Лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний журнал "Terra Medica nova" №3 (15) 2007

Вид материала

Содержание

Частота основных аутоиммунных заболеваний в США (данные за 1996 г.)
Антинуклеарный фактор и антинуклеарные антитела
НЕр-2 с помощью непрямой иммунофлуоресценции. Совместно с НЕр
Антитела к двуспиральной (нативной) ДНК и антитела к фосфолипидам
Ревматоидный фактор
Антитела к цитруллинированным антигенам
Антинейтрофильные цитоплазматические антитела и антитела к эндотелию
Huvec («euroimmun»)
Антитела к гладким мышцам, митохондриям и другие маркеры поражения печени
Аутоантитела при заболеваниях желудочно-кишечного тракта
Saccharomyces cerevisiae
Методы выявления аутоантител в практических лабораториях

Подобный материал:

Лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний

журнал "Terra Medica nova" № 3 (15) 2007

С. В. Лапин, кандидат медицинских наук
А. А. Тотолян, доктор медицинских наук
Научно-методический центр по молекулярной медицине;
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова

Залогом эффективного лечения многих аутоиммунных заболеваний и предотвращения инвалидизации больного является тщательное лабораторное обследование. Его основу составляет выявление аутоантител в сыворотке крови и биологических жидкостях. В обзоре представлены принципиальные подходы к использованию аутоантител в качестве диагностических маркеров, описаны основные семейства аутоантител и применение конкретных серологических тестов в диагностике широкого спектра аутоиммунных заболеваний.

Заболевания, в патогенезе которых лежит патологическая реакция иммунной системы против собственных антигенов организма, относят к аутоиммунным. Врачам практически всех специальностей приходится сталкиваться с аутоиммунными процессами. Аутоиммунные состояния преобладают в ревматологии, нефрологии, дерматологии, часто отмечаются в гастроэнтерологии, неврологии, пульмонологии и многих других терапевтических специальностях (табл. 1). Распространенные аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, инсулинзависимый сахарный диабет, системные заболевания соединительной ткани, ускоряют течение атеросклероза и приводят к сердечно-сосудистой патологии. В основе атеросклероза, как полагают многие исследователи, лежит аутоиммунная реакция в отношении компонентов соединительной ткани сосудистой стенки и компонентов плазмы крови.

Таблица 1. Частота основных аутоиммунных заболеваний в США (данные за 1996 г.)

Механизмы нарушения иммунологической толерантности при аутоиммунных заболеваниях изучены плохо. Очевидно, что важную роль играет генетическая предрасположенность, обусловленная набором генов системы HLA, которые определяют направление иммунного ответа. На фоне предрасположенности определенное сочетание факторов внешней среды, включающее тканевое воспаление, вирусные и бактериальные инфекции, разрушение ткани или нарушение функций гематотканевых барьеров, приводит к сенсибилизации по отношению к собственным антигенам.

Хотя клеточный иммунный ответ лежит в основе аутоиммунных заболеваний, однако до сих пор не существует надежных и стандартизованных методов определения клеточных реакций против собственных антигенов. В то же время гуморальные иммунные ответы, характеризующиеся появлением аутоантител, широко используются в диагностике аутоиммунных заболеваний.

Аутоантитела представляют собой иммуноглобулины классов IgG, IgA, IgM, специфически связывающиеся с антигенными эпитопами молекул человеческого организма, хотя в лабораторных методах иногда используются близкие или идентичные человеческим антигены лабораторных животных. Известно, что аутоантитела, реагирующие с человеческими антигенами, изредка могут отмечаться на фоне нормального функционирования иммунной системы. Характерно, что в норме или на фоне неиммунных заболеваний аутоантитела выявляются в низких титрах, т. е. обладают низкой аффинностью. Среди аутоантител, которые чаще других отмечаются в норме, выделяют антинуклеарные антитела, небольшое содержание которых может быть выявлено у 2–3% здоровых лиц, несколько чаще — у пожилых, а также ревматоидный фактор, встречаемость которого в пожилом возрасте может достигать 10% популяции. Сравнительно часто на фоне неиммунных заболеваний выявляются антикардиолипиновые антитела, антитела к тиреопероксидазе и тиреоглобулину. Причина появления аутоантител на фоне нормального функционирования иммунной системы неизвестна, однако, как полагают, аутоантитела в норме могут играть определенную роль в осуществлении аутотолерантности и предотвращении развития аутоиммунных процессов.

