Биттуева Мадина Мухаматовна кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры генетики, селекции
| Вид материала | Лекции |
- Биттуева Мадина Мухаматовна кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры, 836.9kb.
- Учебно-методический комплекс по дисциплине, 223.53kb.
- Учебно-методический комплекс по дисциплине, 259.56kb.
- Учебно-методический комплекс по дисциплине, 721.84kb.
- Учебно-методический комплекс по дисциплине, 197.84kb.
- Методические указания для проведения практических занятий по курсу «Генетика с основами, 463.8kb.
- Учебно-методический комплекс по дисциплине, 433.04kb.
- Программа по генетике для сдачи вступительного экзамена в аспирантуру Введение, 84.18kb.
- Николаев Александр Анатольевич Требования Государственного стандарта Государственный, 102.06kb.
- Контрольная работа Игнатьева Марина Валерьевна, кандидат юридических наук, старший, 52.91kb.
Практическое применение молекулярной генетики. Основные достижения молекулярной генетики, особо отразились в бурном развитии генной инженерии. Генетическая (генная) инженерия - область молекулярной биологии и генетики, ставящая своей задачей конструирование генетических структур по заранее намеченному плану, создание организмов с новой генетической программой. Основные методы генной инженерии были разработаны в 60-70-х годах нашего века. Они включают три основных этапа:
- получение генетического материала (искусственный синтез гена или выделение природных генов);
- включение этих генов в автономно реплицирующуюся генетическую структуру (векторную молекулу) и создание рекомбинантной молекулы ДНК;
- введение векторной молекулы (с включенным в нее геном) в клетку-реципиент, где она встраивается в хромосомный аппарат. Экспериментальный перенос генов в другой геном называется трансгенезом.
В настоящее время раскрыта тонкая структура гена. Известно, что ген содержит информацию на первичную структуру одного полипептида. Число кодонов в гене не может быть меньше числа аминокислот в белке. Средний размер гена 1000-1200 нуклеотидов. Существуют разные подходы выявления последовательности нуклеотидов в гене.
Принципиально возможно познание структуры гена путем изучения последовательности аминокислот в белке. Но это длинный путь, если учесть, что одна и та же аминокислота может кодироваться несколькими триплетами.
Другой подход более реальный: путем анализа последовательностей нуклеотидов в информационных РНК, которые какое-то время существуют в цитоплазме и могут быть выделены.
Гены для пересадки могут быть либо искусственно синтезированы, либо выделены из ДНК прокариот и хромосом эукариот. В настоящее время выделение высокомолекулярной ДНК проводят на ультрацентрифугах в градиенте плотности хлористого цезия. Известно два пути искусственного синтеза гена: химический и ферментативный. Для химического синтеза необходимо иметь полностью расшифрованную последовательность нуклеотидов. Впервые в 1970 году индийским ученым Корана Г. (США) был осуществлен искусственный синтез гена. Он синтезировал последовательность нуклеотидов в ДНК, специфическую для структуры гена транспортной аланиновой РНК в клетках пекарских дрожжей. Более двух лет затратили на этот синтез гена. Последовательность нуклеотидов в нити ДНК определялась по информационной РНК. Но этот ген был не способен работать in vitro. Причиной являлся синтез только структурной части гена, в нем не было регуляторных участков. Для транскрипции необходимо, чтобы фермент РНК-полимераза "узнавала" место промотора, где локализована точка инициации синтеза, и в этом месте "садилась" на матрицу. В 1976 г, в той же лаборатории был синтезирован ген тирозиновой тРНК бактерии кишечной палочки, состоящий не только из структурного участка (126 нуклеотидных пар), но и регуляторных частей - промотора и терминатора. Этот искусственно созданный по специальной программе ген был выведен в бактериальную клетку и функционировал как природный.
Другим примером химического синтеза гена является синтез гена, кодирующего фермент, расщепляющий лактозу. Синтезированный ген в пробирке был встроен в плазмиду и введен в бактерию; кишечная палочка приобрела способность усваивать лактозу. Однако, химическим путем можно синтезировать небольшие по размеру гены прокариот, синтез сложных генов эукариот, состоящих из тысячи и более нуклеотидов, путем химического синтеза пока создать не удается.
Кроме того, химический синтез очень трудоемкий и в настоящее время практически не используется. Наиболее успешным оказался ферментативный синтез гена.
