Geum.ru

Содержит 180 страниц, 39 таблиц, 26 рисунков. Ключевые слова

Вид материалаОтчет

Содержание


Проведен анализ
Pisum. sativum
Проведен анализ
Agrobacterium rhizogenes
Подобный материал:

РЕФЕРАТ



Отчет содержит 180 страниц, 39 таблиц, 26 рисунков.

Ключевые слова: генетика человека, пренатальная диагностика, белковая наследственность, прионы млекопитающих и дрожжей, генетическое моделирование, микробно-растительные системы, трансгенные растения, устойчивость к вредителям, соматическая гибридизация.

Объектом исследования является: 1) медико-генетические проблемы, включающие в себя изучение генов предрасположенности человека к некоторым заболеваниям и исследования по функциональной геномике хромосом человека; 2) механизмы прионного превращения белков и белковая наследственность; 3) изучение и характеристика агентов, блокирующих агрегацию прионной формы белка PrP мыши в дрожжах; 4) изучение взаимодействия организмов в биоценозах: а) картирование генов, ответственных за продуктивность гороха, б) изучение взаимосвязи между специфичностью утилизации корневых выделений различных сельскохозяйственных культур ризобактериями и их антагонистической активностью против фитопатогенных грибов в ризосфере, в) моделирование и построение обобщенной схемы действия комплекса микроэволюционных факторов, направляющих формирование высокоэффективных симбиозов в условиях Северо-запада России, 5) изучение горизонтального переноса генов у некоторых представителей семейства Solanaceae; 6) разработка экологически безопасных методов защиты растений: а) с использованием методов генетической инженерии получение растений табака и картофеля с модифицированным метаболизмом стеринов и их характеристика, б) на основе соматической гибридизации получение новых перспективных форм растений картофеля и томатов, устойчивых к вредителям сельского хозяйства.

Целью научных исследований является разработка молекулярно-генетических методов диагностики и лечения наследственных болезней человека и болезней экологической этиологии; создание тест-систем для скрининга антиприонных агентов; изучение взаимодействия организмов в биоценозах; разработка экологически безопасных методов защиты растений.

В работе используются методы классической и молекулярной генетики: гибридологический анализ, популяционно-генетические методы, методы генной и клеточной инженерии (среди них методы трансформации клеток растений, животных и микроорганизмов, секвенирование генов, полимеразная цепная реакция, гибридизация нуклеиновых кислот и т.д.), цитогенетические и иммунологические методы.

Использовано оборудование и химические реактивы, применяемые в молекулярно-биологических и молекулярно-генетических исследованиях: ультра- и микроцентрифуги, амплификаторы и секвенаторы ДНК, низкотемпературные холодильники, трансиллюминаторы, приборы для электрофоретического анализа ДНК и белков и т.д., реагенты для приготовления культуральных сред, ферменты для генной инженерии, гормоны для регуляции роста клеточных культур и т.д.).

За период 2006 – 2008 гг. получены следующие результаты:

Результаты работы:

1. Изучение генов предрасположенности человека к некоторым заболеваниям и исследования по функциональной геномике хромосом человека.

Проведен анализ наследственной предрасположенности к эндометриозу, изучены особенности полиморфизма генов ренин-агиотензиновой и брадикинин- кининовой систем , аллельные варианты которых ответственны за первичную гипертонию у детей. Завершается разработка биочипов и начаты масштабные популяционные исследования по изучению частот аллельных вариантов генов сердечно-сосудистой системы и генов метаболизма, ответственных за эффективность работы системы детоксикации ксенобиотиков; с помощью иммунноцитохимических и цитогенетических методов проведены исследования по функциональной геномике хромосом человека, важные для понимания патогенетических основ «хроматиновых» болезней.

Идентифицирована специфичность распределения 5-метилцитозина вдоль плеч метафазных хромосом из лимфоцитов взрослых индивидов и плодов сроком развития 20-24 недели, клеток печени, легкого и цитотрофобласта хориона эмбрионов 5-12 недель развития, а также доимплантационных зародышей человека на разных стадиях – от зиготы до бластоцисты. Описаны морфологические маркеры, позволяющие идентифицировать пары гомологов и стадиоспецифичные изменения характера метилирования ДНК метафазных хромосом. Установлено, что распределение 5-метилцитозина сегментспецифично и рисунок метилирования ДНК метафазных хромосом может быть охарактеризован как МеС-сегментация. Описанный тип сегментации, свойственный метафазным хромосомам из разных типов клеток, впервые появляется в эмбриогенезе на стадии 8-ми клеток.

