Морфогенез метаплазий, дисплазий и аденокарцином в пищеводе Барретта (иимуногистохимическое исследование) 14. 00. 15 патологическая анатомия
| Вид материала | Исследование |
- Рабочая программа учебной дисциплины патологическая анатомия, клиническая патологическая, 480.03kb.
- Общая патологическая анатомия, 283.39kb.
- Патологическая анатомия и дифференциальная диагностика рака большого сосочка двенадцатиперстной, 388.21kb.
- Примерная программа наименование дисциплины Патологическая анатомия, клиническая патологическая, 594.5kb.
- Примерная программа по дисциплине патологическая анатомия для аттестации на категорию., 363.01kb.
- Ф-программа вступительного экзамена в аспирантуру Утверждаю, 254.47kb.
- Патологическая анатомия это медико-биологическая наука, изучающая структурные и морфологические, 1590.52kb.
- Образовательный стандарт послевузовской профессиональной подготовки специалистов Специальность:, 2258.78kb.
- Пояснительная записка к учебной дисциплине Эпизоотология и инфекционные болезни животных, 166.41kb.
- Адаптация недоношенных новорожденных детей при церебральной ишемии (клинико-функциональное, 394.95kb.
На правах рукописи
Ахметов Тимур Рустэмович
Морфогенез метаплазий, дисплазий и аденокарцином
в пищеводе Барретта
(иимуногистохимическое исследование)
14.00.15 – патологическая анатомия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва, 2007
Работа выполнена в ГУ ВПО «Казанский ГМУ Росздрава»
Научный руководитель:
Доктор медицинских наук Цыплаков Дмитрий Эдуардович
Официальные оппоненты:
Член-корр. РАМН, профессор, доктор медицинских наук Франк Георгий Авраамович
(Московский научно-исследовательский онкологический институт им.П.А.Герцена)
Доктор медицинских наук, профессор Бабиченко Игорь Иванович
(Российский Университет Дружбы Народов, Москва)
Ведущее учреждение:
НИИ морфологии РАМН
Защита состоится «9» ноября 2007 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 при Российском государственном медицинском университете (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета (117997, г.Москва, ул.Островитянова, д.1).
Автореферат разослан «9» октября 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Щеголев А.И.
Общая характеристика работы.
Актуальность Увеличение частоты злокачественных новообразований пищевода, особенно аденокарциномы, а также неблагоприятный прогноз при этой патологии требует поиска точных методов ранней диагностики предраковых и фоновых состояний пищевода, позволяющих определять врачебную тактику и имеющих прогностическое значение.
Пятилетняя выживаемость при раке пищевода составляет лишь 10 % (результаты мониторинга EUROCARE -2 в Европе) и не зависит от гистологического типа опухоли и степени ее дифференцировки. Низкий уровень пятилетней выживаемости отчасти связан с поздней диагностикой рака пищевода. По данным Аксель Е.М. (2006 г.), в 1996, 2000 и 2004 годах в России подавляющее большинство случаев рака пищевода (71,6%, 73,3% и 70,0% соответственно) диагностировалось в III - IV стадиях заболевания.
Наиболее частой опухолью пищевода до недавнего времени являлся плоскоклеточный рак (до 90-95% злокачественных новообразований). В России, США, странах Западной Европы, а также в ряде стран Азии в течение последних 50 лет отмечается значительный подъем заболеваемости аденокарциномой пищевода, частота возникновения которой в отдельных регионах достигает уровня заболеваемости плоскоклеточным раком.
Как показано в большом количестве работ, риск развития аденокарциномы пищевода связан с железистой метаплазией эпителия, получившей название «пищевод Барретта». До 80-90% случаев аденокарциномы дистального отдела пищевода развивается на фоне пищевода Барретта (ПБ) (Falk G . W ., 2003). Аденокарцинома пищевода развивается у 0,5% больных в год при легкой дисплазии, и у 6% больных в год при тяжелой дисплазии на фоне ПБ (А.С. Трухманов, 2001). В среднем, риск возникновения аденокарциномы пищевода в течение жизни у пациентов с ПБ составляет 10% (Spechler S . J ., 1997). Согласно данным Cameron A.J. (1997 г), частота клинического выявления ПБ составляет в среднем 22,6 на 100 тыс. населения, тогда как для аутопсийного материала этот показатель значительно выше - 376 на 100 тыс. Железистая метаплазия эпителия пищевода может быть представлена эпителием желудочного (фундального и кардиального) и кишечного типов. В настоящее время для обозначения всех видов метаплазий эпителия слизистой оболочки пищевода многими зарубежными авторами предлагается использовать понятие «пищевод, выстланный цилиндрическим эпителием» вместо термина «пищевод Барретта». В своем исследовании мы использовали термин «пищевод Барретта» в том же значении, что и сам Норманн Рупперт Барретт, подразумевая пищевод, выстланный цилиндрическим эпителием.
Несмотря на значительное количество публикаций за последние 20 лет, сохраняется неясность в отношении морфогенеза «пищевода Барретта» и «барреттовой аденокарциномы».
Хотя иммуногистохимический (ИГХ) метод исследования экспрессии ткане- и цитоспецифичных антигенов широко используется в морфологических исследованиях за рубежом, в работах, посвященных ПБ, как правило, использовалось ограниченное число (2-5) моноклональных антител. Не проводилось сравнения различных вариантов ПБ, аденокарциномы пищевода, нормального эпителия пищевода взрослых лиц и эмбрионов по экспрессии широкого ряда ИГХ маркеров. До сих пор не разработаны критерии ИГХ диагностики ПБ для применения в повседневной практике. Остаются актуальными исследования молекулярных характеристик метапластического эпителия ПБ, достоверно указывающих на риск развития аденокарциномы, а также поиск рационального протокола терапии в зависимости от типа метаплазии.
Цель и задачи работы.
Цель: изучить морфогенез метаплазий, дисплазий и аденокарцином в пищеводе Барретта.
