Морфологические и молекулярно-биологические факторы прогноза рака мочевого пузыря 14. 00. 14-онкология. 14. 00. 15-патологическая анатомия

Вид материала

Автореферат

Содержание Цель исследования Задачи исследования Научная новизна Практическая значимость Апробация работы Объем и структура диссертации Содержание работы 1. Лазерная микродиссекция 3. Секвенирование гена FGFR. 4. Микросателлитный анализ.

Подобный материал:

• Клинико-морфологические факторы прогноза (на примере рака молочной железы), 79.85kb.
• Патологическая анатомия и дифференциальная диагностика рака большого сосочка двенадцатиперстной, 388.21kb.
• Морфологические и иммуногистохимические особенности опухолей человека с мутацией рецептора, 353.37kb.
• Рабочая программа учебной дисциплины патологическая анатомия, клиническая патологическая, 480.03kb.
• Патологическая анатомия это медико-биологическая наука, изучающая структурные и морфологические, 1590.52kb.
• Клинико-морфологические особенности мультицентрического роста и рецидивирования при, 809.82kb.
• Общая патологическая анатомия, 283.39kb.
• Клинико-морфологические аспекты стеноза большого сосочка двенадцатиперстной кишки 14., 262.6kb.
• 155 Патологическая анатомия опухолей мягких тканей, 5.21kb.
• Примерная программа наименование дисциплины Патологическая анатомия, клиническая патологическая, 594.5kb.

Цель исследования

Изучение комплекса морфологических и молекулярно-биологических характеристик, определяющих прогноз и биологическую агрессивность рака мочевого пузыря.

Задачи исследования

1. Изучить клинико-морфологические факторы, такие как стадия, степень дифференцировки, гистологический вариант опухоли, способ стромальной инвазии и наличие сосудистой инвазии у больных раком мочевого пузыря.
   
2. Изучить экспрессию и локализацию факторов, отражающих пролиферативную активность опухоли и уровень апоптоза, белков-регуляторов клеточного цикла и ростовых факторов.
   
3. Изучить экспрессию и локализацию матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов.
   
4. Изучить особенности экспрессии молекул межклеточной адгезии и их влияние на инвазивный и метастатический потенциал опухоли.
   
5. Изучить состояние некоторых составляющих межклеточного матрикса и базальных мембран.
   
6. Изучить интенсивность ангиогенеза и факторов его стимулирующих.
   
7. Исследовать роль вируса папилломы человека в возникновении рецидивов поверхностной уротелиальной карциномы.
   
8. Исследовать некоторые характерные хромосомные и генетические нарушения в уротелиальных карциномах.
   
9. Сравнить полученные данные и выявить прогностически значимые факторы для рака мочевого пузыря.
   

Научная новизна

Впервые проведено комплексное изучение широкого спектра иммуногистохимических факторов, участвующих в канцерогенезе рака мочевого пузыря и их сравнение с различными морфологическими характеристиками опухоли, такими как степень дифференцировки, наличие метаплазии, сосудистая инвазия, способ стромальной инвазии, а также стадией процесса.

Выявлены факторы, влияющие на клиническое течение рака мочевого пузыря. Установлено влияние белка р53 на прогрессирование и рецидивирование РМП. Обнаружена корреляция уровня экспрессии молекул адгезии, белков ВКМ и матриксных металлопротеиназ с прогнозом заболевания. Показана значимость количественного содержания тенасцина для определения инвазивной и метастатической активности РМП. Выявлены новые факты, подтверждающие участие матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в ангиогенезе РМП.

Разработана новая методика для определения плотности сосудистой сети, которая позволяет объективизировать изучение ангиогенеза в опухоли. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение (заявка №2008111921/15(012887).

Установлена связь ВПЧ 16 типа с рецидивами поверхностного рака мочевого пузыря, определено значение метода гибридизации in situ для выявления ДНК ВПЧ в опухоли и окружающих тканях.

Выявлена выраженная полиплоидия по хромосомам 3 и 7 в сочетании с делецией гена р16 в высокодифференцированных поверхностных карциномах с неблагоприятным прогрессирующим течением.

Полученные данные вносят значительный вклад в исследование механизмов канцерогенеза.

Практическая значимость

Разработаны рекомендации по применению иммуногистохимического метода с использованием конкретной панели антител, что позволит определить индивидуальный прогноз течения заболевания и выработать индивидуальный план лечения пациента.