В опытах in vivo на лабораторных мышах (биологических моделях) изучены трансфекционные характеристики невирусных носителей генных конструкций, наиболее перспективных по результатам опытов in vitro как новая методика для трансформации клеток человека.

2. Механизмы прионного превращения белков и прионной наследственности.

С использованием модельного генетического объекта – дрожжей-сахаромицетов – разработан метод, позволяющий изучать механизмы превращения нормальных клеточных белков в их патогенную прионнную форму. Идентифицированы гены, влияющие на процесс возникновения и поддержания прионов в клетке. Проведен сравнительный анализ способности к переходу в прионную форму белков – представителей семейства факторов терминации трансляции eRF3 из высших эукариот.

3. Использование тест-системы «белок Sup35 дрожжей – белок PrP мыши» для скрининга антиприонных агентов.

Разработана модель «белок Sup35 дрожжей – белок PrP мыши», которая использована для поиска и оценки действия соединений с антиприонным эффектом. Достоинством модели является то, что она впервые дает возможность проводить массовый скрининг соединений, обладающих потенциальной антиприонной активностью. На этой модели исследованы также белки, ответственные за неинфекционные амилоидозы (болезнь Альцгеймера). Полученные в ходе выполнения работы данные представляют собой теоретическую основу для последующей разработки методов профилактики, диагностики и лечения заболеваний, связанных с амилоидозом.

4. Изучение взаимодействия организмов в биоценозах:

а). Картированы гены, ответственные за продуктивность гороха Pisum. sativum (Crt, Coch, Sym27). Для их локализации на генетической карте была использована серия множественно маркированных линий гороха. Проведен поиск мутаций гороха, гомологичных мутациям модельных бобовых диплоидной люцерны (Medicago truncatula Gaertn.) и лядвенца (Lotus japonicus (Regel.) Larsen). Впервые доказано, что один из секвенированных генов гороха, гомологичных гену NFR1 лядвенца, является геном sym37.

Проведен анализ потенциала взаимовыгодных растительно-микробных взаимодействий гороха для увеличения содержания белка в семенах зернобобовых культур. Для этого 26 генотипов гороха были испытаны в полевых опытах при инокуляции грибами арбускулярной микоризы и клубеньковыми бактериями. В результате трехлетних экспериментов установлена закономерность, что двойная инокуляция грибами арбускулярной микоризы и клубеньковыми бактериями приводит к увеличению семенной продуктивности и массы сухого растения у изученных генотипов гороха и может превышать эффект минеральных удобрений на 30-40%. Доказана целесообразность селекции бобовых на повышение симбиотического потенциала и выделены генотипы для включения в селекционные программы (рекомендация). Инокуляция симбиотической почвенной микрофлорой положительно влияет на содержание белка в семенах, несмотря на отсутствие в некоторых случаях повышения семенной продуктивности. Полученные результаты позволяют дать рекомендации по применению коммерческих инокулянтов, содержащих грибы арбускулярной микоризы и клубеньковые бактерии в сельском хозяйстве.

б). Изучение взаимосвязи между специфичностью утилизации корневых выделений различных сельскохозяйственных культур ризобактериями и их антагонистической активностью против фитопатогенных грибов в ризосфере.