Для достижения этой цели решались следующие задачи:
1) Изучить ИГХ фенотип нормального эпителия пищевода у взрослых лиц разного возраста и у плодов;
2) Провести анализ изменений в эпителии пищевода при различных формах метаплазий;
3) Исследовать диспластические процессы в пищеводе Барретта;
4) Изучить ИГХ - фенотип аденокарцином, возникающих из пищевода Барретта;
5) Создать оптимальный алгоритм ИГХ-диагностики для повседневного морфологического исследования пищевода Барретта в онкологической практике.
Научная новизна: Впервые дана иммуногистохимическая оценка всех форм патологии при пищеводе Барретта с применением широкого ряда моноклональных антител. Кроме того, впервые исследованы различия между фенотипом нормального эпителия пищевода у плодов и взрослых лиц и фенотипом эпителия в пищеводе Барретта.
Практическая значимость.
В результате проведенной работы были получены новые данные о морфогенезе эпителия пищевода Барретта и создан алгоритм ИГХ - диагностики предраковых и раковых состояний пищевода.
Результаты проведенных исследований могут быть использованы при патоморфологической диагностике пищевода Барретта и аденокарциномы пищевода, а также в процессе преподавания гастроэнтерологии, онкологии и патологической анатомии в ВУЗах.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Эпителий пищевода плода человека на сроках 12-16 недель гестации имеет сходный иммуногистохимический фенотип с пищеводом Барретта, что позволяет предположить «возврат к фетальному состоянию эпителия» при этой патологии.
2. Для дифференциальной диагностики кишечной и желудочной метаплазии в ПБ рекомендуется гистохимическое выявление кислых и сульфатированных муцинов, иммуногистохимическое выявление экспрессии цитокератинов (ЦКР) №№7, 20, виллина, лизоцима и ракового эмбрионального антигена (РЭА).
3.Желудочная метаплазия не является тупиковой формой патологии пищевода, а является ранней стадией в морфогенезе аденокарциномы пищевода.
4. Экспрессия цитокератинов высокого молекулярного веса в ПБ говорит в пользу гипотезы о развитии железистой метаплазии из базальных клеток плоского эпителия.
5. Аденокарцинома пищевода может иметь различные варианты иммуногистохимического фенотипа: желудочный, кишечный и смешанный. В ряде случаев аденокарциномы пищевода наблюдается экспрессия маркеров плоского эпителия (ЦКР высокого молекулярного веса). Аденокарцинома пищевода характеризуется достоверно более высоким уровнем пролиферации по сравнению с дисплазией в ПБ, более частым выявлением мутантного белка р53.
6. Для дифференциальной диагностики и прогнозирования течения патологического процесса при ПБ рекомендуется использование моноклональных антител к цитокератинам №7, №20, виллину, Ki -67, белку р53 как маркерам “первой линии” и к РЭА, циклину D1, CD 68, коллагену IV в расширенной «панели».
7. Для дифференциальной диагностики низкодифференцированной аденокарциномы пищевода, низкодифференцированного плоскоклеточного и недифференцированного раков пищевода рекомендуется иммуногистохимическое определение экспрессии ЦКР- PAN , эпителиального мембранного антигена (ЭМА), РЭА, ЦКР№7, ЦКР№20, виллина и виментина.
Апробация работы
Результаты исследования были представлены в докладах на 1-м конгрессе онкологов республики Узбекистан (Ташкент, 2005), Х Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине", посвященной 1000-летию г. Казани и 60-летию Победы в Великой Отечественной Войне (Казань – 2005), Всероссийской конференции Российского общества патологоанатомов (Орел, 2005),15-м конгрессе Европейского общества патологов (Париж, 2005), 100-м юбилейном конгрессе Международной академии патологии - IAP (Монреаль, Канада, 2006), докладывались на заседаниях Республиканского отделения Российского общества патологоанатомов (Казань, 2005 и 2006 гг.).
Результаты работы внедрены в практическую работу патологоанатомических отделений Клинического онкологического диспансера Министерства Здравоохранения Республики Татарстан, а также в учебный процесс кафедры патологической анатомии Казанского государственного медицинского университета.
Публикации. Материалы диссертации отражены в 10 опубликованных работах, в том числе 2 за рубежом.
Личный вклад автора. Автор диссертации на базе лаборатории иммуногистохимической диагностики опухолей Клинического онкологического диспансера МЗ РТ лично провел проспективное морфологическое исследование материала, полученного от 87 больных с эндоскопически выявленной патологией пищевода, в том числе 67 случаев с подозрением на пищевод Барретта (ПБ) и 20 наблюдений злокачественных новообразований нижней трети пищевода,. Автор проводил аутопсию и вырезку материала из нижней трети пищевода в контрольной группе, включавшей 4 наблюдения взрослых лиц и 6 плодов на базе патологоанатомического отделения РКБ №3 (г.Казань) и Межрегиональном клинико-диагностическом центре (г.Казань).
Диссертант для оценки пролиферативной активности самостоятельно выполнил морфометрический анализ иммуногистохимического маркера Ki -67, провел статистическую обработку полученных результатов. Автором диссертации обоснована актуальность темы, сформулированы цель, задачи и выводы исследования, проведено сравнение результатов собственных исследований с литературными данными.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 168 странице машинописи и состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, списка литературы и приложения. Текст иллюстрирован 9 таблицами, 62 микрофотографиями, 1 схемой. Список литературы содержит 217 наименований, из которых 21 отечественных и 196 иностранных.
Содержание работы.
Материал и методы исследования.
В соответствии с поставленными целью и задачами исследования за период с 2001 по 2007 гг было проведено гистологическое, гистохимическое и иммуногистохимическое изучение 87 случаев эндоскопически выявленной патологии пищевода, в том числе 67 случаев с подозрением на пищевод Барретта (ПБ) и 20 злокачественных новообразований нижней трети пищевода, а также контрольной группы, включавшей аутопсийный материал нормального пищевода взрослых лиц (4 случая) и плодов (6 случаев). Проспективно изучался материал, полученный у больных в процессе эндоскопического исследования или оперативного лечения в Клиническом онкологическом диспансере МЗ РТ (г.Казань) по поводу пищевода Барретта или новообразований пищевода. Парафиновые блоки аутопсийного материала пищевода взрослых лиц и плодов были предоставлены патологоанатомическим отделением РКБ№3, г. Казань.
