Биопрепаратов
| Вид материала | Автореферат диссертации |
- Научно-исследовательская работа на тему: Получение биопрепаратов из крови крупного, 239.84kb.
- Доклад Н. А. Феоктистовой Об итогах выполнения плана профилактических противоэпизоотических, 179.54kb.
- Эффективность применения удобрений и биопрепаратов на урожайность хлопчатника в условиях, 483.84kb.
- Клубом Органического Земледелия, ставящим перед собой такие цели: рассказ, 2161.81kb.
- Краткий отчет о научно-исследовательской деятельности фгуп «государственный научно-исследовательский, 84.53kb.
На правах рукописи
ПОПОВА
Вера Михайловна
РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
ПРИ ПРОМЫШЛЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ
БИОПРЕПАРАТОВ
03.01.06-биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Щелково – 2011
Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук
Научный консультант: доктор биологических наук Нежута Александр Александрович
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный ветеринарный врач РФ Мельник Николай Васильевич
доктор ветеринарных наук, профессор Владимир Викторович Субботин
доктор биологических наук Владимир Егорович Козлов
Ведущая организация - ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»
Защита состоится 9 декабря 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП;
тел/факс: (495) 526-43-74; e-mail: vnitibp@mail.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП).
Автореферат разослан “….” …………2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Развитие биотехнологии обусловлено общим прогрессом науки и техники. Совершенствование промышленной технологии производства биопрепаратов наиболее успешно осуществляется при совместном решении биотехнологических и технических вопросов. Разработка биотехнологических процессов при культивировании клеток, вирусов и бактерий, выделении энзимов является актуальной проблемой при получении эффективных биопрепаратов (Грачев В.М., 1985; Спиер Р.Е. и Гриффитс Дж., 1989; Елинов Н.П., 1995; Дьяконов Л.П., 2000; Хапчаев Ю.Х., 2003; Жарникова И.В., 2004; Беклемишев А.Б., 2004; Албулов А.И., 2004; Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., 2005; Соловьев Б.В., 2005; Тихонов И.В., 2005; Гуславский А.И., 2007; Жданова Н.А., 2009).
Разработка современных технологий в производстве биопрепаратов требует переоснащения оборудования, использования высокоэффективных методов и перспективных материалов, что обеспечит выпуск конкурентоспособной продукции.
Одной из важнейших задач производства биопрепаратов является совершенствование методов культивирования (клеток, вирусов и бактерий) с использованием отечественного оборудования и учетом качественных характеристик препарата. Способ управляемого глубинного культивирования нашел широкое применение в производстве бактерийных препаратов, который за короткое время позволяет получить максимальное количество бактериальной массы. Одной из проблем при культивировании клеток животных и вирусов является поддержание жизнеспособности клеток. Наряду с распространенными стационарным и динамичным (роллерным) способами культивирования клеток и вирусов суспензионное культивирование привлекает внимание исследователей при изготовлении вакцин и диагностических препаратов для максимального накопления клеток и получения вируссодержащего материала (Новохатский А.С., 1979; Лукина В.А., Слепенко Т.Б., Сенько Е.Ф., 1981; Рубан Е.А., Соловьев Б.В., Самуйленко А.Я, 2005). Суспензионный и псевдосуспензионный (на микроносителях) методы культивирования микроорганизмов создают равноценные условия по всему объему сосуда, позволяют контролировать и регулировать необходимые параметры (рН, рО2, еН, t), осуществлять контроль роста клеток, исключать возможность контаминации, способствовать экономии питательной среды (Сергеев В.А., 1976; Голубев Д.Б., Сомнина А.А., Медведева М.Н., 1976; Осидзе Д.Ф., 1976; Новохатский А.С., 1979; Тарасов В.П., 1990; Гаврилюк Б.К., Сафронов В.П., 1981; Ночевный В.Т., 1994; Дьяконов Л.П., Ситьков, 2000; В.И. Хапчаев Ю.Х., 2003; Тихонов И.В., Рубан Е.А., Самуйленко А.Я, 2005; Жданова Н.А., 2009). Осуществление крупномасштабного культивирования клеток в суспензии и на микроносителях в реакторах специального назначения отечественного производства связано со сложностью обеспечения стерильности процесса. Исключение контаминации культуральной жидкости посторонней микрофлорой и попадания продуктов биосинтеза в окружающую среду, поддержание, контроль и регулирование процессом являются важнейшими факторами.