Роль аутоантител в патогенезе большинства аутоиммунных процессов четко не определена. При подавляющем большинстве аутоиммунных заболеваний аутоантитела не принимают участия в конкретных патогенетических механизмах и являются свидетелями аутоиммунного процесса. Действительно, практически при каждом аутоиммунном заболевании может быть определена группа так называемых серонегативных форм, при которых аутоантитела не обнаруживаются даже при классическом течении заболевания. Прежде всего, это связано с несовершенством применяемых лабораторных методов, и по мере описания новых разновидностей аутоантител группа «серонегативных» пациентов сужается. В то же время этот факт подчеркивает разнообразие мишеней аутоантител и широкую направленность иммунного ответа.

Антинуклеарный фактор и антинуклеарные антитела

Антинуклеарные антитела (АНА) представляют собой семейство аутоантител, насчитывающее около 200 разновидностей, которые способны связываться с нуклеиновыми кислотами и ассоциированными с ними белками. Они встречаются более чем у 90% пациентов с диффузными заболеваниями соединительной ткани, такими как системная красная волчанка, склеродермия, смешанное заболевание соединительной ткани, синдром Шегрена, аутоиммунные заболевания печени. Представители этого семейства аутоантител могут быть обнаружены при множестве инфекционных, воспалительных и онкологических заболеваний. Все это обусловливает большое клиническое значение серологического обследования больных с подозрением на системное аутоиммунное заболевание. Действительно, тесты по определению АНА являются наиболее часто выполняемыми лабораторными анализами во всех клинических иммунологических лабораториях.

Общепризнанный стандарт определения АНА — выявление антинуклеарного фактора (АНФ) на перевиваемой клеточной линии НЕр-2 с помощью непрямой иммунофлуоресценции. Совместно с НЕр-2 клетками может использоваться печень приматов, применение которой улучшает выявление некоторых разновидностей АНА. Этот подход широко используется в наборах для непрямой иммунофлуоресценции, предлагаемых немецкой фирмой «EUROIMMUN». Подобный подход позволяет лучше дифференцировать ряд антинуклеарных антигенов, включая SSA, RNP, Ku. Другим надежным субстратом является модифицированная линия клеток НЕр-2 — клетки Hep-20–10, обладающая высоким митотическим потенциалом и увеличивающая выявляемость антител к антигенам митотических клеток, таких как PCNA и центромеры. Некоторые фирмы («Immunoconcepts», США) предлагают также клетки Hep-2000, которые содержат дополнительный ген SSA антигена и обладают повышенной чувствительностью для его выявления.

Результат метода выражается в титре, который указывает на содержание и аффинность аутоантител. Норма составляет менее 1/80, причем низкие титры АНФ 1/80–1/160 изредка могут отмечаться у клинически здоровых лиц. Обнаружение высоких титров АНФ более 1/320 с большей вероятностью указывает на системное ревматическое заболевание. Кроме определения титра, АНФ на перевиваемой клеточной линии НEр-2 позволяет описать тип свечения ядра клетки, который указывает, с какими антигенными мишенями взаимодействуют аутоантитела. Определяются 6 основных типов свечения и около 20 минорных типов свечения, описание которых самостоятельного диагностического значения не имеет. Гомогенный и периферический типы свечения ядра наиболее характерны для системной красной волчанки; гранулярный отмечается при синдроме Шегрена, смешанном заболевании соединительной ткани и артритах; ядрышковый и центромерный типы свечения характерны для склеродермии и ее разновидностей. Цитоплазматический тип свечения клетки отмечается при аутоиммунных заболеваниях печени.

К сожалению, в связи с методическими ограничениями, в большинстве отечественных лабораторий популярность получили скрининговые иммуноферментные тесты для определения антинуклеарных антител (антител к экстрагируемым ядерным антигенам), основанные на методе ИФА. Их иногда приравнивают к определению АНФ, хотя мы считаем целесообразным называть термином «АНФ» только иммунофлуоресцентный тест выявления АНА. Иммуноферментные тесты определяют АНА, направленные только к растворимым антигенам ядра клетки. По нашему опыту, они могут упускать до трети положительных результатов выявления АНА, и в то же время эти методы являются сравнительно неспецифичными.