Эндоскопическое исследование пораженного пищевода включало в себя определение границы между пищеводом и желудком (Z -линии). При подозрении на пищевод Барретта или злокачественное новообразование пищевода производилась биопсия только из подозрительных очагов в нижней трети пищевода, расположенных проксимальнее Z-линии и отделенных от желудка полосой нормального плоского эпителия шириной не менее 1,5 см. Для облегчения визуализации очагов кишечной метаплазии применялась хромоэндоскопия с использованием метиленовой сини.
Для точной характеристики изучаемой патологии был проведен анализ амбулаторных карт и историй болезни больных, находившихся на лечении в Клиническом онкологическом диспансере Республики Татарстан с 2001 по 2007 гг. При оценке каждого случая ПБ учитывалась локализация, размер поражений, динамика процесса и паспортные данные (возраст и пол). В случае злокачественных новообразований пищевода учитывалась стадия опухоли в соответствии с системой TNM и паспортные данные (возраст и пол). В качестве контроля использовался аутопсийный материал нормального пищевода взрослых лиц (4 случая), . Кроме того, изучался аутопсийный материал из нижней трети пищевода плодов 12-25 недель гестации, полученных в результате искусственного прерывания беременности по медико-социальным показаниям (2 случая) и мертворождения (4 случая) в отделении акушерства и гинекологии РКБ №3 г.Казани. Материалом для исследования служили парафиновые блоки биопсийного, аутопсийного и операционного материала.
Выражаю глубокую признательность д.м.н., профессору С.В. Петрову и коллективу ПАО Клинического онкологического диспансера Республики Татарстан за консультативную помощь и поддержку при выполнении этой работы.
Гистологическое исследование.
Для первоначальной морфологической характеристики патологических состояний пищевода и пищевода контрольной группы (взрослых лиц и плодов) проводилось рутинное гистологическое исследование. Использовались парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином.
В случае железистой метаплазии эпителия пищевода (пищевод Барретта) оценивались: клеточный состав (наличие бокаловидных клеток), строение слизистой (наличие валиков, ямок, крипт, ворсин, полипов), признаки дисплазии и воспаления.
Степень дисплазии в пищеводе Барретта оценивалась согласно критериям Американской Академии Гастроэнтерологии с выделением следующих стадий: дисплазия отсутствует, неопределенная степень дисплазии, легкая дисплазия, тяжелая дисплазия, рак in situ.
При первоначальном гистологическом исследовании злокачественных новообразований пищевода проводилась оценка степени анаплазии, количества и характера митозов, наличия инвазии, вторичных изменений в опухоли.
Гистохимические методы.
Для определения веществ мукополисахаридной природы использовались методы гистохимического окрашивания Шифф-йодной кислотой (ШИК) по Мак-Манусу, альциановым синим по Стидмену, толуидиновым синим, комбинированное окрашивание альциановым синим и ШИК (по Моури).
При исследовании кишечной метаплазии в ПБ оценивался клеточный состав и гистохимические свойства с использованием аналогичных критериев для кишечной метаплазии в желудке, предложенных отечественными и зарубежными авторами (Аруин Л.И., 1998, Voutilainen M., 1999, Sarbia M., 2004).
Иммуногистохимическое исследование.
Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм готовились на микротоме Leica (Германия), наносились на предметные стекла, обработанные поли-L-лизином и подсушивались на нагревательном столике при 37 °С в течение 10 часов.
После депарафинирования и обезвоживания срезов проводилась демаскировка антигенных детерминант кипячением в 0,1М цитратном буфере pH 6,0 в течение 20 минут. В ряде случаев после обработки в ксилоле и спиртах срезы промывали в 0,1М фосфатном буфере ( PBS - pH 7,4), обрабатывали 0,1% раствором трипсина на Tris -буфере (рН 7,6) в течение 30 мин при 37 °С во влажной камере. Использовали моно- и поликлональные первичные антитела к белкам промежуточных филаментов эпителиальных клеток (цитокератинам – ЦКР №7, №20, ЦКР высокого молекулярного веса, ЦКР- PAN), клеток мезенхимального происхождения (виментину), маркерам дисплазии (р53, циклину D 1, HER2/neu) и пролиферации (Ki -67), а также ряду других тканеспецифических белков (эпителиальному мембранному антигену, раковому эмбриональному антигену, виллину, лизоциму, CD 68, миелопероксидазе, коллагену IV). В иммуногистохимических реакциях использовалась система визуализации стрептавидин-биотин (LSAB), DAKO.
В качестве негативного контроля срезы инкубировали с нормальной сывороткой животного, от которого были получены первые антитела, а также с PBS. Кроме того, проводили инкубацию первых антител со срезами тех тканей, в которых исследуемый антиген отсутствовал. Позитивным контролем служила нормальная ткань слизистой оболочки пищевода и тонкого кишечника. Просматривали стекла в микроскопе Leica CTR 5000. Характер иммуногистохимических реакций оценивали визуально в баллах с учетом интенсивности окраски и процента окрашенных клеток. В каждом случае подсчитывали 200 клеток. Подсчет индекса пролиферации выполняли с помощью системы для морфометрии на базе IBM PC Pentium 4 и пакета программ “ Leica Qwin 3000“. Подсчет проводился в 10 полях зрения каждого среза, при этом учитывалось 500 клеток. При исследовании ПБ подсчет индекса пролиферации проводился отдельно в глубоких и поверхностных отделах метапластических желез.
Статистическая обработка полученных данных.
Была проведена статистическая обработка полученных данных при помощи программы «Microsoft Excel» пакета «Microsoft Office 2003» с определением доверительного интервала для средней (по Р. Фишеру) и величины p (достоверность различий между изучаемыми группами). Степень достоверности различий показателей пролиферации между исследованными группами наблюдений оценивали с помощью t -критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при 95% уровне значимости (р < 0,05).
Результаты собственных исследований.
1 Гистологическая, гистохимическая и иммуногистохимическая характеристика нормальной слизистой оболочки пищевода и кардиального отдела желудка плода.
