Geum.ru

Морфологические и молекулярно-биологические факторы прогноза рака мочевого пузыря 14. 00. 14-онкология. 14. 00. 15-патологическая анатомия

Вид материалаАвтореферат

Содержание


5. Электрофорез в ПААГ.
6. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра.
7. Программное обеспечение.
Статистическая обработка результатов
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Рис. 1. Экспрессия р53 в РМП. (G1 – G3 – степень дифференцировки; СИ – сосудистая инвазия; N – статус лимфатических узлов; 1гр –
Подобный материал:
1   2   3   4


5. Электрофорез в ПААГ.

Электрофорез продуктом ПЦР проводили в 8% ПААГ при 4ОС в течение 3-5 часов.

Состав 8% ПААГ:

8,4 мл 30% раствора АА (29:1)

1,5 мл 10х буфера ТВЕ,

до 30 мл дист. воды,

600 мкл 10% аммония персульфата (APS),

26 мкл ТЕМЕД.

Визуальный контроль пробега проб ДНК проводили по ксиленцианолу и бромфеноловому синему. Для фиксации результатов ПААГ проводили ксерокопирование или сканирование гелей.

6. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра.

После электрофореза гель помещали в раствор 10% метанола и 5% уксусной кислоты на 10-15 минут. Затем дважды отмывали дистиллированной водой. После этого гель инкубировали в растворе 0,011М AgNO3 в течение 10-15 минут, трижды промывали в дистиллированной воде. Проявление проводили в модифицированном растворе проявителя (увеличена концентрация НСНО) следующего состава: 0,75M NaOH; 0,5 M HCHO; 2,3mM Na(BH4) около 10-15 минут, в зависимости от интенсивности проявления геля. ПГ оценивали как ослабление или отсутствие полосы одного из аллелей относительно контроля, на МН указывало появление дополнительной полосы.


7. Программное обеспечение.

Компьютерный анализ ДНК проводился с использованием следующих программ:

1) поиск полноразмерной нуклеотидной последовательности генов по базам данных Blast и Fasta;

2) анализ ДНК на наличие сайтов ферментов рестрикции при помощи программ Genebank Pustell, Genepro, WIN-SUN;

3) компьютерное конструирование олигонуклеотидных праймеров и подбор условий для проведения ПЦР с использованием программы Oligo 4.0 и MethPrimer;

4) анализ хроматограмм секвенированных последовательностей и распечатка результатов – с помощью программ Executor и Chromas.

Статистическая обработка результатов

Статистический анализ проводили с использованием программы Excel с пакетом анализа данных по методам, описанным в книге «Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel» (Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н., 2000г.).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Прогноз уротелиального рака в нашем исследовании был связан со степенью анаплазии. Опухоли с прогрессирующим течением преобладали в группе карцином G3 – 47,2%, в группе G2 составляли 10,8%, а в G1 – 5,9%. Мы не обнаружили связи степени дифференцировки с рецидивами. Возможно, имеет значение способ лечения и более агрессивная тактика, в частности хирургическая, применяемая при уротелиальном РМП с высокой степенью анаплазии.

Изучалась значимость метапластических изменений в РМП. Обнаружено, что в умеренно и низкодифференцированных уротелиальных карциномах плоскоэпителиальная и железистая метаплазия выявлена в 50,5% и 56,9% случаев соответственно, в то время как в высокодифференцированных карциномах – лишь в 2,15% наблюдений. Отмечено также нарастание метапластических изменений с увеличением стадии процесса. Однако достоверной зависимости прогноза от этого фактора получено не было, отмечено некоторое увеличение (47,3%) частоты метапластических изменений в группе больных с неблагоприятным прогрессирующим течением. Это вероятнее всего связано не столько с клиническим поведением опухоли, сколько с повышением степени анаплазии, которая, безусловно, сопровождается изменением направления дифференцировки опухолевых клеток. Особенно это свойственно уротелиальной карциноме, так как и нормальный уротелий обладает свойствами и железистого и плоского эпителия.