После обнаружения АНФ или антител к экстрагируемым ядерным антигенам необходимо установить клеточную мишень АНА, так как определение спектра АНА тесно связано с конкретным диагнозом. Минимальный набор обычно включает определение антител к Sm, RNP, SS-A и SS-B антигенам, а также Scl-70, CENT-B и Jo-1. Такой спектр обобщает наиболее часто встречающиеся мишени АНА, а также основные ревматические заболевания.

Одним из наилучших подходов к определению спектра АНА является использование метода иммуноблота, который представляет собой надежную (и более дешевую) альтернативу ИФА. Так, в лайн-блоте «АНА-профиль 3», основанном на очищенных и рекомбинантных антигенах, производимом фирмой «EUROIMMUN», в одном тесте выявляются антитела к 15 различным внутриклеточным антигенам, охватывающим большинство ядерных мишеней АНА.

Антитела к двуспиральной (нативной) ДНК и антитела к фосфолипидам

Антитела к двуспиральной ДНК (дсДНК) являются высокоспецифичным маркером СКВ, что позволяет широко использовать их в диагностике этого заболевания. При СКВ антитела к дсДНК могут обнаруживаться приблизительно у 40–60% больных и практически не выявляются при других заболеваниях. Антитела к дсДНК вовлекаются в развитие волчаночных васкулитов и люпус-нефрита. Определение антител к дсДНК и гипокомплементемии представляет собой важные иммунологические тесты, выявляющие категорию больных СКВ с высоким риском развития волчаночного гломерулонефрита. Антитела к дсДНК следует отличать от антител к односпиральной или денатурированной ДНК, так как последние самостоятельного диагностического значения не имеют и могут появляться на фоне вирусных и бактериальных инфекций. Метод ИФА является основным методом обнаружения антител к дсДНК в нашей стране, однако он сравнительно неспецифичен, так как наряду с антителами к дсДНК он определяет антитела к осДНК. Мы рекомендуем использовать выявление антител к дсДНК только совместно с АНФ, так как в противном случае около 10% результатов оказываются ложноположительными, что может привести к ошибочному диагнозу СКВ.

У ревматологических пациентов также часто выявляются антитела к фосфолипидам. Антифосфолипидный синдром, связанный с появлением антифосфолипидных антител, представляет собой наиболее частое иммуноопосредованное нарушение коагуляции, которое проявляется рецидивирующими артериальными и венозными тромбозами, хроническим невынашиванием беременности и тробоцитопенией.

Основным представителем семейства антифосфолипидных антител являются антитела к кардиолипину (АКЛ). Целесообразно выявлять АКЛ классов IgG и IgM, которые входят в клинико-лабораторные критерии антифосфолипидного синдрома. Важно подчеркнуть, что только высокие титры АКЛ, превышающие 20 GPL/MPL, тесно ассоциированы с тромбозами, в то время как низкие титры могут быть индуцированы инфекционными заболеваниями. При СКВ можно обнаружить АКЛ в 20–25% случаев, что позволяет использовать их выявление в качестве дополнительного метода диагностики системных заболеваний. Функциональным тестом, характеризующим влияние антител на каскад коагуляции, является определение волчаночного антикоагулянта.

В практической диагностике антифосфолипидного синдрома в качестве первого теста мы рекомендуем выполнение коагулограммы с определением активированного частичного тромбопластинового времени, которое отражает нарушение свертывания под действием АКЛ. В нашей практике у большинства больных выявление АКЛ сочетается с увеличением титров АНФ, что подчеркивает родство антифосфолипидного синдрома и системных ревматических заболеваний. Для подтверждения диагноза или сомнительных результатах целесообразно выявление антител кβ ₂-гликопротеину, который представляет собой белковый кофактор АКЛ.

Ревматоидный фактор

Ревматоидный фактор (РФ) представляет собой семейство аутоантител, направленных против Fc фрагмента молекулы IgG. Чаще всего выявляется РФ класса IgM. Распространенность при ряде ревматических заболеваний позволяет отнести РФ к наиболее часто встречающимся аутоантителам.