У плодов на сроке 14-16 недель гестации эпителиальная выстилка пищевода и желудка имела сходное гистологическое строение и была представлена многорядным кубическим эпителием со светлыми вакуолями. В кардиальном отделе желудке на сроке 14 недель определялись формирующиеся ямки, отсутствующие в пищеводе. На сроке 18-20 недель гестации в пищеводе плодов одновременно обнаруживались участки и плоского, и многорядного кубического эпителия. Эпителий желудка на этом сроке гестации приближался по строению к цилиндрическому, увеличивалась глубина желудочных ямок. На сроке 20-25 недель гестации выстилка пищевода была представлена преимущественно зрелым многослойным плоским неороговевающим эпителием.
Гистохимически, при помощи ШИК-реакции, была выявлена позитивная реакция на гликоген в эпителии пищевода плодов всех исследованных сроков гестации. С увеличением срока гестации интенсивность ШИК-реакции увеличивалась от слабой (12-16 нед.) до яркой (18-20 нед. и более). Гистохимическое выявление кислых и сульфатированных муцинов в эпителии пищевода плода было негативным на всех сроках гестации. В эпителии желудка плода на всех сроках гестации обнаруживались ШИК- позитивные нейтральные муцины. На сроке гестации 12-16 недель в эпителии желудка отмечалась позитивная гистохимическая реакции на кислые мукополисахариды (окрашивание альциановым синим по Стидмену, рН 2,5), на более поздних сроках гестации кислые муцины в эпителии желудка не выявлялись.
При помощи иммуногистохимического метода на сроке 12-14 недель гестации в эпителии пищевода плода выявлялась яркая позитивная реакция на ЦКР№7 (более выраженная в поверхностных слоях эпителия) и ЦКР- PAN , негативная реакция на ЦКР№20 и виллин. Реакция на ЦКР высокого молекулярного веса (характерная для нормального эпителия пищевода взрослых лиц) на этом сроке была негативной. На сроке 14-16 недель гестации в формирующихся железах кардиального отдела желудка и в переходном эпителии пищевода иммуногистохимически выявлялась очаговая позитивная реакция на маркеры кишечной дифференцировки ЦКР№20 и РЭА. Отмечалась яркая позитивная реакция на ЦКР высокого молекулярного веса в переходном эпителии пищевода и очаговая позитивная реакция в железах кардиального отдела желудка. В кардиальном отделе желудка на сроке 14-16 недель гестации также отмечалась яркая позитивная реакция на ЦКР№7 и ЦКР- PAN. На 18-20 неделе гестации в эпителии пищевода плода выявлялась яркая позитивная реакция на ЦКР- PAN , яркая позитивная реакция на ЦКР высокого молекулярного веса и негативная реакция на ЦКР№7, ЦКР№ 20 и виллин. На сроках 20-25 недель гестации реакция на ЦКР высокого молекулярного веса в эпителии пищевода была ярко позитивной; на ЦКР№20 и виллин – негативной. В кардиальном отделе желудка на сроке 20-25 недель отмечалась яркая позитивная реакция на ЦКР№7 и ЦКР- PAN, негативная реакция на ЦКР20, виллин и ЦКР высокого молекулярного веса. Уровень пролиферации, определенный при помощи маркера Ki -67, был сравнительно низким на всех сроках гестации и составлял в среднем 4,5±1,6%.
2. Строение и иммуногистохимический фенотип слизистой оболочки пищевода взрослых лиц в норме и при хроническом эзофагите.
Эпителий пищевода взрослых лиц имел гистологическое строение многослойного плоского неороговевающего эпителия. Гистохимически в многослойном плоском эпителии пищевода при помощи ШИК - реакции выявлялись включения гликогена.
Иммуногистохимический фенотип эпителия нижней трети пищевода взрослых лиц соответствовал многорядным плоским неорогевающим эпителиям желудочно-кишечного тракта. Отмечалась яркая позитивная реакция на «ПАН» – эпителиальные маркёры (ЭМА, ЦКР- PAN) и на цитокератины высокой молекулярной массы (специфичные для плоских и сложных эпителиев). Реакция на маркеры железистой дифференцировки - ЦКР №7, ЦКР №20, виллин была негативной.
Среди 67 случаев, исследованных в связи с подозрением на ПБ, в 3 наблюдениях был выявлен хронический продуктивный эзофагит. Возраст пациентов составил в среднем 54,5 года, все 3 пациента были мужского пола.
Хронический эзофагит сопровождался выраженной лимфоцитарной, плазмоцитарной и гистиоцитарной инфильтрацией слизистого и подслизистого слоев, гиперемией сосудов слизистой оболочки и склерозом стромы. В эпителиальной выстилке отмечалась баллонная дистрофия плоского эпителия, акантоз. Гистохимически в многослойном плоском эпителии выявлялся ШИК-позитивные гранулы с гликогеном, реакции на кислые и сульфатированные муцины были негативными.
Иммуногистохимически многослойный плоский эпителий характеризовался яркой позитивной реакцией (сильнее в базальном слое) с антителами к ЦКР высокой молекулярной массы и ЭМА (равномерно во всех слоях). ИГХ реакция с маркерами железистой дифференцировки (ЦКР№7, №20, виллину) в многослойном плоском эпителии была негативной. В гистиоцитах воспалительного инфильтрата отмечалась яркая позитивная реакция на CD 68, а в нейтрофильных лейкоцитах - на миелопероксидазу.
3. Строение и фенотип метапластического эпителия в пищеводе Барретта.
Среди 64 случаев гистологически выявленной железистой метаплазии эпителия пищевода в зависимости от строения и гистохимических характеристик мы выделили 2 основных варианта: желудочная и кишечная (т.н. «полная» и «неполная»). Кроме того, в отдельную группу были выделены случаи кишечной метаплазии на фоне желудочной метаплазии. Железистая метаплазия эпителия пищевода выявлялась преимущественно у лиц мужского пола (47 больных, 73% наблюдений).
Желудочная метаплазия была выявлена у 28 больных, возраст которых составлял от 38 до 74 лет (в среднем 52,8 лет); 20 (71,4%) пациентов были мужского и 8 (28,56%) женского пола.