В производстве вирусных вакцин при дезинтеграции клеток используют в основном импортный протеолитический ферментный препарат трипсин. Совершенствование технологии с целью получения фермента высокой активности сопряжено с использованием методов очистки и сушки препарата, что позволит создать конкурентоспособную продукцию с заданными свойствами и провести импортзамещение.
Важными этапами при приготовлении питательных и защитных сред, сывороток, ферментов в производстве вирусных вакцин и бактерийных препаратов являются их очистка, разделение и концентрирование, стерилизация. Выбор методов их осуществления представляет сложную задачу, и зависит от качественной характеристики жидкости (Тихонов И.В., 2005). Применение мембранных способов очистки, разделения и концентрирования позволяет создать экологически безопасные, энергосберегающие технологические процессы (Фридлянский И.И., 1976; Дытнерский Ю.И.; 1986, Платэ Н.А., 1999; Тимашов С.Ф., 2000; Шапошник В.А., 2001; Дубяга В.П., Бесфамильный И.Б., 2005; Свитцев А.А., 2007; Гуславский А.И., 2007; Андреева И.С., 2009).
Таким образом, совершенствование технологии культивирования в биореакторах вирусных и бактерийных препаратов, получение отечественного препарата трипсина, разработка различных способов очистки, разделения, концентрирования биологических жидкостей с учетом современных достижений биотехнологии (в настоящее время) являются актуальными.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка и совершенствование биотехнологических процессов в производстве ферментов и биопрепаратов, при получении трипсина и культивировании клеток, при очистке и фильтровании биологических жидкостей с использованием современного оборудования и материалов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- усовершенствовать технологию промышленного производства трипсина;
- разработать способ иммобилизации трипсина на полимерном носителе и получения теплостойких композиций; определить токсичность полимерных материалов с помощью пастерелл и культур клеток;
- усовершенствовать способы культивирования клеток животных при получении противовирусных препаратов с применением современного оборудования и материалов;
- усовершенствовать способ глубинного культивирования золотистого стафилококка St. aureus для получения биологически активного протеина А;
- усовершенствовать технологию различных методов очистки биологических растворов при микрофильтрации, ультрафильтрации и электродиализе:
определить область применения безасбестовых материалов и мембранных фильтров для предварительной, тонкой и стерилизующей фильтрации, при разделении и концентрировании жидкостей с использованием отечественного оборудования;
разработать технологию получения очищенного альбумина, применяемого в качестве компонента питательной среды при культивировании лептоспир с помощью ультрафильтрации и электродиализа.
Научная новизна. - Усовершенствована технология производства трипсина с применением способов центрифугирования при разделении суспензии после экстрагирования и высаливания фермента и последующего распылительного или сублимационного высушивания, обеспечивающих высокое качество препарата, не требующих его дополнительного измельчения и просеивания препарата.
- Разработана промышленная технологическая линия производства трипсина с использованием современного оборудования. Технология испытана в опытно-промышленных условиях, получен патент РФ № 2403285 от 04.06.2009 “Способ получения трипсина” (оп. 10.11. 2010 бюл. № 31. – С. 743).
Усовершенствован способ очистки и концентрирования трипсина методом ультрафильтрации через разделительные модули на полых волокнах с обеспечением подачи жидкости центробежным насосом.
- Разработан способ иммобилизации протеолитического фермента трипсина, сохраняющего свойства при длительном хранении и обладающего активностью на уровне контроля, обеспечивающего получение жизнеспособных клеток, более высокий выход при культивировании в сравнении с нативной формой.
- Определены технологические параметры культивирования перевиваемых линий клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 в суспензии и псевдосуспензии на микроносителях в биореакторах с магнитным приводом и аэрацией культуры.
- Разработан модуль технологической обвязки для биореакторов (0,005; 0,025; 0,1; 0,25м3). Отработана технология культивирования перевиваемых клеток в биореакторах с использованием специализированного отечественного оборудования, оснащенного фильтрами тонкой очистки воздуха и пара с фильтрующими элементами из пористого титана; запорной малогабаритной и регулирующей арматурой, обеспечивающей осуществление технологических операций в автоматическом режиме.