Основное применение выявление РФ нашло в диагностике ревматоидного артрита (РА). При классическом РА можно обнаружить ревматоидный фактор у 70–80% больных, что позволяет классифицировать ревматоидный артрит на серопозитивную и серонегативную формы. Установлено, что серонегативный РА протекает мягче и реже приводит к тяжелым формам деструкции суставов. Однако такое деление не абсолютно, так как нередки случаи сероконверсии из серонегативной в серопозитивную форму. При эффективном лечении титры РФ могут снижаться и быть меньше детектируемых. Кроме того, выявление РФ позволяет выделить форму серонегативных спондилоартропатий, к которым относят болезнь Бехтерева и реактивные артриты, при которых РФ отсутствует.

Основным недостатком РФ в качестве диагностического маркера РА является отсутствие его на ранних этапах ревматоидного артрита, что не позволяет объективизировать диагноз артрита и назначить раннее лечение, которое помогает предупредить развитие суставных эрозий. Для ранней диагностики РА большое значение имеет выявление антител к цитруллинированным белкам (см. ниже).

Другим заболеванием, связанным с наличием РФ, является синдром Шегрена, представляющий аутоиммунное поражение слюнных и слезных желез, которое приводит к тяжелым формам поражения глаз. При этом заболевании РФ отмечается у 90–95% больных, что делает его важным лабораторным показателем.

Наконец, РФ отмечается у подавляющего большинства больных с эссенциальной смешанной криоглобулинемией, которая является формой первичных васкулитов. Эссенциальная криоглобулинемия характеризуется появлением в сыворотке крови криоглобулинов, белков, способных преципитировать при снижении температуры ниже температуры ядра тела. В результате на коже конечностей возникает геморрагический васкулит, развиваются артрит, полиневрит и, в тяжелых случаях, гломерулонефрит. Криоглобулины представлены иммуноглобулинами разных классов, один из которых обладает активностью РФ. Основной причиной развития криоглобулинемии является инфицирование вирусным гепатитом С, которое запускает синтез аутоантител.

Антитела к цитруллинированным антигенам

Наряду с РФ антитела к цитруллинированным антигенам (АЦА) являются диагностическими маркерами РА. Первые представители этого семейства, антикератиновые антитела и антиперинуклеарный фактор, были описаны еще в 60-х годах прошлого века. Однако широкое применение они получили после разработки ИФА методов определения антител к циклическому цитруллиновому пептиду (АЦЦП). Эти аутоантитела могут появляться в сыворотке крови за 1 год до начала заболевания, и их встречаемость в дебюте РА составляет 40–50%, что значительно выше встречаемости РФ, которая не превышает 10–15% в начале заболевания.

Именно благодаря высокой встречаемости в дебюте РА, а также специфичности, близкой к 95% (против 70% для РФ), определение АЦЦП стало золотым стандартом диагностики раннего РА. В большинстве случаев иммунологическое подтверждение клинического диагноза дебюта РА становится основой раннего назначения терапии и сохранения функции суставов у пациентов с этим тяжелым заболеванием.

Широко используемый нами в практической диагностике РА набор для выявления АЦЦП, производимый фирмой «EUROIMMUN», обладает хорошими диагностическими параметрами. Эта тест-система дешевле и, в отличие от имеющихся на российском рынке аналогов, использует общепринятый ТМВ-субстрат для хромогенной детекции.

Антинейтрофильные цитоплазматические антитела и антитела к эндотелию

Для диагностики гранулематозных васкулитов основным иммунологическим методом является обнаружение антинейтрофильных цитоплазматических антител (АНЦА), направленных против антигенов гранул цитоплазмы нейтрофилов. На первом этапе тестирования необходимо выявлять АНЦА с помощью непрямой иммунофлуоресценции с описанием типа свечения. Для иммунофлуресцентной детекции антител к нейтрофилам обычно используются нейтрофилы донора, фиксированные этанолом, которые позволяют определить тип свечения ядра. Существенным улучшением этого метода является комбинация фиксаций клеток этанолом и формальдегидом, которую предлагает фирма «EUROIMMUN», что позволяет точнее дифференцировать цитоплазматический тип окрашивания клеток.