Гистологически метаплазия желудочного типа была представлена железами, построенными из призматических клеток со светлой цитоплазмой, замещавшими нормальный плоский эпителий, бокаловидные клетки отсутствовали. В 15 случаях из 28 (53,6%) желудочной метаплазии обнаруживалась умеренная лимфоцитарная и гистиоцитарная инфильтрация слизистой оболочки в зоне метаплазии, что сопровождалось кистозным расширением части метапластических желез. В 4 случаях метаплазия желудочного типа была обнаружена в железистых полипах пищевода. При метаплазии эпителия пищевода желудочного типа признаки дисплазии гистологически выявлены не были.
В ПБ при метаплазии желудочного типа гистохимически определялись нейтральные муцины (яркая или умеренная ШИК реакция), гистохимические реакции на кислые и сульфатированные муцины были негативными.
Желудочная метаплазия иммуногистохимически характеризовалась яркой позитивной реакцией с антителами к ЦКР №7, слабой или негативной реакцией с антителами к виллину, слабой апикальной реакцией на РЭА и негативной реакцией на ЦКР №20. В 7 из 28 случаев (25%) желудочной метаплазии была обнаружена позитивная реакция с антителами к цитокератинам высокой молекулярной массы.
Клеточный состав воспалительного инфильтрата, обнаруженного в очагах желудочной метаплазии, включал CD 68 – позитивные гистиоциты и лейкоциты, окрашенные на миелопероксидазу.
При анализе иммуногистохимической реакции с маркером Ki -67 в случаях желудочной метаплазии в поверхностных отделах желез пролиферация была низкой (4,15±1,21%), в глубоких отделах – высокой (55,6±6,2%).
Кишечная метаплазия эпителия пищевода была выявлена у 23 пациентов в возрасте от 31 до 61 года (в среднем 52,6 года). 17 лиц были мужского и 6 - женского пола.
Метаплазия эпителия пищевода кишечного типа гистологически характеризовалась наличием в железах бокаловидных клеток и цилиндрических клеток. В 9 случаях из 23 (39,1%) в слизистой оболочке обнаруживались плазмоцитарные и гистиоцитарные инфильтраты. С помощью гистохимического и иммуногистохимического методов была выделена «полная» (7 случаев) и «неполная» (16 случаев) кишечная метаплазия.
При «полной» кишечной метаплазии отмечалось окрашивание секрета бокаловидных клеток на нейтральные (ШИК-реакция по Мак-Манусу) и кислые (альциановым синим по Стидмену, рН 2,5) муцины, негативная гистохимическая реакция на сульфомуцины (окраска толуидиновым синим, рН 1,0). Цилиндрические клетки, лежащие между бокаловидными клетками не окрашивались гистохимическими методами на муцины. Имелись структуры, напоминающие кишечные ворсинки.
При «неполной» кишечной метаплазии секрет бокаловидных клеток включал не только нейтральные и кислые, но и сульфатированные муцины. При этом виде метаплазии в цилиндрических клетках, лежащих между бокаловидными клетками гистохимически выявлись кислые муцины (окрашивание альциановым синим по Стидмену, рН 2,5).
Иммуногистохимически «неполная» кишечная метаплазия характеризовалась яркой умеренной очаговой реакцией на ЦКР7, очаговой неравномерной реакцией на ЦКР №20, яркой позитивной реакцией на виллин (апикально) и РЭА (цитоплазматически и апикально). Фенотип «полной» кишечной метаплазии по данным иммуногистохимического анализа включал в себя экспрессию ЦКР№7 в поверхностном и глубоком слоях железистого эпителия, яркую положительную реакцию на ЦКР №20 в поверхностных отделах желез и позитивную апикальную реакцию на виллин, апикальную реакцию на РЭА.
В 6 случаях из 23 (26,1%) кишечной метаплазии была обнаружена позитивная реакция (от умеренной до яркой) с антителами к цитокератинам высокой молекулярной массы. Клеточный состав воспалительного инфильтрата, обнаруженного в очагах кишечной метаплазии включал преимущественно CD68 – позитивные гистиоциты.
При кишечной метаплазии по результатам иммуногистохимического анализа маркера Ki -67 уровень пролиферации в поверхностных отделах желез был достоверно выше (р<0,05), чем при метаплазии желудочного типа и составлял в среднем 8,45±1,1%. Средний уровень пролиферации в глубоких отделах желез был высоким (62±5,8%), разница с метаплазией желудочного типа статистически недостоверна (р>0,05).
Желудочная метаплазия с очагами кишечной метаплазии была выявлена в 13 случаях, у 10 мужчин и 3 женщин в возрасте от 48 до 74 лет (средний возраст 59,6 лет). Гистологически эта патология пищевода характеризовалась наличием единичных желез, содержащих бокаловидные клетки среди преобладающих по количеству желез желудочного типа (без бокаловидных клеток). В 2 случаях из 13 (15,4%) имелась лимфо- плазмоцитарная инфильтрация слизистой оболочки. В 2 других случаях (15,4%) были обнаружены признаки легкой дисплазии в очагах кишечной метаплазии.
Гистохимически в метапластических железах желудочного типа выявлялись нейтральные муцины при отсутствии в них кислых и сульфатированных муцинов.
Участки кишечного строения по гистохимическим свойствам были отнесены к «неполной» кишечной метаплазии: отмечалось накопление кислых, нейтральных и сульфатированных муцинов в бокаловидных клетках, а также положительная реакция на кислые муцины в цилиндрических клетках.
Иммуногистохимический фенотип очагов кишечного строения (на фоне желудочной метаплазии) соответствовал полной или неполной кишечной метаплазии и отличался от окружающих желез желудочного типа. Железы желудочного типа характеризовались яркой реакцией на ЦКР№7, слабой апикальной реакцией на виллин в части желез и негативной реакцией на ЦКР №20 и РЭА. В очагах кишечного типа отмечалась умеренная очаговая реакция на ЦКР№20 (неполная кишечная метаплазия), яркая апикальная реакция на виллин и яркая цитоплазматическая реакция на РЭА. В 4 случаях (из 13) кишечной метаплазии на фоне желудочной метаплазии была обнаружена слабая позитивная реакция на цитокератины высокой молекулярной массы.