Центральная догма молекулярной генетики утверждает, что считка информации происходит в направлении: ДНК→РНК→белок. Но ряд авторов, начиная с 1948 года, выступали с соображениями, что РНК может быть предшественником ДНК. Подобное наблюдается у онкогенных РНК - содержащих вирусов. С РНК-вируса, попавшего в клетку, синтезируется провирус (ДНК - копия РНК) с помощью фермента обратная транскриптаза (ревертаза), а сам процесс называется обратной транскрипцией. Этот фермент был открыт в 1970 году Теминым, Мазутани, Балтимором. Клонирование (размножение) кДНК по известной иРНК было разработано Г.Бойером, С.Коэном и П.Бергом в 1973 году. На 1 этапе на основе иРНК по принципу комплементарности синтезируют односпиральную кДНК. На 2-3 этапах удаляют иРНК и достраивают вторую часть кДНК. Деполимеризацию исходной РНК-цепочки осуществляют путем щелочного гидролиза. Цепи ДНК устойчивы к обработке щелочью, а РНК полностью деполимеризуется. Двуцепочечную кДНК получают путем достраивания одноцепочечной кДНК под действием фермента ДНК-полимеразы. После такой обработки кДНК можно встраивать в вектор. Такая кДНК не имеет вставок - интронов, т. е. схема ее строения в этом смысле не отличается от бактериального гена. Ген, полученный путем ферментативного синтеза, может функционировать в бактериальной клетке, на нем синтезируется иРНК, а затем белок. Таким путем под руководством академика В. А.Энгельгардта был получен ген, определяющей синтез фермента галактозидазы, введенный в фаг. При размножении фага в клетке получили множество копий, что обеспечило синтез большого количества фермента. Это имеет не только теоретическое, но и практическое значение, так как галактозидаза применяется в пищевой промышленности.
Следовательно, если иметь в пробирке выделенные молекулы иРНК, принадлежащие данному гену, то он может быть синтезирован с помощью фермента. Матрицей служит иРНК, ее выделяют, добавляют нуклеотиды, затравку, ферменты. На основе этих данных в 1972-1973 гг. во многих лабораториях мира были синтезированы гены глобина человека, кролика, голубя, мыши, утки, гены митохондрии печени крыс и другие. Гены, синтезированные с помощью ревертазы, не имеют регулярной части и промотора. Отсутствие регуляторных участков препятствует функционированию этих искусственных генов в животных клетках. При переносе в микробную клетку к структурным генам присоединяют промотор, извлеченный из микробной клетки.
Ферментативный синтез гена имеет большие возможности: принципиально осуществимо проводить искусственный синтез любых индивидуальных генов путем транскрибирования их с соответствующих матричных РНК. Основным затруднением является синтез не структурных, а регуляторных генов, необходимых для их нормальной работы. Это в ряде случаев ограничивает использование искусственно синтезированных генов. Кроме этого, иРНК в клетках содержится в очень незначительном количестве и она обладает нестойкостью.
В настоящее время получают рекомбинативные (гибридные) молекулы ДНК путем гибридизации in vitro фрагментов ДНК вирусного, бактериального и в меньшей степени эукариотного происхождения.
Нахождение условий функционирования генов эукариот в бактерии позволяло бы решить проблему получения многих биологически активных веществ (гормонов). Одним из достижений является синтез гормона соматостатина, полученный в результате введения этого гена в кишечную палочку. Соматостатин регулирует поступление в кровь гормона роста, образуется он в гипоталамической области. Плазмиды, содержащие этот ген, были введены в бактерию и состыкованы с имеющимся в ее геноме регуляторным геном бетагалактозидазы. Наличие регуляторного участка обеспечило процесс транскрипции и трансляции.
Однако создание искусственных генов, получение рекомбинантных молекул ДНК и введение их в клетки, в частности прокариот, может привести к появлению новых организмов с признаками, никогда ранее не имевшимися на Земле. Так, в США пересадили гены стафилококка кишечной палочки. В результате образовался гибридный штамм, обладающий свойствами обоих микроорганизмов. При манипуляции с геномом этой бактерии возникшие новые организмы могут приобрести патогенные свойства, быть устойчивыми к известным лекарственным препаратам и оказаться особо опасными для человека, поскольку в ходе предыдущей эволюции человеческий организм никогда не встречался с такими формами и может оказаться безоружным,
В связи с этим на Международной конференции в США в 1974 г. были выработаны определенные правила, обязательные при манипуляциях с генетическим материалом и предложен ряд мер, которые должны сделать практически невозможным случайный выход из лабораторий в природу патогенных рекомбинантных микроорганизмов. Успехи молекулярной генетики должны быть использованы на благо человека: в борьбе против наследственных болезней, для создания новых микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ, синтеза растительных и животных белков и др. Молекулярная генетика развивается стремительно и уже располагает достаточными средствами и методами воздействия на наследственные заболевания.