Разработана оригинальная методика определения плотности сосудистой сети с проведением сканирования всей площади гистологического среза и использованием анализатора изображения, которая существенно облегчит анализ ангиогенеза в опухолях разных локализаций. Методика рекомендуется для применения в патологоанатомических отделениях онкологических центров и научно-исследовательских институтов. Предложенная методика количественного определения тенасцина в опухоли может успешно использоваться не только для этого гликопротеида, но и для оценки других иммуногистохимических реакций сходного типа на гистологических срезах.

Показана необходимость подтверждения амплификации гена HER2/neu в уротелиальных карциномах с гиперэкспрессией этого белка.

Апробация работы

Материалы исследования были доложены на ряде всероссийских и международных конференций и съездов: Международной научно-практической конференции, Россия, Иркутск, 2003г., II Международной конференции “Молекулярная медицина и биобезопасность “, Россия, Москва, 2005г., Cъездах онкологов СНГ – Белоруссия, Минск, 2004г., Азербайджан, Баку, 2006г., IV Всероссийском съезде онкологов, Россия, Ростов–на–Дону, 2005г., 19 Европейском конгрессе патологии, Германия, Берлин, 2001г., 20 Европейском конгрессе патологии, Франция, Париж, 2005г., XXV Международном конгрессе Международной академии патологии, Австралия, Брисбен, 2004г., XXVI Международном конгрессе Международной академии патологии, Канада, Монреаль, 2006г, Международном противораковом конгрессе, Швейцария, Женева, 2008г, XXVII Международном конгрессе Международной академии патологии, Греция, Афины, 2008г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, их них – 3 пособия для врачей, 2 медицинские технологии, 1 глава в зарубежной монографии, 2 статьи в зарубежных сборниках и 5 публикаций в зарубежных журналах.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 208 страницах машинописного текста, включает: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение» и «Список литературы». Работа иллюстрирована 94 рисунками и 21 таблицей. Указатель литературы содержит 199 зарубежный источников и 16 – отечественных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы

Материалом для исследования послужил операционный и биопсийный материал пациентов, проходивших лечение в МНИОИ им. П.А. Герцена по поводу рака мочевого пузыря с 1995 по 2004 год. В работу включены 372 больных. Исследован материал 266 биопсий, 229 трансуретральных резекций МП, 73 резекций, 113 цистэктомий (всего 681). Из 372 пациентов 294 были мужчинами, 78 – женщинами. Возраст мужчин от 23 до 82 лет (средний 61), женщин – от 37 до 81 года (средний 63). Распределение по стадии заболевания было следующим: Та – 60 больных, Т1 – 187, Т2 – 63, Т3 – 44, Т4 -18.

В соответствии с особенностями клинического течения и для оценки прогностической значимости изучаемых факторов пациенты были разделены на три группы: 1- группа с благоприятным течением заболевания (отсутствие рецидива заболевания или многолетняя ремиссия после 1-2 поверхностных рецидивов) , 2 – группа с упорно рецидивирующим течением (многократное поверхностное рецидивирование) , 3 – группа с неблагоприятным прогрессирующим течением (развитие более глубокой инвазии и/или метастазирование рака).

Иммуногистохимический метод

Для иммуногистохимического исследования были использованы более 20 коммерческих антител: PCNA, Ki67, циклин D1 (маркеры пролиферативной активности), Bcl2, BclX, CD95 (маркеры апоптоза), мутантный р53, р16 (маркеры супрессии опухолевого роста), HER2/neu, EGFR (рецепторы эпидермального фактора роста), VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста), CD34 (маркер эндотелия сосудов), ММР-1, ММР-2, ММР-9 (матриксные металлопротеинразы), TIMP-1 и TIMP-2 (тканевые ингибиторы матриксных металлопротениназ), Е-кадгерин, бета-катенин, CD44 (молекулы адгезии), тенасцин, коллаген IV типа, ламинин (компоненты внеклеточного матрикса), из них антитела к тенасцину, HER2/neu, ламинину - поликлональные, остальные - моноклональные. Большинство антител произведено фирмой «Dako»: PCNA, Ki-67(MIB.1), р53(DO7), Bcl2, Е-кадгерин, Β-катенин, тенасцин, EGFR, коллаген IV, CD44, р16, HER2/neu, ламинин, ММР9. Антитела к BclX, ММР1, ММР2 и их ингибиторам, CD95 произведены фирмой «NovoCastra», а к циклину D1 – фирмой «Pick Cell Laboratories». Иммуногистохимические реакции проводили по стандартной методике. Интенсивность реакций, локализованных в цитоплазме (ММР, TIMP) и на мембранах клеток (молекулы адгезии) оценивали полуколичественным способом по шкале от 0 до 3 баллов с помощью анализатора изображения «Leica Q550», учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 – отсутствие реакции, 1 – слабая реакция, 2 – умеренная реакция, 3 – сильная реакция. При оценке реакции с антителами к HER2/neu и EGFR использовали общепринятую для фармакодиагностики шкалу оценки от 0 до 3+ (Jacobs T.W. et al., 1999).

Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (PCNA, Ki67, p53, bcl2 и др.) оценивали, подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения и выражая полученные результаты в процентах. Пролиферативную активность оценивали следующим образом:

1. 0% - 20% - низкая пролиферативная активность,
   
2. 21% - 50% - умеренная пролиферативная активность,
   
3. 51% - 100% - высокая пролиферативная активность
   

Метод количественной оценки экспрессии тенасцина

Нами была разработана специальная оригинальная методика с использованием анализатора изображения и модифицированной компьютерной программы. Интенсивность экспрессии тенасцина оценивали путем измерения площади среза, занятой положительной иммуногистохимической реакцией с антителами к тенасцину. Методика включала в себя следующие этапы:

Для получения цветного изображения использовали световой микроскоп LEICA DMRB, сопряженный с телекамерой ProgRes 3012 и компьютером. Изображения захватывались при увеличении x100, что соответствовало размеру поля зрения 1,28x0,98 мм2 при разрешении 1440x1100 пикселей. С каждого микропрепарата захватывалось по 3 наиболее репрезентативных поля зрения. Перед определением площадей, занимаемых элементами изображения, проводились четкие границы между ними с использованием инструментов программы АdоЬе Рhotoshop 7,0. Последовательные шаги обработки изображения (названия инструментов приведены для англоязычной версии программы):

1. Регулировка яркостно-контрастных параметров, позволяющая визуализировать слабую реакцию и, по возможности, удалить фон.

2. Сдвиг цветов изображения для повышения цветового контраста и облегчения выделения участков со слабой окраской белка.

3. Размывание изображения для более равномерной окраски участков, содержащих тенасцин.

4. Получение на изображении более четких, чем исходные, границ между участками с/без реакции.

5. Выделение всех участков изображения без реакции.

6. Инвертация выделения (Select\Invers). Выделенными оказываются структуры, содержащие тенасцин.

7. Контроль точности выделения на исходном изображении.

8. Сохранение в α-канале.

9. Создание пустого слоя. Закрашивание выделения красным цветом. Инвертация и закрашивание выделения голубым цветом.

Таким образом, получено изображение, где все структуры, содержащие тенасцин, закрашены красным цветом, не содержащие - голубым; при этом отсутствует оптическая гетерогенность внутри соответствующих областей изображения. Граница между структурами четкая, структуры однозначно определяются программами анализа изображений.

Методика определения плотности сосудистой сети

Нами разработана новая методика с использованием анализатора изображения, состоящая из нескольких этапов:

1. Проводится сканирование всей площади гистологического среза, на котором сосуды визуализированы при помощи иммуногистохимической реакции с антителами к эндотелию CD34.

2. Ручное выделение и закрашивание черным цветом участков изображения, не относящихся к опухоли.

3. Регулировка яркостно-контрастных параметров с улучшением визуализации слабой реакции удалением фона.

4. Сдвиг цветов изображения для повышения цветового контраста.

5. Размывание изображения для равномерного окрашивания. Устранение мелких дефектов.

6. Выделение инструментом Magic Wang участков, соответствующих сосудам. Чувствительность инструмента подбирается под конкретное изображение. Выделение сохраняется в a-канале.

7. Контроль точности выделения на исходном изображении (слой Background).

8. Закрашивание выделенных объектов красным цветом.

9. Инвертация выделения (Select/Invers). Выделенными оказываются структуры без сосудов. Выделение закрашивается голубым цветом.

10. Контроль правильности разметки.

11. Определение количества сосудов на единицу площади среза опухоли с помощью программы анализа изображения (Quontinut), т.е. определение плотности сосудистой сети.

По разработанной методике подана заявка на патент.

Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH)

Для определения амплификации гена HER2/neu и выявления анеуплоидии по хромосомам 3,7,17 и делеции локуса 9р21 использовались наборы для флуоресцентной гибридизации фирм «Dako» и «Vysis (Abbott)» и автоматический гибридайзер «Hybridazer Dako». Результаты оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа «Axioscop 40» («Zeiss») c телекамерой «Axiocam» с использованием двойного фильтра для красителей FITC и Texas Red: подсчитывали количество зеленых меток, связанных с центромерным участком 17 хромосомы и количество красных меток, связанных с геном HER2/neu. Наличие или отсутствие амплификации определяли по соотношению красных (ген HER2) и зеленых сигналов (центромерный участок), амплификация считалась обнаруженной при соотношении больше чем 2,2. Анеуплоидию по хромосомам 3,7,17 и делецию локуса 9р21 оценивали с использованием набора Uro Vysion Bladder Cancer Kit (Abbott), содержащего 4 различные по цвету флуоресцентные метки: хромосома 17 – голубой, хромосома 7 – зеленый, хромосома 3 – красный, 9р21 – желтый. Оценку результатов проводили, подсчитывая количество каждой из флуоресцентных меток в 60 клетках опухоли, принимая, что нормой является содержание во всех клетках по 2 сигнала каждой цветной метки.

Метод хромогенной гибридизации in situ (CISH)

Для определения наличия ДНК вируса папилломы человека в клетках уротелиального рака использовали детекционные наборы «Микровирус ВПЧ» (Экспериментальное медико-биологическое производство Кардиологического научно-производственного центра, Россия) и «Rembrandt HPV» (PathPan, Нидерланды). Исследование проводили также с использованием автоматического гибридайзера. После ферментативной предобработки парафиновых срезов и нанесения зондов к ВПЧ разных типов (общему, 6,11, 16, 18, 31, 33) денатурацию ДНК проводили при 95⁰С, а гибридизацию – при 37⁰С в течение 16-18 часов. В качестве хромогена использовали краситель АЕС. Реакцию оценивали с помощью анализатора изображения «Leica Q550».

Также для молекулярно-генетических исследований применялись следующие методы:

1. Лазерная микродиссекция

Микродиссекция выполнялась на депарафинированных срезах толщиной 7мкм с помощью системы лазерной микродиссекции ASLMD (Leica microsystems, Германия). Участки опухоли и окружающей ткани вырезали лазером и собирали в отдельные пробирки.

2. Полимеразно-цепная реакция для определения мутаций гена FGFR.

Для выявления мутаций 7 экзона гена FGFR ПЦР проводили по следующей схеме: к 0.1 мкг геномной ДНК добавляли 0.05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5 мМ MgCl₂. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95⁰С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95⁰С – 30 с, отжиг и элонгация при 58⁰С – 2 мин 30 с. Нуклеотидная последовательность праймеров представлена в таблице 2. Продукты ПЦР разделяли в 6%-ном денатурирующем полиакриламидном геле и окрашивали нитратом серебра.

3. Секвенирование гена FGFR.

Для приготовления пробы на сиквенс вырезанный фрагмент агарозного геля с необходимой ДНК инкубировали при -70°С не менее 30 мин. В жидкость, выдавленную из геля и помещенную в отдельную пробирку, добавляли 3M раствор ацетата натрия (pH=5.2) (1/12 объема) и равный объем изопропанола. Смесь повторно инкубировали при -70°С в течении 30 мин, а затем центрифугировали 15 мин. (миницентрифуга MiniSpin, Eppendorf, 13000 об/мин). Осадок высушивали на воздухе и растворяли в 15-25 мкл бидистиллированной воды. Секвенирование проводилось по протоколам ABI Prism 310 Genetic Analyzer Kits (“Applied Biosystems”, США).

4. Микросателлитный анализ.

Для идентификации потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности (МН) в хромосомных районах 17р13 и 9р21 были использованы 3 высокополиморфных маркера TP53, D9S942, D9S169. В качестве контроля использовали ДНК лейкоцитов периферической крови. ПЦР проводили по следующей схеме: к 0.1 мкг геномной ДНК добавляли 0.05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50мМ KCl, 10мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5мМ MgCl₂. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95⁰С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95⁰С – 30 с, отжиг и элонгация при 58-60⁰С – 2 мин 30с.

Нуклеотидная последовательность праймеров и режимы отжига представлены в таблице 1.


Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров.

Ген	Праймеры	Температура отжига, 0С
TP53	F: cag cct ggg caa taa gag ct gaga ctc R: aac agc tcc ttt aat ggc ag	58
D9S942	F: caa caa agc aag acc ctg tc R: cat ctg cgg ttc ttt cct c	60
D9S169	F: cag tgt aac ctg ggg gc R: ctt tcg att agt tta gca gaa tga g	58
FGFR	F: tgg cgg tgg tgg tga ggg agg R: cca gcc cag gag ccc cag cgg	65