Geum.ru

Учебное пособие 2002

Вид материалаУчебное пособие

Содержание


Ход работы.
Ход работы.
Подобный материал:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   12
Материалы и оборудование. Клубни картофеля, кюветы с песком, флаконы с водой, кюветы с проращенными и прошедшими термотерапию растениями, ламинар-бокс, бинокулярный микроскоп МБС-9 или МБС-10, стерильные скальпели, препарировальные иглы, флаконы с 96 % спиртом, хлорамином, спиртовки, пробирки с питательными средами.


Ход работы.
  1. Здоровые клубни картофеля тщательно промыть проточной водой.
  2. Клубни обработать стерилизующим раствором (спирт, хлорамин), промыть проавтоклавированной водой.
  3. Вырезать глазки с частью паренхимы (1,5  1,5 см) и поместить в кюветы для проращивания и термотерапии.
  4. Проростки, прошедшие термотерапию, поместить в 6 % раствор хлорамина на 5 минут, промыть стерильной дистиллированной водой.
  5. В ламинар-боксе под микроскопом вычленить апикальные меристемы и поместить их в пробирки с питательными средами.
  6. Весь растительный материал перенести в культуральную комнату.
  7. Результаты зарисовать через 2-4-6-8 недель.


Работа 7. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА МЕТОДОМ ХИМИОТЕРАПИИ В СОЧЕТАНИИ С МЕТОДОМ
АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ.


Объяснение. Для химиотерапии используют специальные вещества-ингибиторы вирусов: ферменты, влияющие на нуклеиновые кислоты (РНК-азы). Непосредственную обработку клубней ферментом можно проводить методом инфильтрации в вакуумной камере в течение 20 минут, что приводит к большому расходу вещества. Поэтому эффективнее добавлять РНК-азы в питательные среды для культивирования апексов.

РНК-аза стимулирует рост и развитие растений из апексов и ингибирует развитие вирусов. В результате применения такой технологии выращивания на 10-35 % повышается приживаемость меристем на питательных средах, на 30-40 % больше образуется растений-регенерантов.


Материалы и оборудование. Пробирки с питательными средами, ламинар-бокс, фильтры Зейтца, стерильная бидистиллированная вода, флаконы с 96 % спиртом, спиртовки, микроскопы МБС-9 или МБС-10, стерильные инструменты (скальпели, препарировальные иглы, пинцеты), раствор РНК-азы (0,01 н), химическая посуда (колбы на 50-100 мл, стаканы на 50-100 мл, мерные цилиндры), проростки картофеля.


Ход работы.
  1. Раствор РНК-азы профильтровать через фильтр Зейтца, добавить в 100 мл среды Мурасиге-Скуга и разлить в пробирки с застывшей стерильной средой до 0,5 см.
  2. Простерилизовать проростки картофеля в 6 % хлорамине 5 минут.
  3. Проростки промыть стерильной дистиллированной водой и поместить в стерильные чашки Петри.
  4. В условиях ламинар-бокса под микроскопом вычленить апикальные меристемы и поместить на среды без фермента (контроль) и с ферментом (опыт).
  5. Пробирки с меристемами перенести в культуральную комнату.
  6. Результаты зарисовать через 2-4-6 недель, сделать выводы.


Контрольные вопросы к теме 2.
  1. Что такое микроклональное размножение растений: основные этапы?
  2. Каковы основные способы микроклонального размножения?
  3. Как получить безвирусный посадочный материал?
  4. Какой из способов получения безвирусного посадочного материала Вы бы предпочли в своей работе?
  5. Чем отличаются питательные среды для пролиферации побегов, индукции корнеобразования, культивирования меристем, получения микроклубней?
  6. Как протестировать посадочный материал на степень заражения вирусами?


ТЕМА Ш. ДЕДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ И КАЛЛУСОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ.


Работа 1. Получение каллусов из листьев табака.


Объяснение. Каллусная клетка, в результате деления которою возникает каллус, представляет собой один из типов клеточной дифференцировки. Для растения in vivo каллус – это группа клеток, возникающая при травмах и защищающая место поранения (раневая паренхима). В ней накапливаются питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа.

Дифференцированные клетки объединяются в растении в ткани и выполняют определенные функции. Клетки различаются не только функционально, но и морфологически.

На питательных средах с большим содержанием ауксинов (2,4 Д) клетки экспланта дедифференцируются и переходят к пролиферации. Особенности дедифференциации клеток экспланта зависят от генетики и эпигенетики экспланта. Клетки утрачивают прежние функции и морфологию. Причем, чем меньше структурно и химически дифференцирована клетка, тем легче получить каллус.

В клетке, готовящейся к делению, стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ДНК, исчезают специфические тканевые белки-антигены, синтезируются новые, специфичные для каллусных клеток. Меняется активность структурных генов и белкового аппарата клеток. Дедифференциация специализированных клеток начинается с обогащения их элементами цитоплазмы: микротрубочками, мембранами ЭПС и комплекса Гольджи, рибосомами, исчезают хлоро- и хромопласты, продукты их деятельности; может образоваться много ядер или увеличиться число хромосом; укрупняются вакуоли.

Каллус, выращиваемый поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенную структуру. Клетки каллуса либо бесцветны, либо имеют желтоватый оттенок. В зависимости от происхождения и условий культивирования различают каллусы: рыхлые, с сильно оводненными, легко отделяющимися друг от друга клетками; средней плотности, с зонами меристематическои активности; плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.

В биотехнологии, для отработки методик культивирования, чаще всего используют те виды растений, которые и в обычных условиях легко укореняются, регенерируют, образуют каллус. Поэтому большинство методов получения и культивирования каллуса разработано для табака. Каллусы можно получить практически из любой части растения, так как клетки табака легко дедифференцируются и переходят к пролиферации. Для культивирования каллусов из листьев табака используют среду Мурасиге-Скуга с добавлением ауксинов (2,4 Д).