Мы не выявили связи между наличием сосудистой инвазии и метастатическим поражением лимфатических узлов, однако обнаружили корреляцию со степенью дифференцировки. В карциномах G1 инвазия опухоли в сосуды констатирована в 16,1% наблюдений, G2 -23,8%, G3 – 51,4%. Таким образом, более чем в половине низкодифференцированных уротелиальных карцином отмечается врастание в сосуды, что обусловлено, вероятнее всего, способностью этих опухолей вырабатывать значительное количество протеаз, разрушающих базальные мембраны и облегчающих проникновение клеток в сосудистое русло. Этим можно объяснить и значительное число наблюдений с сосудистой инвазией в группе больных с неблагоприятным прогрессирующим течением (72,7%). В группе опухолей с упорно рецидивирующим течением инвазия сосудов обнаружена в 39,2% случаев, в группе с благоприятным прогнозом – 8,9%.

В исследовании Jimenez R.E. at al (2000) рекомендуется указывать не только глубину, но и способ стромальной инвазии. Считается, что опухоль, инфильтрирующая строму «широким фронтом», менее агрессивна, чем «щупальцеобразный» рост. Мы изучили способ стромальной инвазии у пациентов с уротелиальной карциномой стадии Т1. Не выявлено зависимости способа стромальной инвазии от степени дифференцировки опухоли. Также установлено, что способ стромальной инвазии рака достоверно не влияет на прогноз, однако нельзя не отметить тенденцию к некоторому повышению частоты щупальцеобразного роста в третьей прогностической группе.

Кроме формальных морфологических характеристик большое значение имеют индивидуальные молекулярно-генетические свойства опухоли, которые обуславливают ее биологическую агрессивность.

В результате проведенных исследований было выявлено достоверное увеличение пролиферативной активности при снижении степени дифференцировки уротелиальных карцином (G1 - среднее значение PCNA 35,2%, Ki67- 27,5%. G2 - PCNA – 49,4%, Ki67 – 41,9%. G3 –PCNA – 59,3%, Ki67 – 49,4%. коэффициенты корреляции для PCNA и Ki67 0,39 и 0,4 соответственно). Экспрессия маркеров пролиферации не отличалась в опухолях разных стадий. Отмечено повышение пролиферативной активности и в опухолях с наличием сосудистой инвазии (среднее значение PCNA - 50,1%, Ki67 – 42%, в опухолях без инвазии сосудов - PCNA – 38,8%, Ki67 – 30,2%). По нашим данным, в опухолях с благоприятным прогнозом и упорно рецидивирующих пролиферативная активность не отличалась. Следует отметить, что высокая пролиферативная активность отмечалась в части неинвазивных высокодифференцированных уротелиальных карцином, а также в случаях благоприятного прогноза, поэтому, на наш взгляд, маркеры пролиферации не могут являться самостоятельными предикторными факторами.

При изучении факторов апоптоза bcl-2, bcl-х, CD95 не было выявлено каких-либо закономерностей в экспрессии этих маркеров.

Огромное значение онкологи придают изменению функции белка р53 и его влияния на прогноз РМП. Существуют сведения о влиянии р53 на миграционную способность клеток. В эпителиальных клетках р53 способен к подавлению экспрессии Е-кадхерина на поверхности клеток, что ведет к нарушению межклеточных контактов и повышению миграционной способности и инвазии раковых клеток. При исследовании экспрессии мутантного белка р53 выявлена корреляция со степенью дифференцировки опухоли (коэффициент 0,43), стадией заболевания (коэффициент 0,37). (рис. 1) Также отмечено повышение экспрессии р53 в опухолях с наличием сосудистой инвазии и метастазами в лимфатических узлах. Регулируя активность гена VEGF-C, р53 может стимулировать размножение и миграцию лимфатического эндотелия, индуцируя лимфангиогенез в опухоли и регионарных лимфоузлах, способствуя, таким образом, лимфогенному метастазированию. Выявлена корреляция уровня экспрессии р53 с прогнозом заболевания (коэффициент 0,34).




Рис. 1. Экспрессия р53 в РМП. (G1 – G3 – степень дифференцировки; СИ – сосудистая инвазия; N – статус лимфатических узлов; 1гр – 3гр – прогностические группы).


При сопоставлении результатов иммуногистохимического и генетического исследования (секвенирование гена ТР53) было показано отсутствие корреляции между содержанием белка р53 и мутациями его гена. Позитивная иммуногистохимическая реакция может быть обусловлена стрессиндуцированной стабилизацией белка дикого типа, а инактивирующие мутации ТР53 могут уменьшать или не изменять содержание белка.