Воспалительные инфильтраты были представлены преимущественно CD68 – позитивными гистиоцитами.
Уровень пролиферации по количеству Ki -67 позитивных ядер в метапластических железах кишечного типа составил в среднем 5,8±0,3% в поверхностных отделах желез и 55,6±6.2% в глубоких отделах желез; различия пролиферативной активности с «чисто» кишечной и «чисто» желудочной метаплазиями статистически недостоверны (р1,2>0,05).
На основании данных литературы и результатов собственного исследования мы можем предложить следующую схему оценки метапластических эпителиев в ПБ (табл.1).
Таблица 1. Гистохимические и иммуногистохимические характеристики эпителиев в ПБ.
| Маркер | Желудочная метаплазия | Кишечная метаплазия | |
| Полная | Неполная | ||
| ЦКР№7 | ++ (во всех отделах желез) | - + | ++ (во всех отделах желез) |
| ЦКР№20 | - | + (очагово) | + (в поверхностных слоях) |
| Виллин | -/± (очагово, слабая апикальная реакция) | + (ярко, апикально) | + (яркая апикальная и умеренная цитоплазматическая реакция) |
| РЭА | + (апикально, умеренно) | + (умеренно, апикально) | ++ (яркая апикальная и цитоплазматическая реакция) |
| Лизоцим | + | - | - |
| Нейтральные муцины | + | + | + |
| Кислые муцины | - | + (в бокаловидных и каемчатых клетках) | + (только в бокаловидных клетках) |
| Сульфатированные муцины | - | - | + (в бокаловидных клетках) |
4. Строение и фенотип дисплазий в пищеводе Барретта.
В результате исследования 64 больных с диагнозом ПБ, признаки дисплазии были выявлены в девяти случаях.
При желудочной метаплазии гистологические признаки дисплазии отсутствовали.
Из исследованных нами 23 случаев кишечной метаплазии в ПБ, в семи были обнаружены признаки легкой дисплазии. В 3-х случаях кишечной метаплазии из 23 (13,0%) гистологическая картина соответствовала лёгкой дисплазии: в клетках поверхностных желез обнаруживались гиперхромные ядра с нарушенной ориентацией при отсутствии признаков воспаления. В 4-х случаях кишечной метаплазии также обнаруживались изменения, характерные для лёгкой дисплазии, однако они проявлялись на фоне выраженной плазмоцитарной и гистиоцитарной инфильтрации. В этих случаях ставился диагноз «неопределённая степень дисплазии».
Признаки легкой дисплазии (при отсутствии признаков воспаления) были выявлены в 2-х из 13-ти (15,3%) случаях кишечной метаплазии на фоне желудочной метаплазии эпителия пищевода.
Гистохимически в участках дисплазии на фоне ПБ выявлялась слабая неравномерная секреция или отсутствие секреции кислых и сульфатированных муцинов, умеренная секреция нейтральных муцинов.
Иммуногистохимически в участках дисплазии выявлялся фенотип, характерный для кишечной метаплазии в ПБ. При иммуногистохимическом анализе с использованием антител к маркёру р53 позитивная реакция была выявлена в 2-х случаях кишечной метаплазии (8,7% всех случаев и 66,7% дисплазий при кишечной метаплазии), а также 1 случае кишечной метаплазии на фоне желудочной метаплазии (7,7% всех случаев и 50% дисплазий при данном виде метаплазии). Экспрессии циклина D1 и HER2/ neu в случаях подозрения на дисплазию не обнаружено.
В случае дисплазии в поверхностных отделах желез уровень пролиферации был достоверно выше (19,5±3,2%, р<0,05), чем в метаплазии кишечного и желудочного типов без признаков дисплазии. Уровень пролиферации в глубоких отделах желез составил 66,3±4,8%, разница между уровнем пролиферации в глубоких отделах желез при дисплазии на фоне кишечной метаплазии, кишечной и желудочной метаплазии без дисплазии статистически недостоверна (р>0,05).
Для визуализации базальной мембраны использовалось ИГХ окрашивание на коллаген IV . При легкой дисплазии в ПБ нарушения целостности базальной мембраны метапластических желез не наблюдалось.
5. Строение и фенотип злокачественных новообразований пищевода.
Среди исследованных 20 случаев рака пищевода гистологически были выявлены аденокарцинома, низкодифференцированный рак и низкодифференцированный плоскоклеточный рак.
Аденокарцинома пищевода.
Аденокарцинома пищевода была обнаружена в 11 случаях. Возраст пациентов составлял от 52 до 81 года (в среднем 69,5 лет), 7 пациентов были мужского и 4 - женского пола. Согласно классификации TNM выделены следующие стадии аденокарциномы пищевода: 4 случая (36,4%) Т3N0M0, 3 (27,2%) T3N1M0, 4 (36,4%) T4N1M0.
Среди 11 выявленных случаев аденокарциномы пищевода гистологически определялись паппилярный, тубулярный и диффузный типы строения. Инвазия опухоли в прилежащие ткани выявлена в всех исследованных случаях. Гистохимически в атипических железах аденокарцином в 8 наблюдениях выявлены нейтральные муцины (интенсивность ШИК реакции была от слабой до выраженной) и в 6 случаях - кислые муцины. Гистохимическое определение сульфатированных муцинов было безрезультатным.
По результатам проведенного иммуногистохимического анализа 11 случаев аденокарцином было выявлено 3 варианта фенотипа: 3 случая (27,3%) «желудочного типа» (экспрессия ЦКР №7 и виллина, нейтральных муцинов), 3 случая (27,3%) «смешанного кишечно-желудочного типа» (позитивная реакция на ЦКР №7 и №20, виллин, нейтральные и кислые муцины) и 5 случаев (45,4%) «кишечного типа» (экспрессия ЦКР №20 и виллина, а также нейтральных и кислых муцинов).
В 7 из 11 (63,4%) случаев аденокарцином при помощи ИГХ анализа нами была выявлена позитивная реакция в опухолевых клетках на цитокератины высокой молекулярной массы (№№ 5,14), экспрессируемые в норме плоскими и протоковыми эпителиями.