3.5 Глоссарий по дисциплине.
А-ДНК. Альтернативная форма правозакрученной двуспиральной молекулы ДНК. На одном витке имеется 11 пар оснований, причем нуклеотидная цепь наклонена вдоль продольной оси молекулы. Биологическое значение А-ДНК не вполне понятно.
Абортивная трансдукция. Несостоявшаяся трансдукция, когда ДНК не встраивается в хромосому реципиента (см. трансдукция).
Автономно реплицирующиеся последовательности (ARS). Реплицирующиеся, в первую очередь, последовательности длиной около 100 нуклеотидов, обнаруженные в хромосомах дрожжей и в ДНК клеточных органелл.
Автополиплоидия. Полиплоидия в результате репликации одного диплоидного набора хромосом.
Авторадиография. Получение изображения на рентгеновской пленке после экспозиции с радиоактивной пробой. Используется для локализации радиоактивно меченных зондов в клетках или тканях.
Автотетраплоид. Автополиплоид, содержащий четыре сходных генома. В этом случае два аллеля А и а могут быть представлены в виде пяти генотипов: АААА (квадраплекс), АААа (триплекс), Аааа (дуплекс) и аааа (нулиплекс).
Адаптация. Наследуемый компонент фенотипа, обеспечивающий лучшую приспособленность и успешную репродукцию особей. А также сам процесс приспособления организмов к условиям среды
Аддитивная дисперсия. Генетическая дисперсия, которая относится к замене одного аллеля данного локуса на другой аллель. Используется для анализа изменчивости количественных признаков.
Акридиновые красители. Класс органических соединений, молекулы которых встраиваются в двойную спираль, препятствуя спариванию оснований. Поэтому в результате следующего цикла репликации ДНК возникают делеции нуклеотидов или добавляются новые нуклеотиды.
Акроцентрическая хромосома. Хромосома с центромерой, локализованной на конце. К акроцентрикам относятся, в частности, человеческие хромосомы 13, 14, 15, 21 и 22.
Активатор, РНК-активатор. Элемент модели бриттена-дэвидсона, синтезируемый при работе гена-интегратора и взаимодействующий с рецепторным сайтом регулируемого гена; один а. может контролировать работу многих генов в том случае, если каждый локус-мишень имеет копию соответствующего рецептора; обычно а. является рнк, но может быть и белком.
Активный иммунитет. Иммунитет в результате прямой экспозиции антигенов с последующим образованием антител.
Активный сайт. Структурный домен белка, необходимый для его функционирования. У ферментов это сайт связывания с субстратом.
Алейроновый слой. Наружный слой эндосперма семян.
Алкаптонурия. Аутосомно-рецессивный признак у человека, обусловленный отсутствием фермента - оксидазы гомогентизиновой кислоты. У гомозигот моча темного цвета из-за окисления выделяемой с мочой гомогентизиновой кислоты. У взрослых гомозигот хрящевая ткань темнеет вследствие накопления пигмента - прооизводного гомогентизиновой кислоты. Нередко пигментация хрящей сопровождается артритом.
Алкилирующий агент - вещество, вызывающее введение алкильной группы в молекулу органического соединения: многие химические мутагены являются А.а. - азотистый и сернистый иприты, эпоксиды, этилметансульфонат, циклофосфамид, бусульфан, хлорамбуцил, мелфалан, и т.д.
Аллель. Одно из состояний гена, возникшее за счет мутаций. Аллели одного гена отличаются по своему проявлению в фенотипе.
Аллельная частота. Доля особей в популяции, несущих определенный аллель.
Аллель-специфичные нуклеотиды. Синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 п.н., которые в определенных условиях гибридизуются только со строго комплементарной последовательностью ДНК.
Аллельное замещение. Процесс вытеснения одного аллеля другим в результате изменения направления естественного oтбора; относительно медленное уменьшение концентрации исходного аллеля обусловливает длительное сохранение субституционного генетического груза в популяции; метод расчетa скорости З.а. (по числу поколений) в зависимости от интенсивности отбора разработан Дж.Холдейном в 1957.
Аллельное исключение (эксклюзия). Селективное действие у гетерозигот только одного из аллелей, кодирующих иммуноглобулин.
Аллелизм, Аллеломорфизм - Парность гомологичных генов, определяющих разные фенотипические признаки у диплоидных организмов.
Аллолактоза. Производное лактозы — индуктор lac-оперона.