Белок циклин D1 входит в семейство циклинов, функционально он связан с важными регуляторными белками клетки, такими как р53, р16, Rb и другими. При изучении экспрессии этого белка были получены результаты, сходные с экспрессией р53. Обнаружена значимая корреляция со степенью дифференцировки опухоли (коэффициент 0,49), наличием сосудистой инвазии (коэффициент 0,38) и метастазами в лимфатических узлах. Выявлено повышение экспрессии циклина D1 с увеличением стадии заболевания, однако корреляция не является значимой. Кроме того, отмечено повышение экспрессии циклина D1 в опухолях с метастазами в лимфатических узлах, а также в карциномах с неблагоприятным прогрессирующим течением. (рис. 2) Эти данные подтверждают мнение о циклине D1 как о маркере неблагоприятного прогноза для РМП.




Рис. 2. Экспрессия циклина D1 в РМП.


Значимую роль в канцерогенезе играет ген-супрессор опухолевого роста INK4a, продукт этого гена – белок р16 является ингибитором циклин-Д-зависимых киназ и задерживает клетку в S-фазе. При мутациях гена белок не вырабатывается, что приводит к пролиферации и неконтролируемому делению клеток. Известно, что при раке шейки матки уровень р16 наоборот повышается, это обусловлено участием белка Е7 вируса папилломы человека. РМП является опухолью урогенитальной зоны и в части случаев связан с папилломавирусной инфекцией, поэтому изучение р16 представляет значительный интерес. При анализе экспрессии этого белка не было выявлено статистически значимых различий в зависимости от степени дифференцировки опухоли, стадии заболевания и наличия сосудистой инвазии. Отмечена лишь тенденция к некоторому снижению экспрессии р16 со снижением степени дифференцировки опухоли. Кроме того, уровень экспрессии р16 отличался в опухолях с метастазами в регионарные лимфатические узлы и без метастазов. Средний показатель в группе с метастазами составил 38,1%, в группе без метастазов –19,8%. В отличие от карциномы шейки матки не обнаружена достоверная связь с вирусной инфекцией, было отмечено лишь некоторое повышение его экспрессии в опухолях, содержащих ДНК ВПЧ. ДНК ВПЧ 16 и 18 типов выявлена у 23 из 79 больных (29,1%), при этом не проводилось специального отбора образцов, в которых присутствуют морфологические признаки вирусной инфекции в виде койлоцитоза (при таком отборе число опухолей с ДНК ВПЧ может достигать 50%). В исследованных опухолях чаще выявлялась ДНК ВПЧ 16 типа, причем отмечалась заметная тенденция к преобладанию этого вируса в опухолях с рецидивирующим течением заболевания. ДНК ВПЧ 16 типа обнаружена в 30% карцином с рецидивирующим течением и в 14% - 1 прогностической группы (благоприятный прогноз).

Экспрессия рецепторов эпидермальных факторов роста HER2/neu и EGFR в нашем исследовании не была связана с прогнозом заболевания. Отмечена гиперэкспрессия этих белков лишь в немногочисленных, хотя преимущественно низкодифференцированных карциномах, а также в опухолях с мышечной инвазией и метастазами в лимфатических узлах. Однако нельзя не отметить низкий процент амплификации гена HER2/neu в опухолях с гиперэкспрессией соответствующего белка (амплификация гена обнаружена в 8,7% случаев с HER2-статусом 2+ и в 41,7% с HER2-статусом 3+). При генетическом исследовании установлено, что в карциномах с гиперэкспрессией HER2/neu, имела место полисомия 17 хромосомы, что, по всей видимости, и обусловило гиперпродукцию белка, однако наличие полисомии не является основанием для назначения таргетной терапии.

Не только биология клеток опухоли определяет ее инвазивный и метастатический потенциал, но и изменения в структуре белков межклеточного матрикса. Замена белков типичной соединительной ткани на тенасцин приводит к утрате клетками адгезивных свойств и способствует их миграции и имплантации на отдалении. Доказано, что большое значение для прогноза РМП имеет не столько появление тенасцина, сколько повышение его количества, которое мы определяем по разработанной в отделении методике. Выявлено, что количественное содержание тенасцина достоверно возрастало с понижением степени дифференцировки опухоли, в карциномах с сосудистой инвазией и метастазами в лимфатических узлах. Обнаружено высокое содержание тенасцина в РМП у пациентов третьей прогностической группы (опухоли с прогрессирующим течением). (рис. 3)




Рис. 3. Количественное содержание тенасцина в РМП.