В 5 случаях из 11 (45,4%) аденокарцином пищевода выявлена позитивная реакция на онкобелок р53. Уровень пролиферации при аденокарциномах пищевода был высоким и составлял 44±3,3%, разница между уровнем пролиферации в аденокарциномах и всех вариантах ПБ статистически достоверна (p<0,05). Инвазия опухоли была подтверждена при помощи иммуногистохимического окрашивания базальной мембраны (реакция на коллаген IV).
Недифференцированный рак пищевода.
Недифференцированный рак был выявлен у 5 пациентов (2 случая T3N1M0, 2 - случая T4N1M0, 1 случай T3N1M1), возраст составлял от 53 до 67 лет, (в среднем 57,6 лет), 4 пациента были мужского и 1 женского пола..
Недифференцированный рак гистохимически характеризовался отсутствием реакций с нейтральными, кислыми и сульфатированными муцинами.
Иммуногистохимически выявлялась экспрессия ЦКР- PAN , ЭМА и РЭА. Отсутствовала ИГХ реакция на ЦКР№7, ЦКР№20, виллин.
Уровень пролиферации при низкодифференцированном раке был высоким и составил 56±4,1%.
Низкодифференцированный плоскоклеточный рак пищевода.
Низкодифференцированный плоскоклеточный рак был выявлен в 4 случаях (1 случай T3N1M0, 2 - случая T4N1M0 и 1 случай T3N1M1), возраст пациентов составлял от 57 до 70 лет (в среднем 64 года), все пациенты были мужского пола.
При гистохимическом исследовании в низкодифференцированном плоскоклеточном раке вещества мукополисахаридной природы не выявлялись.
Иммуногистохимически выявлялась экспрессия ЦКР- PAN , слабая или умеренная реакция на ЭМА и РЭА, а также умеренная или яркая реакция на цитокератины высокого молекулярного веса. ИГХ реакция с антителами к маркерам железистой дифференцировки (ЦКР№7, ЦКР№20, виллину) была негативной. Уровень пролиферации, определенный при помощи антител к Ki -67, был высоким и составил 48±2,3%.
6. Использование полученных данных в клинике.
После анализа гистологического строения, гистохимических свойств и иммуногистохимического фенотипа исследованного материала 87 пациентам были поставлены следующие диагнозы: в 28 (32,2%) случаях–пищевод Барретта с желудочной метаплазией, в 23 (26,4%)–пищевод Барретта с кишечной метаплазией (16-«неполная» и 7 –«полная» кишечная метаплазия, в 4- случаях – легкая дисплазия), в 13 (14,9%) –очаги кишечной метаплазии на фоне желудочной (в 2 случаях – с признаками легкой дисплазии) и в 3 (3,4%) случаях– хронический продуктивный эзофагит. Среди раков пищевода в 11 (12,6%) случаях диагностирована аденокарцинома пищевода на фоне пищевода Барретта, в 5 (5,7%)-недифференцированный рак, 4 (4,6%)-низкодифференцированный плоскококлеточный рак. Обобщенные результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2. Структура наблюдений
| Диагноз | Количество | % (в круглых скобках % в группе) |
| 1. Желудочная метаплазия | 28 | 32,2 |
| 2. Кишечная метаплазия | 23 | 26,5 |
| Полная | 7 | (30,4) |
| Неполная | 16 | (69,6) |
| Легкая дисплазия | 3 | (13,0) |
| 3. Желудочная метаплазия с очагами кишечной метаплазии | 13 | 14,9 |
| Легкая дисплазия | 2 | (15,4) |
| 4. Хронический эзофагит | 3 | 3,4 |
| 5. Аденокарцинома | 11 | 12,7 |
| 6. Недифференцированный рак | 5 | 5,7 |
| 7. Низкодифференцированный плоскоклеточный рак | 4 | 4,6 |
В клинике с использованием полученных нами данных определялись группы больных, требующих различных вариантов врачебной тактики: радикального хирургического вмешательства, локального эндоскопического лечения, консервативной терапии или наблюдения.
Радикальное хирургическое лечение (резекция пищевода) применялось при аденокациноме, плоскоклеточном, и низкодифференцированном раке. Кроме того, 4 больным с диагнозом «пищевод Барретта» была проведена операция гастрофундопликации для устранения гастроэзофагеального рефлюкса. При легкой дисплазии на фоне кишечной метаплазии в пищеводе Барретта проводилось местное удаление пораженных участков слизистой при помощи аргонового лазера под эндоскопическим контролем (д.м.н. Бурмистров М.В., Республиканский клинический онкологический диспансер, Казань). Как при желудочной, так и при кишечной метаплазии в пищеводе Барретта без признаков дисплазии, больным назначался курс консервативной противорефлюксной терапии с последующим эндоскопическим контролем. При отсутствии положительной динамики после 2 курсов консервативной терапии больным с кишечной метаплазией эпителия пищевода предлагалось эндоскопическое удаление пораженных участков слизистой.
7. Морфогенез метаплазий, дисплазий и аденокарцином в ПБ.
Молекулярные события, сопровождающие изменение направления дифференцировки камбиальных клеток с плоского эпителия на железистый на данный момент не известны. Изменение генетической программы клеток эпителиальной выстилки пищевода может приводить к появлению железистого эпителия желудочного или кишечного типа. Обнаруженные нами случаи очагов кишечной метаплазии на фоне желудочной метаплазии, а также ряд зарубежных публикаций свидетельствуют о том, что метаплазия желудочного типа не всегда является «тупиковым» изменением слизистой оболочки пищевода, а предшествует кишечной метаплазии в ПБ.
По данным литературы клетки в кишечной метаплазии эпителия пищевода характеризуются нестабильностью генома. При продолжающемся воздействии повреждающих факторов на метапластический эпителий в ПБ, развивается легкая, а затем тяжелая дисплазия. Появление дисплазии может сопровождаться мутациями или изменением экспрессии генов: р53, циклина D1, FHIT . Переход тяжелой дисплазии в инвазивную аденокарциному может сопровождаться нарушениями функции генов c - myc , c - erb - B 2, e -кадгерина.