Аллопатрическое видообразование. Процесс видообразования, связанный с географической изоляцией.
Аллополиплоид. Полиплоид, возникший в результате объединения двух и более хромосомных наборов с последующим удвоением числа хромосом.
Аллотетраплоид. Диплоид, два хромосомных набора которого получены от разных видов.
Аллостерический эффект. Изменение конформации активного сайта белковой молекулы за счет взаимодействия белка с молекулой эффектора.
Аллофермент. Фермент, кодируемый одним из аллелей и отличающийся от других форм этого фермента по электрофоретической подвижности в геле.
Альтернативный сплайсинг. Образование разных белковых молекул, транслируемых с одной пре-и РНК путем изменения числа и последовательности экзонов в молекуле и РНК.
Альфа-фетопротеин (АФП). Эмбриональный гликопротеин массой 70 кДа, синтезирующийся в желточном мешке. Высокое содержание АФП в амниотической жидкости указывает на дефекты развития нервной трубки и межпозвоночную грыжу. Содержание АФП ниже нормы может быть связано с синдромом Дауна.
Alu-последовательности. Диспергированные последовательности ДНК длиной около 300 п.н., обнаруженные в геноме приматов и разрезаемые рестриктазой Alu. Alu-последовательности состоят из димеров, соединенных по типу «голова-к-хвосту», размером 140 п.н. (первый мономер) и 170 п.н. (второй мономер). У человека имеется 300000-600000 копий этих последовательностей, что составляет 3-6% генома (см. SINE).
Амбер-кодон. Кодон УАГ, который не кодирует аминокислоту, но служит для терминации трансляции иРНК.
Аминоацил-тРНК. Аминокислота, ковалентносвязанная с тРНК.
Аминокислота. Органическое вещество; ковалентносвязанные аминокислотные остатки образуют молекулу белка.
Амниоцентез. Тестирование эмбриональных дефектов с помощью цитогенетического и
молекулярного анализа клеток амниотической жидкости, окружающей плод. Амплификация генов. Множественная репликация выбранных последовательностей ДНК как вне хромосомы (ПЦР), так и внутри хромосомы (в плазмиде или другом векторе).
Анаболизм. Синтез сложных молекул из более простых предшественников в процессе обмена веществ.
Аналог. Химическое соединение, структурно близкое другому соединению и отличающееся от него по одной функциональной группе. Например, 5-бромдезоксиуридин — аналог тимидина.
Аналог основания - Пуриновое или пиримидиновое основание, близкое по структуре к одному из пяти главных оснований, - например, аминопурин, азагуанин, азаурацил, меркаптопурин); некоторые А.о. могут функционально заменять обычные основания.
Анафаза. Стадия клеточного деления, на которой хромосомы начинают движение к полюсам клетки.
Анафаза I. Стадия первого деления мейоза, на которой расходятся гомологичные хромосомы.
Ангстрем. Единица длины, равная 10-10 м, обозначается как А.
Анеуплоидия. Несоответствие числа хромосом кратному гаплоидному набору.
Аннотация. Анализ нуклеотидной последовательности генома для идентификации генов, кодирующих и не кодирующих белки, а также их регуляторных последовательностей.
Антиген. Белок на поверхности клетки или другое соединение, стимулирующее образование антител.
Антикодон. Нуклеотидный триплет в молекуле тРНК, который комплементарно связывается с кодоном и РНК.
Антипараллель. Сравнение структуры молекул, ориентированных в разных направлениях, например двух цепей молекулы ДНК.
Антисипация. Впервые описана у больных миодистрофией, когда тяжесть заболевания из поколения в поколение усиливается, а возраст проявления симптомов из поколения в поколение снижается. Это обусловлено экспансией тринуклеотидных повторов внутри гена или в его окружении.
Антитело. Иммуноглобулин, образующийся в ответ на определенный антиген и специфически связывающий этот антиген.
Апоптоз. Генетически запрограммированная гибель клетки как результат нормальной клеточной дифференцировки или повреждения клетки.
Ассортативное скрещивание. Неслучайное скрещивание между полами. Селекция скрещиваний между одинаковыми генотипами позитивна, а селекция скрещиваний между разными генотипами негативна.
Аттенюатор. Нуклеотидная последовательность между промотором и структурным геном в некоторых оперонах, которая может регулировать доступ РНК-полимеразы к молекуле ДНК и терминировать транскрипцию соответствующего гена.
АТФ. Аденозинтрифосфат.
Ауксотроф. Мутантный микроорганизм или клеточная линия, для роста которых требуется вещество, в норме синтезируемое штаммом дикого типа.