Так, цитоплазматический тип свечения АНЦА характерен для гранулематоза Вегенера, а перинуклеарный тип АНЦА отмечается преимущественно при микроскопическом полиартериите и синдроме Черга — Штраусс. После определения типа свечения АНЦА возможно проведение уточняющих тестов, характеризующих антигенные мишени аутоантител, основными из которых являются протеиназа-3 и миелопероксидаза. Содержание АНЦА снижается при эффективной терапии гранулематозных васкулитов, и повышается за месяц до обострения гранулематоза Вегенера, что позволяет мониторировать эффективность терапии.

Антиэндотелиальные антитела (АЭА) составляют гетерогенную группу антител, направленных к антигенным детерминантам эндотелиальных клеток. Точная природа антигенов не установлена, неясно, могут ли они представлять собой белки, конститутивно экспрессированные на поверхности эндотелиальных клеток, либо их продукция индуцируется под действием воспалительных цитокинов. Методом определения АЭА является метод непрямой иммунофлуоресценции на клетках пуповины человека (HUVEC). Для рутинного выявления АЭА мы используем миокард обезьяны и культуру клеток HUVEC («EUROIMMUN»),

АЭА были обнаружены при многих первичных васкулитах и васкулопатиях. Сравнительно часто они отмечаются при болезни Кавасаки, гранулематозных васкулитах, пурпуре Шенлейна — Геноха и вторичных васкулопатиях, в частности, облитерирующем тромбангиите (болезни Бюргера), гемолитической тромбоцитопенической пурпуре, антифосфолипидном синдроме.

Таким образом, выявление АЭА сравнительно неспецифично для определенной формы васкулита и рассматривается в качестве общего диагностического маркера васкулитов и васкулопатий. Аутоантитела определяются преимущественно на фоне выраженной клинической активности васкулита, что позволяет ориентироваться на их содержание для мониторинга терапии.

Антитела к гладким мышцам, митохондриям и другие маркеры поражения печени

Антитела к гладким мышцам, направленные против фибриллярного актина (F-актина), выявляются с помощью непрямой иммунофлуоресценции. Они отмечаются у 70–80% больных с аутоиммунным гепатитом 1 типа, обычно совместно с антинуклеарным фактором. Аутоиммунный гепатит 1-го типа является наиболее частой клинической формой аутоиммунных заболеваний печени и обычно эффективно контролируется иммуносупрессивной терапией. Дополнительным серологическим маркером аутоиммунного гепатита взрослых являются антитела к растворимому печеночному антигену (SLA).

Аутоиммунный гепатит 2-го типа отмечается преимущественно у детей и характеризуется выявлением аутоантител к микросомам печени и почек (LKM-антител) и антител к цитозольному антигену печени (LC-1). Антинуклеарный фактор нередко является единственной находкой при аутоиммунном гепатите как у детей, так и у взрослых, и при этом заболевании ассоциирован с гипергаммаглобулинемией в протеинограмме. По нашим данным, при криптогенном гепатите и циррозе удается обнаружить печеночные аутоантитела, что подтверждает аутоиммунный генез цирроза только у 20–30% взрослых больных и 70–80% детей.

Таким образом, значительная часть взрослых пациентов с криптогенным гепатитом имеет другие причины поражения печени, что, по всей видимости, отражает характер причин поражения печени в популяции Санкт-Петербурга. Наши исследования также показывают, что низкие титры антител к гладким мышцам и АНФ отмечаются у 5–6% больных с вирусными гепатитами и отсутствуют при хроническом алкоголизме.

Другой серологический маркер заболевания печени — антитела к митохондриям, появляющиеся на фоне первичного билиарного цирроза. Антимитохондриальные антитела представляют собой семейство аутоантител, насчитывающее 9 представителей, реагирующих с различными антигенами митохондрий.

Для первичного билиарного цирроза наиболее характерны М2-антитела, указывающие на его тяжелое течение. Основным антигеном этих аутоантител, отмечающихся при ПБЦ, является пируватдекарбоксилазный комплекс митохондрий. Для диагностики первичного склерозирующего холангита может быть использовано выявление АНФ и АНЦА, которые отмечаются у 50–60% пациентов с этим заболеванием.