Нормальные белки, входящие в состав БМ и ВКМ, коллаген IV типа и ламинин, активно участвуют в межклеточных взаимодействиях и клеточно-субстратной адгезии. В нашем исследовании выявлено значительное снижение экспрессии ламинина и коллагена в низкодифференцированных карциномах МП. (рис. 4)

Кроме того, обнаружена обратная корреляция со стадией процесса и сосудистой инвазией. Достоверных отличий в выработке этих белков у больных с метастазами и без метастазов в лимфатических узлах выявлено не было, также как и в группах с различными способами стромальной инвазии. Нет оснований считать уровень экспрессии ламинина и коллагена независимым прогностическим фактором, хотя в опухолях третьей прогностической группы было снижено их содержание.



Рис. 4. Экспрессия ламинина и коллагена IV в РМП.

Помимо белков ВКМ важную роль в процессе инвазии и метастазирования играют молекулы адгезии, Е-кадхерин и b-катенин, которые обеспечивают прочные межклеточные контакты и препятствуют миграции клеток опухоли за пределы первичного очага. Достоверно снижается экспрессия этих гликопротеидов при повышении степени анаплазии опухоли. Кроме того, сниженное содержание молекул адгезии ассоциировано с наличием сосудистой инвазии и метастазов в лимфатических узлах. (рис. 5) Очевидно, что утрата адгезивных свойств ведет к повышению инвазивной и метастатической активности. Отмечено заметное снижение экспрессии этих гликопротеидов в уротелиальных карциномах третьей прогностической группы, при этом связи с рецидивами РМП мы не обнаружили.



Рис. 5. Экспрессия Е-кадхерина и b-катенина в РМП.

Большая часть исследованных опухолей вырабатывает неспецифические молекулы адгезии CD44, существенно влияющие на инвазивный и метастатический потенциал опухолевых клеток. При изучении характера экспрессии CD44 мы обнаружили, что имеет значение не только интенсивность реакции, но и локализация специфического окрашивания в опухоли. Именно перераспределение из клеток в строму сопровождает повышение агрессивности опухоли. Обнаружено значительное увеличение экспрессии CD44 в строме низкодифференцированных карцином, в опухолях с наличием сосудистой инвазии и метастазами в лимфоузлах. Обнаружены различия и при анализе прогностических групп, однако здесь они статистически не достоверны. (рис. 6)



Рис. 6. Экспрессия CD44 в РМП.


Опухолевые клетки выделяют металлопротеиназы, которые расщепляют компоненты ВКМ. Особенно увеличивается количество и скорость выделения ММР в зонах инвазивного роста опухоли. Мы изучали не только экспрессию ММР, но и их ингибиторов. Отмечено существенное повышение экспрессии ММР-2 и 9 в низкодифференцированных карциномах в совокупности с понижением уровня TIMP. Подобный характер реакций наблюдался в карциномах с сосудистой инвазией. (рис. 7) Вместе с тем, уровень экспрессии ММР-1 не связан со степенью анаплазии рака, однако отмечено значительное снижение экспрессии этой протеазы в инвазивном РМП (стадии Т2-4). В карциномах с метастазами в лимфатические узлы отмечена повышенная экспрессия ММР-2 и ММР-9 в 79 и 71% случаев соответственно и сниженная экспрессия ингибиторов металлопротеиназ.




Рис. 7. Экспрессия металлоротеиназ и их ингибиторов в РМП.


Прогностическое значение для РМП имели преимущественно ММР-2 и 9, TIMP-1 и TIMP-2. (рис. 8) Мы обнаружили значительное повышение экспрессии ММР-2 и ММР-9 и лишь относительное повышение ММР-1 в опухолях с прогрессирующим характером течения. Вместе с тем, в этой группе отмечается устойчивое снижение экспрессии ингибиторов металлопротеиназ. На наш взгляд, уровень экспрессии ММР-2, ММР-9, TIMP-1 и TIMP-2 может быть независимым фактором прогноза прогрессии и метастазирования РМП.




Рис. 8. Экспрессия металлоротеиназ и их ингибиторов в разных прогностических группах РМП.