- Разработаны полимерные композиции, которые применены в биологическом оборудовании в качестве конструкционного материала, стойкие к биологическим и химическим средам, температурным факторам (авторские свидетельства: № 384361 бюл. - 1973. - № 43. - С.167; № 701129 бюл. – 1979. - № 44. – С.193; № 770126 бюл. - 1980. - № 37. – С.308; № 783311бюл. - 1980. - № 44. – С.110).
- Впервые в отечественной ветеринарной практике разработана технология и использован метод обессоливания альбумина с помощью электродиализа для повышения эффективности процесса очистки растворов от солей.
Практическая значимость. На основании проведенных исследований по разработке и усовершенствованию технологических процессов получения ферментов и биопрепаратов разработана нормативная и технологическая документация.
“Технологический регламент производства трипсина сухого для вирусологических целей”, утвержденный 01.06.1995 г., директором ВГНКИ и директором ГНУ ВНИТИБП.
“Технические условия ТУ 9358.013.00008064-96 “Трипсин сухой для вирусологических целей”, утвержденные 04.03.1996 г., директором ВГНКИ и согласованные 07.03. 1996 г. Департаментом ветеринарии МСХ РФ.
“Наставление по применению трипсина сухого для вирусологических целей”, утвержденное 04. 03. 1996 г. № 13-6-2/540, Департаментом ветеринарии МСХ РФ.
Разработана технологическая схема производства трипсина. Технология изготовления трипсина освоена в ГНУ ВНИТИБП и НПО “Синтез” (г. Курган), на Алма-Атинском и Омском биокомбинатах. Опытно-промышленные серии трипсина использованы для получения первичных и перевиваемых культур клеток при производстве противовирусных вакцин на Курской и Армавирской биофабриках, Омском и Алма-Атинском биокомбинатах.
Определены условия культивирования клеток в биореакторах, разработан Технологический регламент “Культивирование клеток и вирусов с использованием экспериментальных образцов оборудования“, утвержденный директором ГНУ ВНИТИБП 28.12.1985 г. Разработана технологическая схема процесса культивирования клеток и вирусов в аппаратах (реакторах). Технология культивирования клеток и вирусов использована в производстве противовирусных вакцин и диагностических препаратов при ИРТ, ПГ-3, РС, ВД-БС АВИ, бешенстве, болезни Марека (БМ).
- Разработаны и предложены в качестве конструкционного материала полимерные композиции, стойкие к биологическим и химическим средам, температурным факторам. Во ВНИТИБП организован участок по изготовлению полимерных материалов, предложен комплект пресс-форм для изделий биотехнологического назначения.
- Усовершенствована предварительная, тонкая и стерилизующая фильтрация биологических растворов с помощью материалов на безасбестовой основе. Определены условия и возможность использования в биопромышленности экологически безопасных, исключающих фазовые переходы, процессов микрофильтрации и ультрафильтрации; усовершенствован метод очистки альбумина с помощью электродиализа при получении питательной среды для культивирования лептоспир в промышленных условиях.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
- технологические процессы изготовления трипсина;
- разработка способа иммобилизации трипсина на полимерном носителе и получения теплостойких композиций; определение токсичности полимерных материалов с помощью пастерелл и культур клеток;
- усовершенствование технологии культивирования перевиваемых клеток животных при получении вирусных препаратов суспензионным и псевдосуспензионным способами (на микроносителях) в биореакторах;
- усовершенствование глубинного культивирования золотистого стафилококка St. aureus для получения биологически активного протеина А;
- усовершенствование предварительной, тонкой и стерилизующей фильтрации биологических растворов (питательных сред, раствора трипсина, сыворотки крови и других) с помощью фильтровальных материалов на безасбестовой основе;
- совершенствование процессов микрофильтрации и ультрафильтрации в биопромышленности с использованием современных фильтровальных материалов и оборудования;
- технология обессоливания альбумина с помощью электродиализа в условиях промышленного производства.
Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке целей и задач исследований, решении поставленных задач, планировании эксперимента и выполнении исследований, обобщении результатов и использовании их в практике.
