляемой молекулярно-биологическими методами, предложен высоко-эффективный метод, в котором происходит амплификация не мишени, а сигнала с помощью Digene Capture System II (двойной генной ловушки).
Весьма неоднозначно решается вопрос о генитальных микоплазмах - Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum. Хотя среди венерологов распространено применение терминов микоплазмоз и уреаплазмоз, позиции исследователей относительно роли микоплазм противоречивы. Одни из них считают U. urealyticum однозначно патогенным микроорганизмом, другие - условно патогенным, как и остальные виды генитальных микоплазм, третьи - комменсалами. Во всяком случае вопрос о том, могут ли генитальные микоплазмы вызывать моноинфекцию или лишь участвуют в ассоциации микроорганизмов, как это имеет место при бактериальном вагинозе, не решен. Вполне очевиден половой путь передачи генитальных микоплазм и их способность нарушать иммунологическую реактивность организма. Доказано участие этих микроорганизмов в патологических процессах во время беременности, при оперативных вмешательствах, при абортах. Доказано участие M. hominis в послеродовых осложнениях, в воспалительных заболеваниях придатков матки. Во всяком случае следует с осторожностью оценивать роль микоплазм как патогенных агентов при отсутствии выраженной клинической симптоматики. В диагностике предпочтение отдается культуральным методам с количественной оценкой роста, пренебрегая ростом единичных колоний микоплазм. В ряде российских медицинских учреждений в диагностических целях используют ПИФ, НИФ, ИФА и ПЦР. Наш опыт позволяет с уверенностью считать, что количественный культуральный метод дает больше опорных пунктов для диагностики заболевания и для проведения контроля эффективности лечения.
Бактериальный вагиноз, о котором мы упомянули при описании микробиоценоза гениталий, в настоящее время заменил собой термин "гарднереллез". Это состояние нарушенного микробиоценоза, обусловленное изменением гормонального статуса, патогенез которого еще не ясен. Половой путь передачи маловероятен. В диагностике заболевания наиболее удобна микроскопия нативного или окрашенного мазка, которая позволяет видеть массы микроорганизмов, налипшие на эпителиальные клетки - так называемые "ключевые клетки" (clue cells). Дополнительное измерение pH влагалища и добавление к влагалищным выделениям капли щелочи (10% раствора KOH) позволяют уточнить диагноз в случае повышенного pH (>5,5) и появления аминного запаха после добавления щелочи.
Выделение Gardnerella vaginalis нецелесообразно, поскольку не этот микроорганизм, а его ассоциация с анаэробами и генитальными микоплазмами характерны для бактериального вагиноза. Посевы влагалищных выделений при бактериальном вагинозе, по нашим данным, в 50-70% случаев дают рост M. hominis и U. urealyticum, что не является основанием для установления диагноза "микоплазмоз" или "уреаплазмоз".
В лечении бактериального вагиноза рекомендуется применение препаратов, активных в отношении неспорообразующих анаэробов (метронидазол, клиндамицин) с последующим лечением эубиотиками.
В практике нередки находки в выделениях из половых органов дрожжеподобных грибов рода Candida. Далеко не всегда такие находки следует оценивать как показатель микотического заболевания. Принято рассматривать наличие в микроскопическом препарате единичных клеток почкующихся дрожжей как нормальное состояние. Точно также рост единичных колоний дрожжеподобного гриба при посеве выделений из половых органов следует отнести к нормальному состоянию микробиоценоза. Лишь умеренный и обильный рост гриба и наличие клинических проявлений воспалительного характера служат основанием для установления диагноза микотического заболевания и проведения этиотропной терапии.
Необходимо отметить, что большие трудности испытывают клиницисты при чтении анализов, в которых указан обильный рост кишечных палочек, энтерококков, стрептококков группы В и зеленящих стрептококков в то время как клинически нет проявлений воспалительных заболеваний. Это отражение нарушенного микробиоценоза половых путей и, как правило, не требует коррекции с помощью антибиотиков. В этих случаях надлежит выяснить причину необычно обильной колонизации микробами полового тракта (заболевания мочевыделительных органов, дисбактериоз кишечника и т.п.).
В целом в лабораторной диагностике генитальных инфекций очень желателен и даже необходим контакт лечащего врача с лабораторией для совместной оценки микробиологических исследований и правильного назначения антибиотиков и других антимикробных препаратов. Безуспешное лечение бессимптомных генитальных инфекций, с нашей точки зрения, связано с применением неадекватных лекарственных препаратов или неправильным выбором метода контроля излеченности.
Центр профилактики сердечно-сосудистых заболеваний
36-я городская поликлиника г. Минска (Беларусь)