С целью разработки методов биоконтроля фитопатогенов проведен анализ взаимосвязи между специфичностью утилизации корневых выделений различных сельскохозяйственных культур ризобактериями и их антагонистической активностью против фитопатогенных грибов в ризосфере. В исследованиях использовали разработанную нами методику для выявления утилизации отдельных компонентов корневых выделений микроорганизмами, основанную на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии, что позволило анализировать состав питательных веществ в ризосфере, а также выявлять роль состава корневых выделений в процессе конкурентных взаимоотношений фитопатогенных грибов и бактерий-антагонистов. Получены данные по эффективности утилизации корневых выделений огурцов при интродукции в ризосферу биоконтрольного штамма Pseudomonas fluorescens WCS365 и фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum f.-sp. radicis-lycopersici и F. oxysporum VO3-2g. Показано, что инокуляция растений данными микроорганизмами приводит к количественным изменениям в составе корневых выделений. Содержание сахаров в экссудатах томатов и огурцов снижалось во всех вариантах инокуляции, а количество органических кислот у томатов оставалось или на уровне стерильных экссудатов или незначительно возрастало, а у огурцов снижалось, что может быть связано с видовыми различиями реакций данных овощных культур на комплекс биотических и абиотических факторов. Изучение утилизации корневых выделений in vitro показал, что при росте в минеральной среде с корневыми экссудатами в качестве единственного источника питания, бактерии и грибы потребляют более 90% кислот и сахаров как в экссудатах томатов, так и в экссудатах огурцов. Корневые выделения томатов и огурцов поддерживали высокую численность бактерий и грибов in vitro, причем штамм WCS365 ингибировал развитие фитопатогенов, а в ризосфере томатов и огурцов оказывал сильный биоконтрольный эффект, снижая уровень поражения растений грибной инфекцией в среднем на 80%.

5. Изучение горизонтального переноса генов у некоторых представителей сем. Solanaceae.

Проведен поиск последовательностей, подобных онкогенам Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes в геномах растений рода Lycopersicon, Solanum, Capsicum и Physalis методом ПЦР в реальном времени с праймерами, специфичными к онкогенам A. rhizogenes. Подтвержден факт наличия в геноме нетрансформированного N.tabacum последовательностей агробактериальных онкогенов ORF 13, ORF14, rolC; при проведении ПЦР в режиме реального времени с ДНК более 50 видов и праймеров, специфичных к онкогенам A. rhizogenes не было выявлено накопления продукта реакции, что можно интерпретировать как отсутствие в геномах исследуемых растений фрагментов, подобных агробактериальным онкогенам. Разработан научно-методический подход моделирования процесса горизонтального переноса генов от агробактерий к некоторым представителям рода Nicotiana. Проведена агробактериальная трансформация двух видов табака N. Langsdorffii и N.rustica. Эти исследования направлены на поиск и описание бактериальных генов, возможно присутствующих в сельскохозяйственных культурах, что поможет успокоить общественное мнение относительно использования генетически модифицированных пищевых продуктов. Это особенно своевременно теперь, когда генная инженерия сельскохозяйственных культур подвергается нападкам.

Пункты 2, 3, 4 а, б, 5 были выполнены на 1-м, 2-м и 3-м этапах проекта. В задачи 4-го этапа входило выполнение пунктов 4в, 6 а, б.


4. Изучение взаимодействия организмов в биоценозах

4 в. Моделирование и построение обобщенной схемы действия комплекса микроэволюционных факторов, направляющих формирование высокоэффективных симбиозов в условиях Северо-запада России.

Нами были последовательно созданы и проанализированы три варианта математических моделей, направленных на анализ: (1) микроэволюции ризобий, основанной на частот-зависимом отборе и переносе генов; (2) микроэолюции, определяемой взаимодействием Дарвиновского и частот-зависимого отбора; (3) селективных процессов при эволюции мутуалистического симбиоза. Анализ первых двух вариантов модели показал, что благодаря частотзависимому отбору (ЧЗО) в системе могут поддерживаться штаммы ризобий, обладающие сниженной выживаемостью в почве. К их числу могут относиться важные для сельскохозяйственной практики штаммы, обладающие высокой активностью симбиотической азотфиксации. При достаточно высоком давлении ЧЗО такие штаммы не только сохраняются, но и занимают существенное место в структуре бактериальной популяции. Однако, этот эффект функционально не связан с эффективностью мутуалистического симбиоза. Созданная нами методика математического моделирования отношений мутуализма в микробно-растительных симбиозах (модель 3) позволила связать эволюцию мутуалистических свойств бактерий с действием в их симбиотической системе положительных обратных связей меду партнерами.