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены:
- на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИТИБП (1980-2009 гг.) в виде ежегодных отчетов по заданиям научно-технической программы (НТП) (1980-2009 гг.), фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса (АПК) Российской Федерации (РФ) на 2006-2010 гг.;
- на 23 Всесоюзных, Республиканских, Международных и Всероссийских, совещаниях, семинарах, конференциях, посвященных научным и практическим проблемам технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов и биотехнологии, проводившихся в Москве, Владимире, Щелкове, Волжске, Курске, Сергиев-Посаде, Покрове, Краснодаре, (1981-2009 гг.);
- на секции “Ветеринарная биотехнология” (2011 г).
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 71 научной работе, в том числе 11 в рецензируемых изданиях, входящих в перечень ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторской диссертации. Получено 6 авторских свидетельства и патентов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 292 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, приложения, содержит 40 таблиц и 52 рисунка. Список литературы включает 457 наименований, из которых 358 отечественных и 99 зарубежных. В приложении представлены копии документов, подтверждающие достоверность работы, ее научную и практическую значимость.
Автор выражает признательность академику РАСХН А.Я. Самуйленко за научно-методическую помощь в организации и проведении исследований.
Искреннюю благодарность за руководство НИР и ОКР автор приносит А.И. Гуславскому, Е.Э. Школьникову, В.П. Гайденко, Б.В. Соловьеву, И.Н. Матвеевой, а также В.А. Лукиной, В.С. Иванову, Е.А. Рубану.
Практическую и консультативную помощь в выполнении некоторых разделов диссертации оказывали сотрудники института Н.И. Гвозденко, Н.М. Пухова, Л.А. Скороходова, В.Н. Егорова, А.А. Раевский, А.А.Потемкин, В.Н. Качалов, Е.И. Ярыгина, Е.П. Сапегина, Ю.Д. Фролов, В.Н. Еремец, Л.В. Анисимова, С.М. Панферова, Н.И. Назаркина, И.Б. Пивикова, А.Б Абрамов, В.Е. Васько, М.А. Фролова, а также сотрудники ВГНКИ В.Т. Ночевный, Н.А. Башашкина, Ставропольской биофабрики - А.П. Сурмило, НПО порошковой металлургии - М.П. Анащенко, ВНИИ ЦБП - А.В. Канарский.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена в 1980-2010 гг. согласно планам НИР и ОКР ГНУ ВНИТИБП в соответствии с отраслевыми научными программами, в рамках Российской научно-технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации.
Экспериментальные исследования осуществляли в лабораториях и отделах института, во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ВГНКИ). Практическую реализацию научно-исследовательских разработок осуществляли на Щелковском, Омском и Алма-Атинском биокомбинатах, Ставропольской, Курской, Краснодарской биофабриках, НПО “Синтез” (г. Курган).
2.1. 1. Материалы
Питательные среды и растворы. В работе использовали культуральные среды Игла, 199, гидролизат лактальбумина; растворы Хенкса и Эрла; трипсин импортного (“Difko”, “Ferak“, “Merk“) и отечественного производства ТУ 9358013.00008064–96; сыворотки крупного рогатого скота (КРС), овец; защитные среды: сахарозо-альбуминовую (СФГА) и сахарозо-желатозную (СФГЖ); разбавитель вируса и раствор концентрата разбавителя для противовирусных вакцин (ТУ 9384-001-93840700-00).
Для изготовления вакцины против лептоспироза животных применяли питательную среду ГНКИ, в которой использовали альбуминовую фракцию сыворотки крови овец; для культивирования Staphylococсus aureus - бульон Хоттингера и мясопептонный бульон (МПБ).
Культуры клеток. В экспериментах использовали первичные культуры клеток (ПКК) различного происхождения – почек крольчат (ПК), щенков (ПЩ), кошек (ПКШ), эмбрионов коров (ПЭК), фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) и перепелов (ФЭП); а также перевиваемые линии клеток: почки сирийского хомячка (ВНК-21), почки теленка (ПТ-80), почки крупного рогатого скота (MDBK), почки собаки (MDCK), почки свиньи (СПЭВ) (Ночевный В.Т., Башашкина Н.А., 1996-1999).
В качестве доноров были взяты: 1-4 - недельные крольчата, 1-2 - месячные щенки и котята, 3-9 - месячные эмбрионы коров, 6-10 - дневные перепелиные и 6-14 - дневные куриные эмбрионы.