При сопоставлении иммуногистохимических факторов была обнаружена корреляция между некоторыми маркерами. Высокая экспрессия циклина D1 сопровождается снижением уровня b-катенина, ламинина, коллагена и TIMP, однако сочетается с повышенным уровнем тенасцина и ММР. Стромальная гиперэкспрессия неспецифической молекулы адгезии CD44 коррелирует с повышением уровня тенасцина и ММР и понижением TIMP. (рис. 9)




Рис. 9. Корреляция экспрессии исследуемых маркеров.

прямая (коэкспрессия)

обратная


Кроме состояния ВКМ, уровня протеаз и их ингибиторов, важную роль играет неоангиогенез в опухоли, который во многом определяет ее клиническое поведение и прогноз. Раковые клетки секретируют факторы роста, стимулирующие миграцию эндотелия, пролиферацию и образование капилляров. Степень развития микроциркуляторного русла может влиять на чувствительность опухоли к химиотерапии, определять метастатический потенциал. Наиболее целесообразным представляется изучение не только плотности сосудов, но и уровня экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), являющегося одним из основных факторов ангиогенеза. При изучении плотности сосудов микроциркуляторного русла выявлена значимая корреляция между интенсивностью васкуляризации и степенью дифференцировки опухоли (коэффициент корреляции 0,36). (рис. 10) Отмечено увеличение числа сосудов в карциномах с наличием мышечной инвазии (стадии Т2-3). (рис. 11) Не было обнаружено статистически значимых отличий в зависимости от наличия метастазов в лимфатических узлах.



Рис. 10. Плотность микрососудистого русла в РМП разной степени дифференцировки.




Рис. 11. Плотность микрососудистого русла в РМП различных стадий.


Интересно, что наиболее выраженная экспрессия VEGF отмечена в опухолях со средними значениями плотности васкуляризации (102-150 сосудов на 1мм²), причем реакция наблюдалась как в паренхиме, так и в строме РМП. Возможно, существуют механизмы регуляции синтеза и выделения эндотелиального фактора роста, действующие по принципу обратной связи. Отмечена тенденция к увеличению плотности сосудов в карциномах с метастазами в лимфатических узлах. Известно, что VEGF принимает участие в образовании новых лимфатических сосудов, способствуя лимфогенному распространению опухоли. Имеются также данные о том, что эндотелиальные клетки вырабатывают металлопротеиназы, которые способствуют их проникновению через базальные мембраны в окружающую строму. При сравнительном анализе ангиогенеза и экспрессии ММР обнаружена прямая корреляция с высоким уровнем содержания ММР1 и ММР9 (коэффициенты корреляции 0,39 и 0,36) и обратная корреляция с уровнем ингибиторов металлопротеиназ TIMP1 и TIMP2 (коэффициенты корреляции 0,4 и 0,41). Гиперэкспрессия металлопротеиназ отмечалась в опухолях с высокой плотностью васкуляризации, однако для ММР2 данные статистически не достоверны. Эти результаты подтверждают, что металлопротеиназам принадлежит важная роль в стимуляции ангиогенеза.

Учитывая гетерогенность морфологического строения некоторых уротелиальных карцином, мы изучали наиболее характерные генетические повреждения в различных участках опухоли и окружающей ткани с использованием предварительной лазерной микродиссекции. Не выявлено генетической гетерогенности РМП. Делеции гена р16 выявлены в 60% случаев, причем в 66,7% из них аналогичное повреждение обнаружено в окружающем нормальном уротелии. Микросателлитная нестабильность локуса 9р выявлена в 6,7% образцов уротелиальной карциномы при отсутствии мутаций в участке нормального эпителия. Делеции гена ТР53 установлены в 53 случаях, в половине из них и в окружающей неизмененной слизистой оболочке. Мутации в 7-м экзоне гена FGFR3 обнаружены в 40% случаев только в клетках опухоли и не обнаружены в нормальном уротелии. Мутации FGFR3 были выявлены как в поверхностном, так и в инвазивном раке.

Было проведено исследование на гистологических срезах с использованием FISH-набора UroVysion. Обнаружены хромосомные аберрации во всех изученных образцах, причем в 80% – сочетание по трем исследуемым хромосомам (3,7 и 17). Делеция гена р16 выявлена в 70% случаев. Для умеренно и низкодифференцированных карцином, а также инвазивных опухолей (Т2-3) была характерна выраженная полиплоидия хромосомы 3, а в высокодифференцированных поверхностных карциномах 3 прогностической группы отмечена выраженная полиплоидия по хромосомам 3 и 7 в сочетании с делецией гена р16.