Geum.ru

Учебное пособие 2002

Вид материалаУчебное пособие

Содержание


Ход работы.
Ход работы.
Тема vi. культура гаплоидных клеток.
Ход работы.
Ход работы.
Подобный материал:
1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   12
ффективность высева =  100 %

количество высеянных клеток


Контрольные вопросы к теме IV.
  1. Что такое суспензионные культуры, и каковы основные способы их получения?
  2. Как определить степень агрегированности и жизнеспособности суспензий?
  3. Как подсчитать плотность суспензии?
  4. Каковы основные способы культивирования одноклеточных суспензий?
  5. В каких отраслях производства и науки используют суспензионные культуры?



ТЕМА V. ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
И ТКАНЕЙ.


Работа 1. Индукция органогенеза и соматического
эмбриогенеза в каллусной ткани табака под действием фитогормонов.


Объяснение. Фитогормоны – это биологические регуляторы роста и развития растений, осуществляющие взаимодействие клеток, тканей и органов, стимулирующие и ингибирующие морфогенетические и физиологические процессы в растительных организмах. Фитогормоны влияют на деление и рост клеток растяжением, состояние покоя, созревание, старение, формирование пола, устойчивость к стрессу, тропизмы, транспирацию; обеспечивают функциональную целостность растительного организма, закономерную последовательность фаз индивидуального развития.

По химической природе гормоны растений четко подразделяются на две группы: производные мевалоновой кислоты (гиббереллины, абсцизины, брассины, фузикокцин, цитокинины), производные аминокислот (ауксины –из триптофана, этилен – из метионина и аланина). Биосинтез фитогормонов происходит в определенных частях растений: в апексах побегов образуется ИУК– индолил-3-уксусная кислота, лист служит донором ключевого продукта синтеза гиббереллинов – каурена, а также абсцизовой кислоты, в апексах корней синтезируется кинетин, а в зоне растяжения корня – гиббереллины, источником зеатина является эндосперм проростающих семян.

По функциональному действию различают 5 основных групп фитогормонов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины и этилен. Ауксины в культуре тканей вызывают рост клеток растяжением, в больших концентрациях – деление клеток, в сочетании с цитокининами – органогенез. В биотехнологии применяют как природные ауксины (ИУК), так и синтетические [ИМК (индолил-З-масляная кислота), ИПК (индолил-З-пропионовая кислота), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), НУК(нафтилуксусная кислота)].

Цитокинины в сочетании с ауксинами индуцируют митозы, пролиферацию клеток, почек и побегов. К природным цитокининам относятся: зеатин, кинетин (6-фурфуриламинопурин), NN-дифенилмочевина (кокосовое молоко); к синтетическим – 6-БАП (6-бензиламинопурин).

Гиббереллины стимулируют рост клеток растяжением, а также синтез ауксинов и цитокининов. Сейчас известно около 60 видов гиббереллинов. В культуре ткани используется гибберелловая кислота.

Абсцизины (АБК – абсцизовая кислота) и этилен ингибируют ростовые процессы, деление клеток, в сочетании с цитокининами и хлорхолинхлоридом индуцируют органогенез (образование микроклубней).

Гормональная система тесно связана с генетическим аппаратом клетки. Фитогормоны не только влияют на степень метилирования ДНК и таким образом регулируют экспрессию генов, но и связываются с белками – репрессорами на опероне, что приводит к активации структурных генов и синтезу определенных ферментов. Следовательно, изменяя соотношение гормонов в питательных средах, можно в какой-то степени изменять и генетические программы клеток и тканей. Эти процессы известны как дедифференциация, редифференциация и дифференциация клеток и тканей.


Материалы и оборудование. Пробирки с каллусами табака, колбы на 50 мл со стерильном питательной средой (МС без гормонов), колбы со средами для стеблевого органогенеза и соматического эмбриогенеза и индукции ризогенеза, флаконы с 96 % спиртом, стерильные пинцеты и препарировальные иглы, спиртовка, ламинар-бокс.


Ход работы.

1. Стерильным пинцетом переложить каллусы на стерильную поверхность стола ламинар-бокса, разделить на кусочки 5х5 мм. и поместить в колбы с питательными средами, содержащими различные наборы фитогормонов.

2. Колбы перенести в культуральную комнату с температурой 25 + 2оС, влажностью воздуха 70 % и интенсивностью освещения 5кLх.
  1. Результаты эксперимента зарисовать через 2-4-6-8 недель.


Работа 2. Индукция деления клеток и роста клеток
растяжением под действием ауксина и гиббереллина.


Объяснение. В растении фитогормоны находятся в тесном взаимодействии друг с другом: ИУК индуцирует синтез этилена и цитокининов, ГК увеличивает содержание ИУК, цитокинины усиливают синтез МУК, но снижают содержание свободной АБК, этилен тормозит транспорт ИУК и увеличивает содержание АБК.