Вирусы. Оценивали чувствительность тест-культур клеток к вирусам болезни Ауески (ВБА) штамма БУК-682, парагриппа -3 (ПГ-3) - штамма МВА 1/44, инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота – штамма МВА 1/80, энтерита собак (ПВЭС) – штамма С и Д, болезни Марека, вируса герпеса индеек (ВГИ) – штамма ФС-126, инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц – штамма “Био-92”, чумы плотоядных - штамма (ЭЛМ). Работы проводилась совместно с ВГНКИ.
Staphylococсus aureus (St. aureus). Штамм золотистого стафилококка А-676 использовали для выделения протеина А (Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича).
Микрофильтрационные мембраны “Владипор”, изготовленные из ацетатацеллюлозы и регенерированной целлюлозы - МФА-А с размером пор 0,2-0,5 мкм, МФА-МА (0,2-0,5 мкм) и МФЦ (0,15; 0,2; 0,45 мкм), а также капроновые мембраны “Мифил” производства АН Белорусской ССР (г. Минск) и г. Таллин (5,0; 3,0 и 0,2 мкм), мембраны фирм “Millipor” и “Pall” (0,45 и 0,22 мкм и микропористые ядерные фильтры (от 0,03 до 8 мкм) использовали для очистки биологических жидкостей и растворов.
Ультрафильтрационные мембраны УАМ-50, 100, 150, 200, 300, 500 с диаметром пор - 0,005; 0,01; 0,015; 0,02; 0,03; 0,05 мкм (ацетат целлюлозы) и полупроницаемые мембраны в виде полых волокон типа ВПУ-5ПА, ВПУ-15ПА, ВПУ-50ПА, ВПУ-100ПА из полиамида с пределом задержания по белку 5, 15, 50, 100 кДа применяли для очистки и концентрирования биологически активных веществ.
Глубинные фильтры. При фильтровании биологических жидкостей применяли материалы на безасбестовой основе в виде пластин и картона: - фильтр-пластины - ФП (предварительной очистки), ФТ (тонкой очистки), ФC (стерилизующие), ФД (для удаления пирогенов) и картон КФМП и КФБЖ, разработанные по нашим техническим требованиям Марийским филиалом Волжского научно-исследовательского института целлюлозно-бумажной промышленности для медико-биологических целей (Канарский А.В., 2000).
Ионообменные мембраны. В работе применяли катионитовые мембраны МК-40 и анионитовые мембраны МА-41 из полиэтилена и ионитов.
Полимерные композиции. Сополимеры винилиденфторида и гексафторпропилена (фторкаучуки СКФ-26) и винилиденфторида и перфторметилвинилового эфира (СКФ-260) использовали для получения полимерных композиций и при иммобилизации трипсина; и кремнийорганические фторсилоксановые каучуки CКТФТ-100, CКТФТ-50.
2.1.2. Оборудование
Оборудование для культивирования клеток, вирусов, микроорганизмов и ферментов. Для получения первичных культур клеток и выращивания вирусов использовали роллерные аппараты. Монослойное культивирование клеток осуществляли на многотрубчатом культиваторе V=0,006 м3 в отделе вирусологии и культур клеток. Культивирование клеток и вирусов в суспензии и на микроносителях осуществляли в спиннере объемом 0,001 м3 и ферментерах (биореакторах) объемом 0,005; 0,025; 0,1; 0,25 м3, разработанных ГНУ ВНИТИБП и Иркутским НИИХМ, выполненных из нержавеющей стали, оснащенных магнитным приводом / Гуславский А.И./, датчиками температуры, рН, еН, рО2 /Рубан Е.А., Раевский А.А., Абрамов А.Б., Потемкин А.А./.
В технологической обвязке использовали запорную, запорно-регулирующую арматуру (малогабаритные вентили сильфонные проходные МВСП и угловые вентили МВСУ, разработанные ЦКБарматуростроения; электроисполнительные механизмы ЭИМ и запорные клапаны с электромагнитным приводом ПТ 26525, разработанные ВНИИэлектропривод и ЦКБарматуры по технико-экономическим требованиям ГНУ ВНИТИБП и изготовленные ПО ”Пензтяжпромарматура“). Для очистки, стерилизации и обезвреживания отработанных газов использовали фильтры предварительной и тонкой очистки с фильтроэлементами диаметром 46; 75; 90; 120 мм из фторопласта – 4 и титана (с диаметром пор 12-20 мкм и 2-6 мкм).