Проведенная нами работа позволила дополнить и конкретизировать общие представления о роли различных микроэволюционных факторов в формировании бактериальных популяций. Например, анализ модели показал, что действие ЧЗО повышает не только популяционную гетерогенность (это характерно для любых организмов), но и панмиктичность (что особенно важно не только для бактерий, но и для других организмов, размножающихся бесполым путем). Таким образом, ожидаемая степень сходимости математического моделирования с имеющимися экспериментальными данными составила 95%.

Предложенная методика моделирования может быть использована для оценки генетических рисков, связанных с интродукцией в агроценозы модифицированных растительных симбионтов. Считается, что распространение новых конструкций, содержащих гены симбиоза, среди местных бактерий, являющихся фактором риска, связанного с возникновением рекомбинантов с непредсказуемыми инфекционными свойствами. Для снижения этих рисков предлагалось вводить в модифицированные штаммы факторы, подавляющие рекомбинационную активность или выживание в почве. Предложенный нами научно-методический подход показал, что эти меры будут эффективными лишь на фоне низкого давления ЧЗО, который обусловливает размножение редких генотипов. Требуемое снижение давления ЧЗО в системе “растение-почва” может быть достигнуто путем подбора или конструирования генотипов растения-хозяина, которые определяют параметры нелинейной модели конкуренции, в ходе которой осуществляется этот тип отбора. Более радикальный подход для снижения эффектов ЧЗО заключается в регуляции циклической микроэволюции бактерий в симбио-системе, например, при использовании севооборотов, “разрывающих” этот процесс.

6. Разработка экологически безопасных методов защиты растений.

6 а). Получение растений табака и картофеля с модифицированным метаболизмом стеринов с использованием методов генетической инженерии.

На предыдущем этапе реализации данного проекта, на основе разработанного нами научно-методического подхода, показано, что модификация соотношения стеринов у растений изменяет уровень устойчивости к фитофторозу у пасленовых. На данном этапе на основе генно-инженерного метода получены новые формы растений с измененным метаболизмом стеринов. Растения получены при трансформации агробактериальными штаммами, которые впервые созданы нами и содержат отдельные гены синтеза стеринов в смысловой и антисмысловой ориентациях. Среди растений, в которые за счет трансформации перенесены ключевые гены, контролирующие отдельные этапы биосинтеза стеринов, проведен скрининг форм, несущих фрагмент встроенного гена. Показано устойчивое наличие вставки Т-ДНК у полученных трансгенных растений и экспрессия маркерного гена.

Проводится скрининг коллекции трансгенных растений, несущих фрагмент встроенного гена, на устойчивость к фитофторозу in vitro.

6. б). Получение новых перспективных форм растений картофеля, устойчивых к вредителям сельского хозяйства на основе соматической гибридизации.

Методами клеточной инженерии впервые получены соматические гибриды культурного картофеля и диких видов, культурного томата и диких видов, устойчивые к вирусу Y и фитофторозу, что позволит значительно поднять урожайность картофеля и томатов. Полученные методами биотехнологии образцы могут быть предложены как исходный материал для селекционных программ. Разработанные новые способы (пункты 6а и б) получения исходного материала для селекции могут быть использованы как перспективные в программах по биологической защите растений.

Основные конструктивные, технологические и технико-эксплуатационные характеристики:

В ходе выполнения проекта нами охвачен широкий круг вопросов по разработке сбалансированных промышленных и сельскохозяйственных технологий, разработке новых научно-методических подходов к повышению устойчивости биоценозов, выявлению генов предрасположенности человека к инфекционным заболеваниям и заболеваниям экологической этиологии, изучение механизмов прионного превращения белков, лежащего в основе инфекционных нейродегенеративных заболеваний человека и животных. Степень сходимости теоретически полученных результатов с экспериментальными данными достигает 95%.

Степень внедрения:

На основе проведенных исследований созданы микробиологические препараты, которые являются уникальными для России и превосходят имеющиеся в настоящий момент на мировом рынке препараты и технологии. Ожидаемый уровень эффективности препаратов составит не менее 10-15% (превышение урожая над неинокулированным контролем), тогда как в мире производятся препараты с эффективностью 5-7% и менее. К вновь созданным препаратам относятся новые формы «Ризоторфина», а также тройной препарат, включающий клубеньковые и ассоциативные бактерии и микоризу.