В культуре ткани фитогормоны, добавленные в различных пропорциях, регулируют синтез эндогенных гормонов растений, что проявляется в разнообразных морфогенетических реакциях клеток и тканей.

В 1955 г. Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной регуляции в культуре клеток и тканей, которая сейчас известна, как правило Скуга-Миллера: если концентрация ауксинов и цитокининов в питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов незначительно превосходит концентрацию цитокининов, то образуется каллус; если концентрация ауксинов значительно превосходит концентрацию цитокининов, то формируются корни; если концентрация ауксинов значительно меньше концентрации цитокининов, то образуются почки, побеги.

Фитогормоны способны изменять проницаемость клеточных мембран. Под действием ауксинов и гиббереллинов усиливается выброс протонов из клетки, что приводит к подкислению клеточной стенки и ослаблению связей между целлюлозными фибриллами в результате частичного кислотного гидролиза пектиновых веществ. Поэтому клеточная стенка становится более эластичной и под действием тургорного давления вакуоли клетка приобретает способность к растяжению.


Материалы и оборудование. Семена пшеницы и тритикале, колбы с дистиллированной водой, 6 % хлорамин, чашки Петри с растворами гормонов, стерильные пинцеты, спиртовки, 96% спирт , ламинар-бокс.


Ход работы.

1.Отобрать 30 здоровых семян пшеницы или тритикале.

2. Семена простерилизовать в растворе хлорамина в течение 5 минут.

3. Промыть семена автоклавированной водой 3 раза.

4. Стерильным пинцетом поместить семена в чашки Петри с дистиллированной водой, раствором 2,4-Д (5-10 мг/л), раствором гибберелловой кислоты (2-4 мг/л).

5.Закрыть чашки Петри и поместить в термостат при температуре 25 + 2оС и влажности воздуха 70 %.

6.Результаты опыта зарисовать через 2-4 недели.


Контрольные вопросы к теме V.

1. Что такое фитогормоны, и какие процессы в растительных клетках и тканях они стимулируют?

2. Какие группы фитогормонов стимулируют и ингибируют рост и развитие растений?

3. Как осуществляется гормональная регуляция в культуре клеток и тканей?

4. Какова химическая природа фитогормонов, и в каких органах растения они синтезируются?
  1. Каким образом гормональная система влияет на генетический аппарат клетки?


ТЕМА VI. КУЛЬТУРА ГАПЛОИДНЫХ КЛЕТОК.


Работа 1. Получение каллусов из пыльников вишни
и яблони.

Объяснение. Гаплоидия является таким уменьшением числа хромосом, при котором в половинном наборе соматической и половой клеток каждая пара гомологичных хромосом представлена лишь одной из них. Гаплоидом или моноплоидом называют организм, имеющий в соматических клетках гаплоидный набор негомологичных хромосом. Генотип гаплоидов имеет характерные особенности. У гаплоидов проявляются рецессивные гены. Гаплоиды по внешнему виду сходны с соответствующими диплоидами, но меньше их. Клетки гаплоидов имеют меньший размер, чем клетки диплоидов. Гаплоиды не образуют полноценных гамет. Путем удвоения числа хромосом соматических клеток гаплоида можно получить полностью гомозиготное диплоидное растение.

Гаплоиды получают, используя гаплопродюссеры (отдаленную гибридизацию), партеногенез. Гаплоиды можно получить в культуре тканей из пыльников и клеток зародышевого мешка, гаплоиды в культуре тканей уже получены у 200 видов растений.

Для большинства растений оптимальным сроком посадки пыльников на питательные среды является стадия "средних" или "поздних" одноядерных вакуолизированных микроспор. На этой стадии микроспоры высвобождаются из тетрад и готовятся к первому митозу.

Для культивирования пыльников используют среды: Мурасиге-Скуга с 1/2 концентрацией солей, китайские среды, среды с картофельным экстрактом, среду Нич. Ауксины либо вообще не добавляют, либо используют 2,4-Д. Из цитокининов применяют кинетин и 6-ЬАП. Агар-агар тщательно промывают, так как он содержит вещества неблагоприятно влияющие на развитие пыльников. Для адсорбции метаболитов ингибирующих ростовые процессы в культуре тканей в питательные среды добавляют активированный уголь.

Перед культивированием пыльники выдерживают при температуре 4-6о С в течение 2-8 суток. Изолированные пыльники культивируют либо в темноте, либо при слабом освещении при температуре 25 + 2о С.

]На питательных средах микроспора может образовать каллус или гаплоидныи зародыш (сначала образуется 40-50-клеточный проэмбрио). Зародыш в глобулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные развитию зиготического зародыша. Пыльца делится, клетки увеличиваются, экзина разрывается и образуется каллус, на котором, варьируя соотношение фитогормонов, можно получить гаплоидные эмбриоиды. Получение гаплоидов биотехнологическими методами позволяет быстро создавать гомозиготные линии, что делает данную технологию весьма ценной для селекции и генетики.