Глубинное культивирование штамма St. aureus, применяемого для выделения протеина А, проводили в лабораторном биореакторе АК-210 (объемом 0,01м3), с автоматическим контролем и регулированием температуры, скорости перемешивания, аэрации, рН.
При получении трипсина использовали следующее оборудование: электромясорубку МП, эмалированные и нержавеющие реакторы (объемом 0,060-1,0м3), нутч-фильтры, центрифуги (осадительно-фильтрующие ОФСст 0,1 и 0,2 м3/час; суперцентрифугу ОТР-101К; шнековую ОГШ), саморазгружающиеся и камерные сепараторы. Сушку фермента проводили на распылительных установках РСЦ 1,2/09 БК РСЦ-10 и “Минор” фирмы “Ниро-Атомайзер” и сублимационных - ТГ-15, ТГ-50.
Оборудование для фильтрования и разделения. Для тонкого и стерилизующего фильтрования водных растворов, биологических жидкостей, питательных сред, ферментных растворов с помощью мембранных фильтров использовали фильтродержатели диаметром 90, 142, 293 мм и мультиплетную установку УСФ-0,28/7. Мембранное разделение различных растворов осуществляли на фильтрационных ячейках ФМ-02 объемом 10, 200, 1000 мл с магнитной мешалкой, тонкоканальной установке ФТ-01, опытной ультрафильтрационной установке “фильтр-пресс” УФ-5, и ультрафильтрационных разделительных модулях на полых волокнах фирмы Мем-Текс (РФ г. Мытищи): УВА-2-5ПА, УВА-2-15ПА, УВА-2-50ПА, УВА-2-100ПА и модифицированной установке УФУ с центробежным насосом марки ЦНГ-0,5/10. Электродиализатор типа ЭК-04-74 с ионообменными мембранами (катионитовыми МК-40 и анионитовыми МА-41) использовали при обессоливании альбумина в производственных условиях. При электродиализе происходит перенос ионов из одного раствора в другой через ионообменные мембраны. Движущей силой процесса является внешнее электрическое поле. Катионы двигаются к катоду, а анионы к аноду. Постоянный ток, проходящий через раствор, устанавливается в зависимости от природы растворенных веществ, их концентрации и подведенного напряжения.
Для разделения культуральных жидкостей, выделения клеток, вирусов, ферментов, сбора осадка, белка из надосадочной жидкости, осветления суспензий применяли различные центрифуги и сепараторы: S-23, S-24, S-70; ОФСст- 0,1; ОФСст- 0,2; ОТР-101К; сепаратор Ж5-АСГ-3М (Гуславский А.И.).
2.1.3. Методы
Методы культивирования клеток и вирусов. Пролиферативную активность клеточных культур оценивали с помощью индекса пролиферации. Концентрацию клеток определяли путем их подсчета в камере Горяева. Жизнеспособность клеток в суспензии выражали в процентом соотношении к общему количеству клеток. Титр вируса ВГИ определяли по количеству фокусообразующих единиц в 1 см3, титр вируса ИББ по методу Кербера (1931) в модификации Ашмарина И.П. (1959).
Методы контроля фермента. Физико-химические свойства трипсина определяли по ГОСТ 202642-89. Наличие фермента в суспензии осуществляли экспресс-методом на фотопленке; протеолитическую активность - по РСТ ЛССР 424-84 ТУ ОКП 921.828.1500 и ТУ 9358.013.00008064-96 - по Шоу-Петиколас. Диспергирующие свойства трипсина на тест-культуре клеток ФЭК оценивали по выходу клеток из 1 г, жизнеспособности, адгезивным и ростовым свойствам (урожаю, УК и индексу пролиферации, ИП).
Физико-механические свойства полимерных композиций. Свойства полимерных вулканизатов в исходном состоянии и после теплового старения определяли по ГОСТ 9024-74 и ГОСТ 9.029-74.
Статистическая обработка результатов. При статистической обработке экспериментальных результатов использовали метод регрессивного анализа. Достоверность результатов оценивали по критерию Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1980). Результаты считали достоверными при Р < 0,05.