Исходя из полученных данных и данных литературы, мы можем предложить модифицированную схему прогрессирования патологического процесса в пищеводе Барретта (по Chandrasoma P. T., 2000 и Spechler S . J ., 1996 с изменениями).
Схема прогрессирования патологического процесса при ПБ.
ВЫВОДЫ.
1. Пищевод плода 12-14 недель гестации имеет сходство с пищеводом Барретта по экспрессии ряда белков (ЦКР№7, РЭА).
2. Нормальный эпителий пищевода взрослых лиц характеризуется экспрессией цитокератинов высокого молекулярного веса и негативной реакцией на маркеры железистой дифференцировки (ЦКР7, 20, виллин).
3. Кишечная и желудочная метаплазия в ПБ обладают различным иммуногистохимическим фенотипом и гистохимическими свойствами, что может использоваться при их дифференциальной диагностике. Кишечная метаплазия характеризуется высокой митотической активностью и нередко имеет черты дисплазии. Экспрессия цитокератинов №№5,14 в ПБ говорит в пользу гипотезы о развитии железистой метаплазии из базальных клеток плоского эпителия.
Желудочная метаплазия характеризуется статистически достоверно более низкой митотической активностью по сравнению с кишечной, признаки дисплазии при желудочной метаплазии в нашем исследовании отсутствовали. Наличие очагов кишечной метаплазии на фоне желудочной может указывать на возможность постепенной трансформации желудочной метаплазии в кишечную.
4. Для верификации дисплазии в ПБ может использоваться маркер р53.
5. Аденокарцинома пищевода может иметь различные варианты иммуногистохимического фенотипа: желудочный, кишечный и смешанный. В ряде случаев в аденокарциноме пищевода обнаруживается экспрессия маркеров плоского эпителия (ЦКР высокого молекулярного веса). Сходство между различными типами дифференцировки аденокарцином и метаплазий, экспрессия цитокератинов высокой молекулярной массы в обоих случаях, говорит в пользу теории происхождения аденокарцином из метапластического эпителия ПБ.
Аденокарцинома пищевода характеризуется достоверно более высоким уровнем пролиферации по сравнению с дисплазией в ПБ, более частым выявлением мутантного белка р53. Для облегчения визуализации инвазии аденокарциномы в окружающие ткани можно использовать иммуногистохимический метод с антителами к коллагену IV.
6. Для дифференциальной диагностики диффузного варианта низкодифференцированной аденокарциномы, низкодифференцированного плоскоклеточного рака и недифференцированного рака может быть использован иммуногистохимический метод с антителами к ЦКР№7, ЦКР№ 20, виллину, РЭА, виментину, ЦКР высокого молекулярного веса, ЦКР «PAN».
7. Для дифференциальной диагностики и прогнозирования течения патологического процесса при ПБ рекомендуется использование ряда моноклональных антител к цитокератинам №№7, 20, виллину, Ki-67, белку р53 как маркерам “первой линии” и РЭА, циклину D1, CD68, коллагену IV в расширенной «панели».
Список опубликованных работ по теме диссертации.
1. Timur Akhmetov, Semyon Petrov, Eugeniy Burmistrov. Essential Markers For the Evaluation of Metaplasia, Dysplasia and Cancer in Barrett's oesophagus //Virchow's Archive, 2005, vol. 447 №2, P.282.
2. Т. Р. Ахметов, С. В. Петров, Д. Э. Цыплаков. Иммуноморфологическая характеристика предраковых состояний и опухолей пищевода // Актуальные вопросы патологической анатомии. Сборник научных работ. Орел-2005, С.234-235.
3. Т. Р. Ахметов, С. В. Петров, М. В. Бурмистров. Иммуногистохимический анализ молекулярных маркеров в диагностике опухолей пищевода // Актуальные проблемы онкологии: Материалы 1-го конгресса онкологов республики Узбекистан. Ташкент - 2005, С. 75.
4. Т. Р. Ахметов, С. В. Петров, М. В. Бурмистров. Определение молекулярных маркеров помогает диагностике пограничных состояний и опухолей пищевода // Современные технологии в онкологии: Материалы VI Всероссийского съезда онкологов. Ростов-на-Дону, 2005, т.2, С.395.
5. Т. Р. Ахметов. Молекулярные маркеры для оценки метаплазии, дисплазии и рака в пищеводе Барретта // Тезисы докладов Х Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине", посвященной 1000-летию г. Казани и 60-летию Победы в Великой Отечественной Войне. Казань - 2005, С.122.
6. Т. Р. Ахметов, С. В. Петров, Д. Э. Цыплаков. Предраковые состояния и опухоли пищевода: иммуноморфология некоторых моолекулярных маркеров. //Материалы IV Конференции российских патологоанатомов "Новые методы и разработки в онкоморфологии", посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР Н.А. Краевского. Москва, 2005, С.122.
7. Т. Р. Ахметов, С. В. Петров, Д.Э. Цыплаков, М.В. Бурмистров. Молекулярные маркеры в иммуноморфологической характеристике предраковых состояний и опухолей пищевода// Современные проблемы клинической патоморфологии. Тезисы Всероссийской конференции с международным участием, посвященной памяти чл.-корр РАМН, з.д.н. РФ, профессора Олега Константиновича Хмельницкого. С-Пб, 2005, С. 17-19.
8. T.R. Akhmetov, S.V. Petrov. Immunohistochemical evaluation of metaplasias, dyplasias and cancer in Barrett’s esophagus// Modern Pathology, 2006 vol.10, supplement 3, P.72.
9. Т.Р. Ахметов. Иммуногистохимическая характеристика метаплазий, дисплазий и аденокарцином в пищеводе Барретта. //Омский научный вестник. 2006, №9 (46), С.281-284.
10. Ахметов Т.Р. "Оценка метаплазий, дисплазий и аденокарцином в пищеводе Барретта при помощи иммуногистохимического анализа"// Врач-аспирант научно-практический журнал, Воронеж, 2007 №1 (16) С.9-15