В процессе культивирования изолированных пыльников на питательных средах развитие идет двумя путями: либо прямым андрогенезом (образованием эмбриоидов и гаплоидных растений-регенерантов), либо косвенным андрогенезом, когда репродуктивные клетки дедифференцируются и переходят к пролиферации, образуя сначала каллус, а затем при пассировании на специальные среды – морфогенный каллус и регенеранты.


Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, бутоны вишни и яблони, пробирки со средою для каллусогенеза, препарировальные иглы, пинцеты, флакон с 96 % спиртом, 6 % раствор хлорамина, вата, фольга.


Ход работы.
  1. Бутоны стерилизуют в 6 % растворе хлорамина 10 минут, для этого поместить бутоны в марлевый мешочек по 20 штук в каждый и опустить в стакан со стерилизующим раствором, затем тщательно промыть бутоны (5-6 раз) стерильной дистиллированной водой.
  2. Перенести бутоны на стерильную поверхность стола ламинар-бокса, осторожно отделить пыльцевые мешки от тычиночных нитей.
  3. Стерильной препарировальной иглой перенести пыльники на поверхность питательною среды в пробирки по 5-10 пыльников в каждую.
  4. Закрыть пробирки и перенести в термостат с температурою 26о С и влажностью 70 %.
  5. Результаты работы зарисовать через 2-4 недели.


Работа 2. Получение растений-регенерантов из пыльцевых каллусов вишни.


Объяснение. Способность каллусов к морфогенезу определяется балансом фитогормонов как в питатальных средах, так и в самих клетках (эндогенные фитогормоны). Для получения растений-регенерантов используют среды, содержащие кинетин – 0,1-0,3 мг/л, ГК – 4 мг/л, 6-БАП – 0,5-1,5 мг/л, ИУК – 0,5-1,5 мг/л. Каллусы культивируют при 16 часовом фотопериоде и интенсивностью освещения 2-3 кLх.

Морфогенный каллус имеет плотную консистенцию, бугристую поверхность, молочно-белый, желтоватый и зеленоватый цвет.

Поверхностные слои морфогенного каллуса состоят из меристематических, богатых цитоплазмою клеток, имеющих заполненные крахмалом пластиды и хорошо развитые митохондрии. Центральная часть каллуса представлена крупными вакуолизированными клетками с пикнотическими ядрами, которые чередуются с меристематическими участками.

Для индукции побегообразования, каллусы переносят на среды для регенерации: МС + кинетин – 1-2 мг/л, 6-БАП – 3-6 мг/л, аденин – 1-2 мг/л, ГК – 1-2 мг/л, феруловая кислота – 0,5-0,7 мг/л, ИУК – 0,2-0,4 мг/л, НУК – 0,2-0,4 мг/л, ИМК – 0,2-0,4 мг/л, 2,4-Д – 0,1-0,3 мг/л.

Через 1,5-2 месяца культивирования морфогенных каллусов на 16-ти часовом фотопериоде при освещенности 3 кLх начинается пролиферация почек и побегов. Морфогенные каллусы пассируют каждые 4-6 недель.

Побеги-регенеранты, полученные из пыльцевых каллусов, неоднородны по морфологическим признакам. Это обусловлено гетерогенностью каллусов. Поэтому необходимо проводить цитологическое изучение и каллусов и растений-регенерантов.


Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, спиртовки, флаконы с 96 % спиртом, пробирки с пыльцевыми каллусами, пробирки со средами для получения морфогенного каллуса, пробирки со средами для регенерации, препарировальные иглы, пинцеты.


Ход работы.
  1. В условиях ламинар-бокса извлечь каллус из пробирки и перенести на стерильную поверхность. Стерильной препарировальной иглой выделить зону морфогенного каллуса (белые мелкие клетки, каллус средней плотности).

2. Стерильной препарировальной иглой перенести кусочек (5-6 мм) морфогенного каллуса в пробирку со средой для регенерации, закрыть пробирку стерильной пробкой.

3.Перенести штативы с пробирками в световую культуральную комнату с температурой 25 + 2о С, влажностью 70 %, освещенностью 4 кLх.

4. Через 4-6 недель зарисовать результаты работы.

5. Побеги перенести в пробирки со средами для пролиферации побегов: МС +1-2 мг/л 6-БАП, 1 мг/л НУК.
  1. Перенести побеги на среды для индукции корнеобразования: МС без гормонов, МС +1-2 мг/л ИМК + 1мг/л ГК и поместить на 20 дней в темноту.


Контрольные вопросы к теме VI.
  1. Для чего используются гаплоиды в селекции и генетике?
  2. Как получить морфогенный каллус из пыльников?
  3. Каковы основные способы получения гаплоидных и дигаплоидных растений-регенерантов?

ТЕРМИНОЛОГИЯ