Хорошо зарекомендовал себя набор реактивов для выявления аутоантител к печеночным антигенам фирмы «EUROIMMUN» методом лайн-блота. Действительно, многие методы выявления аутоантител, основанные на ИФА, оказываются малоспецифичными и дают большое количество ложноположительных реакций. Метод лайн-блота существенно превосходит ИФА и позволяет в одном тесте проводить обследование пациентов с аутоиммунными заболеваниями печени.

Аутоантитела при заболеваниях желудочно-кишечного тракта

Кроме гастрита, вызванного инфекцией Helicobacter pylori, частой причиной атрофического поражения желудка является аутоиммунный гастрит или гастрит типа А, связанный с появлением аутоантител к обкладочным клеткам желудка. Обкладочные клетки, расположенные преимущественно в фундальном отделе желудка, синтезируют соляную кислоту и фактор Кастла, который необходим для связывания витамина В₁₂ в кишечнике. Их истребление под действием аутоантител приводит к атрофическому гипоацидному гастриту, рефлюкс-эзофагиту и, с течением времени, к пернициозной анемии, обусловленной дефицитом витамина В₁₂. Основной метод диагностики аутоиммунного гастрита — выявление аутоантител к обкладочным клеткам желудка с помощью непрямой иммунофлуоресценции на криосрезах желудка крысы.

В основе целиакии лежит непереносимость клейковины злаковых, основным антигеном которой является α-глиадин. Наряду с дефицитом лактазы и пищевыми аллергиями, целиакия является наиболее частой причиной пищевой непереносимости. α-Глиадин на 60% состоит из аминокислоты глютамина, которая подвергается дезаминированию под действием тканевого фермента трансглутаминазы. Тканевая трансглутаминаза дезаминирует также ряд белков соединительной ткани в составе эндомизиальных и ретикулиновых волокон. В результате патологического иммунного ответа на экзогенный антиген появляются антитела к α-глиадину, а также аутоантитела, направленные на тканевую трансглутаминазу, антигены эндомизия и ретикулина. Наилучшие клинико-лабораторные характеристики имеет тест выявления антител к эндомизию класса IgA, которые отмечаются у 95% больных целиакией. Другие серологические маркеры, в том числе антитела к глиадину и тканевой трансглутаминазе, менее специфичны. Для повышения информативности обследования целесообразно использовать сочетание этих тестов.

Диагностика воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), таких как болезнь Крона (БК) и неспецифический язвенный колит (НЯК), также основана на их иммунопатогенезе. В основе БК лежит утрата толерантности к антигенам пищи, в результате чего развивается иммунный ответ на антигены пищи и антигены содержимого кишки.

Для диагностики БК используется выявление антител к пекарским дрожжам Saccharomyces cerevisiae (ASCA), которые являются естественным антигеном. Данные антитела появляются у 60–70% пациентов с БК. В отличие от БК, НЯК близок по патогенезу к гранулематозным васкулитам, что позволяет использовать выявление АНЦА в качестве основного иммунологического метода диагностики. Учитывая близость симптоматики ВЗК, целесообразно использовать оба серологических маркера совместно, что обеспечивает специфичность, достигающую 95–98% в дифференциальной диагностике этих заболеваний.

Перспективной разработкой являются субстратные мозаики для непрямой иммунофлуоресценции фирмы «EUROIMMUN» для диагностики ВЗК. Они включают одновременное выявление антител к экзокринной части поджелудочной железы, АНЦА, ASCA и антител к бокаловидным клеткам кишечника. Использование этого метода позволяет выявлять 80% пациентов с ВЗК, позволяя избежать крайне неприятных для пациента диагностических процедур при этом заболевании.

Методы выявления аутоантител в практических лабораториях

Методически выявление аутоантител отличается от других лабораторных тестов, так как оно предполагает определение не только концентрации, которая характеризуется числом молекул иммуноглобулина, реагирующих с антигеном, но и аффинности, указывающей на сродство антител к антигену. Широко распространенный метод иммуноферментного анализа измеряет преимущественно концентрацию аутоантител, и его результаты часто зависят от концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови.