Рекомендации по внедрению или итоги внедрения результатов НИР:

Так, ранее в мировой литературе не описаны нарушения в структуре генов, определяющих чувствительность человека к наиболее часто встречающимся мультифакториальным заболеваниям (бронхиальная астма, остеопороз, сердечно-сосудистая патология, эндометриоз). Полученные результаты позволяют впервые проводить обследование населения Северо-запада России с целью генетической паспортизации.

В области исследований прионов дрожжей и моделирования нейродегенеративных заболеваний коллектив традиционно занимает ведущие позиции в мире и во многом определяет направление исследований в этой области. Проведенные исследования позволят детализировать этапы возникновения прионов и выявить роль междоменных взаимодействий в белках-прионах. Эти вновь полученные обобщения могут быть использованы для разработки подходов к предупреждению и лечению прионных заболеваний животных и человека. Описание новых прионов позволяет ответить на вопрос, насколько широко распространен феномен прионов в природе, каково его адаптивное и эволюционное значение.

При исследовании генетических механизмов растительно-микробных взаимодействий в биоценозах впервые разработаны методы определения последовательности работы симбиотических генов; созданы генетические векторы, позволяющие проводить трансформацию растений и микроорганизмов симбиотическими факторами. Впервые в практику предлагается ввести новое теоретическое положение о культивировании не только растения, а ИСМР (интегральную систему «микробы – растение»), как основной рекомендации для земледелия, что позволяет создавать сорта не только растений, значительно превышающих по своему симбиотическому потенциалу существующие, но и комплексные микробиологические препараты.

Область применения:

Методами клеточной инженерии впервые получены соматические гибриды культурного картофеля и диких видов, а также культурного томата и диких видов томата, устойчивые к вирусу Y и фитофторозу, что позволит значительно поднять урожайность перспективных форм. Полученные образцы могут быть предложены как исходный материал для селекционных программ. Трансгенные растения с измененным биосинтезом стеринов рекомендованы как перспективные формы для биологической защиты растений, исключающей использование инсектицидов и фунгицидов. Предложенный способ получения растений, устойчивых к стеринзависимым патогенам является новым научно-методическим подходом в защите растений.

Полученные результаты могут быть использованы в учреждениях медицинского и сельскохозяйственного профиля Северо-западного региона страны с целью снижения экологического риска и нагрузки на генофонд человека.

Экономическая эффективность или значимость работы:

Проведенные исследования и их внедрение в практику позволяют радикально снизить экологический риск и нагрузку на генофонд человеческой популяции, возрастающие вследствие техногенного загрязнения окружающей среды. Экономическая эффективность от использования созданных микробиологических препаратов составила 15% (уровень повышения урожая по сравнению с контролем).

Прогнозные предположения о развитии объекта исследования:

Выполненные исследования являются одним из ключевых подходов для оздоровления экологической обстановки и улучшения условий жизни на Северо-западе России на основе широкого использования экологически безопасных методов ведения сельского хозяйства, основанных на минимизации антропогенной нагрузки на окружающую среду. Основным подходом здесь является широкое использование микробных препаратов, инокуляция которыми культурных растений повышает их продуктивность за счет фиксации атмосферного азота или мобилизации нерастворимых почвенных фосфатов (что позволяет в несколько раз снизить уровень использования соответствующих минеральных удобрений), биоконтроля фитопатогенов (что позволяет резко сократить использование гербицидов и пестицидов), а также адаптации к стрессам и регуляции развития.

Результаты генетической паспортизации уже используются единичными лечебными учреждениями (НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН) для учета уникальных особенностей генома каждого человека при выработке способов профилактики и лечения заболеваний. Следует продолжать внедрение «генетической паспортизации» в разные регионы России.

Результаты о возникновении прионов могут быть использованы для разработки подходов к предупреждению и лечению прионных заболеваний животных и человека. Осуществлен поиск и впервые дано описание новых прионов с целью ответа на вопрос, насколько широко распространен феномен прионов в природе, каково его адаптивное и эволюционное значение.