Аутогамия. Самооплодотворение или самоопыление, приводит к появлению в потомстве гомозигот.
Аутоиммунные заболевания. Продукция антител в результате иммунного ответа на собственные молекулы, ткани или клетки. Причина кроется в неспособности иммунной системы отличить «свое» от «чужого». К подобным заболеваниям относятся артриты, склеродерма, системная красная волчанка, ювенильный диабет и т. д.
Аутбредная депрессия. Снижение приспособленности в потомстве от генетически различных родителей, связанное с более низкой адаптацией к условиям среды.
Ацентрическая хромосома. Хромосома или хромосомный фрагмент без центромеры.
Базовый репликон. Минимальный участок плазмиды <plasmid>, достаточный для ее стабильного существования в бактериальной клетке, т.е. включающий набор генов несовместимости плазмид, контроля числа копий, репликации и сегрегации.
Батарея генов - в модели регуляции транскрипции эукариотических генов Бриттена-Дэвидсона - группа генов, находящихся под контролем одного сенсорного сайта, управляющего геном-интегратором.
Бактериофаг (фаг). Вирус, который заражает бактерии.
Бактериофаг µ. Группа фагов, геном которых встраивается в хозяйскую хромосому, инактивируя гены или вызывая хромосомные перестройки.
Бекросс (возвратное скрещивание). Скрещивание между гетерозиготой F1 и одним из родителей или организмом с генотипом, идентичным родительскому.
β-галактозидаза. Бактериальный фермент, кодируемый геном lacZw превращающий лактозу в галактозу и глюкозу.
Блок Прибнова. Каноническая последовательность ТАТААТГ длиной 6 п.н., которая находится перед стартовой точкой бактериальных генов и с которой связывается сигма-субъединица РНК-полимеразы.
BrdU (5-бромдезоксиуридин). Мутаген, аналог тимидина: метильная группа в 5'-положении тимидина замещена бромом.
Библиотека кДНК. Коллекция клонированных последовательностей кДНК.
Биваленты. Синапс гомологичных хромосом в профазе I мейоза.
Бокс Гольдберга—Хогнесса. Короткая нуклеотидная последовательность длиной 20-30 п.н. на 5'-конце сайта инициации транскрипции эукариотических генов, которая связывается с РНК-полимеразой II. Консенсусная последовательность ТАТАААА называется ТАТА-боксом.
Болезнь отторжения трансплантата. Иммунологическая реакция клеток хозяина против клеток донора. Нередко пересадка костного мозга у человека кончается этим заболеванием с плохим прогнозом.
Биологическое разнообразие. Генетическое разнообразие в популяциях растений и животных.
Блоттинг -название методик, включающих этап переноса разделенных макромолекул из определенной среды (например, геля) на какой-либо носитель (специальная бумага, нитроцеллюлозные фильтры и т.п.); существует два основных типа Б. - капиллярный (например, Саузерн-блоттинг), в основе которого - перемещение молекул благодаря капиллярному эффекту, и электроблоттинг, при котором перенос молекул обеспечивается путем электрофореза.
В-хромосома, добавочная хромосома - хромосома, присутствующая в хромосомном наборе сверх нормального диплоидного числа хромосом; В-х. известны у многих растений и (несколько реже) у животных, их число может значительно варьировать (от 1 до нескольких десятков); часто В-х. состоят из гетерохроматина (но могут содержать - видимо, вторично - и эухроматин) и генетически пассивны, хотя могут оказывать "побочные" эффекты - например, у насекомых наличие В-х. часто обуславливает повышенную аберрантность сперматозоидов; в клеточных делениях могут быть стабильны, но чаще нестабильны (иногда митотически стабильны, но нестабильны в мейозе, где чаще образуют униваленты); изредка В-х. являются изохромосомы; механизмы появления В-х. различны - фрагментация, гетерохроматинизация "лишних" хромосом после неправильного анафазного расхождения и т.п.
В-форма. ДНК - правоспиральное конформационное состояние молекулы ДНК, существующее при высокой относительной влажности (>92%) и в растворах с низкой ионной силой; полагают, что в живых клетках практически вся ДНК существует именно в В-ф. (в 80-х гг. было обнаружено, что небольшая часть ДНК существует в Z-форме); число пар оснований на 1 виток - 10, расстояние между парами оснований 3,38 , угол вращения между соседними парами оснований - 36o, диаметр спирали - 19, остаток дезоксирибозы находится в С2'-эндоконформации, все основания имеют антиконформацию.