С помощью другого важного метода серологической диагностики — непрямой иммунофлуоресценции — измеряется преимущественно аффинность. Этот метод позволяет определить конечный титр, который зависит от силы связывания антитела с антигеном. Существенно снизить стоимость обследования пациентов позволяет метод иммуноблота. В этом случае несколько антигенов наносятся на мембрану-подложку, а связывание аутоантител с антигенами детектируется с помощью хромогенного субстрата, образующего нерастворимый преципитат. За счет этого может быть одновременно исследовано связывание антител с 15 и более антигенными белками.

Выявление аутоантител обычно происходит в два этапа: на первом этапе тестирования применяется наиболее чувствительный метод, в котором используется максимально широкий спектр антигенов. Наиболее подходящим для этого является метод непрямой иммунофлуоресценции (табл. 2). Обычно тканевой субстрат содержит широкий спектр тканевых антигенов, который позволяет не только установить связывание антител с предполагаемым антигеном, но и исключить неспецифические реакции.

Таблица 2. Пример использования метода непрямой иммунофлуоресценции (нРИФ) для выявления антинуклеарных антител (а), антинейтрофильных антител (б) и
антител при аутоиммунных заболеваниях печени (в) (реактивы компании «EUROIMMUN», Германия)

А)

Б)

В)

Кроме того, может быть установлено присутствие других разновидностей полиспецифичных аутоантител, например антинуклеарных или антимитохондриальных. Уточнение специфичности обнаруженных аутоантител возможно при использовании подтверждающих тестов, назначенных по результатам первичного тестирования. В качестве подтверждающих тестов целесообразно использовать методы, основанные на иммуноферментном анализе или иммуноблоте, в которых применяются высокоочищенные или рекомбинантные антигены.

Заключение

Серологическая диагностика аутоиммунных заболеваний при умелом использовании является мощным диагностическим инструментом (табл. 3). Тем не менее со стороны клинициста необходимо знание принципов и понимание основных методических подходов к лабораторной диагностике данной группы заболеваний. Немаловажным фактором является тесное сотрудничество клинических и лабораторных специалистов, позволяющее постоянно совершенствовать диагностические методы и алгоритмы их использования.

Таблица 3. Серологические тесты для диагностики аутоиммунных заболеваний, используемые в Научно-методическом центре МЗиСР по молекулярной медицине на базе СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова

Список литературы

Лапин С. В. Антинуклеарные антитела: лабораторные тесты и диагностическое значение / С. В. Лапин, А. А. Тотолян // Медицинская иммунология. — 2001. — Т. 3, № 1. — С. 35–50.
Лапин С. В. Диагностика поражения почек при системных аутоиммунных заболеваниях / С. В. Лапин, А. А. Тотолян // ¬Нефрология. — 2002. — Т. 6, № 3. — С. 79–86.
Лапин С. В. Иммунологические методы диагностики васкулитов в нефрологии / С. В. Лапин, А. А. Тотолян // Нефрология — 2003.— Т. 7. № 1. — С. 50–56.
Лапин С. В. Клиническое значение антител к циклическому цитруллинированному пептиду (CCP) при раннем ревматоидном артрите / С. В. Лапин, А. Л. Маслянский, Е. П. Иливанова, В. И. Мазуров, А. А. Тотолян // Медицинская иммунология. — 2004. — Т. 6, № 1–2. — С. 57–66.
Лапин С. В. Роль антифилаггриновых аутоантител в серологической диагностике ревматоидного артрита (обзор литературы) / С. В. Лапин, А. А. Тотолян // Клин. лаб. диагностика. — 2004. — № 11. — С. 3–10.
Лапин С. В. Сравнительная характеристика специфических аутоантител при ревматоидном артрите / С. В. Лапин, А. Л. Маслянский, В. И. Мазуров, А. А. Тотолян // Терапевтический архив. — 2005. — № 12. — С. 53–59.
Лапин С. В. Иммунологическая лабораторная диагностика ревматических заболеваний, пособие для врачей / С. В. Лапин, Т. А. Тотолян. — СПб. : «Человек», 2006. — 128 с.: ил.
Shoenfeld Y. Autoimmune Disease «The Enemy from Within» / Y. Shoenfeld. — BioRad Labs. Publ., 2003. — 94 p.
Peter B .J. Autoantibodies / B. J. Peter. — Elsevier, 1996. — 584 p.

Blog

Лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний журнал "Terra Medica nova" №3 (15) 2007

Содержание