Міністерство охорони здоров’я України Дніпропетровська державна медична академія
| Вид материала | Реферат |
- Міністерство охорони здоров’я україни дніпропетровська державна медична академія, 180.17kb.
- Міністерство охорони здоров’я україни дніпропетровська державна медична академія моз, 186.75kb.
- Міністерство охорони здоров’я україни тернопільська державна медична академія ім., 461.01kb.
- Міністерство охорони здоров’я україни центральний методичний кабінет вищої медичної, 579.69kb.
- Дніпропетровська обласна державна адміністрація Головне управління охорони здоров’я, 2215.64kb.
- Скрипников Петро Миколайович, Вищий Державний навчальний заклад України «Українська, 1373.08kb.
- Міністерство охорони здоро‘я України Тернопільська державна медична академія, 323.04kb.
- Міністерство охорони здоров'я україни професійна спілка працівників охорони здоров'я, 111.65kb.
- Кабінет Міністрів України Міністерство охорони навколишнього природного середовища, 94.74kb.
- Міністерство охорони здоров’я україни буковинський державний медичний університет, 379.69kb.
Міністерство охорони здоров’я України
Дніпропетровська державна медична академія
РЕФЕРАТ РОБОТИ, представленої на здобуття Премії Президента України для молодих вчених за 2009 рік
КРАВЧЕНКО К.О.
Експериментальна фармакологія похідних бензотіазолу як потенційних нейропротекторів
Дніпропетровськ
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Розповсюдження захворювань, пов’язаних з патологією головного мозку, робить проблему вельми значимою для клінічної практики та теоретичної медицини (О.Ф. Возіанов, 1996; И.С. Зозуля и соавт., 2005). Згідно міжнародним епідеміологічним дослідженням, щорічно від інсульту із 6 млн людей, які перенесли це захворювання, вмирає 4,7 млн. В Україні захворюваність інсультом складає 2,5-3 випадки на 1000 людей у рік, смертність – відповідно один випадок (І.В. Сидорова та співавт., 2004). Половина хворих, яким зберегли життя, втрачає працездатність та страждає від погіршення якості життя, нерідко стають інвалідами (С.М. Виничук и соавт., 2003). Тому пошук ефективних засобів запобігання та лікування захворювань мозку – церебропротекторів набуває особливого значення. Спектр їх терапевтичного використання не обмежується гострою ішемією головного мозку, а включає цілий ряд інших нозологічних форм, виникнення та розвиток яких пов'язані з метаболічним порушенням функції ЦНС та дисбалансом регуляторних нейротрансміттерів (І.В. Комісаров, 2003; Е.А. Гусев, 2001).
Наявність великої кількості нейромедіаторних амінокислот в різних відділах нервової системи, їх унікальна фізіологічна роль в роботі мозку, в механізмах нервово-психічної діяльності та пластичності можуть указувати на перспективність використання сполук, які впливають на глутаматергічну нейромедіаторну систему в якості лікарських засобів різного типу дії (протисудомних, протиішемичних, нейропротективних засобів, анальгетиків і т.і.) (А.Ю. Беспалов, Э.Э. Звартау, 2000). Концепція “глутамат-кальцієвої ексайтотоксичності” стала визначальною у скринінгу потенційних нейропротекторів. Ця концепція свідчить, що некроз або апоптоз нервових клітин при фокальній чи загальній ішемії мозку обумовлений надмірною активністю глутаматергічних нейронів і надмірним зростанням внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію в нейронах мозку, які збуджуються глутаматом (J. Castillo, A. Davalos, 1997; В.И. Скворцова, 2001).
Встановлено, що інгібітори вивільнення глутамату ефективно протидіють нейродегенеративним і ексайтотоксичним, ішемічним і гіпоксичним ушкодженням мозку (L. Beltran-Parrazal, 2003; P. Jimonet, 1998; T. Tzschentke, 1998; Doble, 1996; P. Couratier, 1994). Проте, препаратів цього ряду небагато, а для деяких із них суттєвими є побічні ефекти, які супроводжуються порушенням координації рухів та психомоторних реакцій. Тобто, ці препарати, на жаль, здатні відчутно впливати на важливі метаболічні та фізіологічні процеси центральної нервової системи (G. Devuyst, J. Bogousslavsky, 2001; A.A. Parsons, E.A. Irving, 2000; R.N. Auer, 1994).
У клінічній практиці для лікування бокового аміотрофічного склерозу використовується рилузол, а експериментальні дані свідчать про його властивості блокувати вивільнення глутамату (R.G. Miller, J.D. Mitchell, 2004; P.J. Shaw, P.G. Ince, 1997; P. Jimonet, F. Audiau, 1999). Тому з‘ясування ефективності рилузола та похідних його активної молекули або похідних бензотіазолу при патологіях головного мозку є актуальним та перспективним завданням.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності до плану науково-дослідної роботи кафедри фармакології та клінічної фармакології Дніпропетровської державної медичної академії "Особливості дії нейро- та психотропних лікарських засобів в умовах екстремальних ситуацій" (№ держреєстрації 0199U001559).
Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідження нейропротекторних властивостей в ряду похідних бензотіазолу на різних моделях експериментальної патології головного мозку, виявлення закономірності "структура-дія", визначення антиглутаматної активності, розкриття нейромедіаторного профілю.
У відповідності до мети було визначено основні задачі дослідження:
1. Визначити клас токсичності, провести фармакологічний скринінг і порівняльну оцінку потенційних церебропротекторів в ряду похідних бензотіазолу на моделі гострої ішемії головного мозку.
2. Дослідити вплив найбільш активних похідних бензотіазолу – амдифлузола і препаратів рилузола (рілутека, боризола) на поведінку, м‘язовий тонус та інтегративні функції мозку тварин з церебральною ішемією.
3. Визначити вплив амдифлузола і препаратів рилузола на енергетичний обмін і на інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів у тканинах головного мозку в тварин з гострим порушенням мозкового кровообігу.
4. Вивчити церебропротекторну дію амдифлузола і препаратів рилузола за морфометричними даними.
5. Дослідити характер впливу амдифлузола і препаратів рилузола на викликану біоелектричну активність мозку та периферичних нервів.
6. Визначити нейропротекторну активність амдифлузола і препаратів рилузола в умовах підвищеної судомної готовності мозку.
7. Оцінити захисну дію амдифлузола і препаратів рилузола при експериментальному паркінсонічному синдромі.
8. Дослідити мітопротекторні властивості амдифлузола і препаратів рилузола ex vivo та визначити нейропротективний ефект на виділених збагачених фракціях нейронів в умовах моделювання глутаматної ,,ексайтотоксичності” in vitro.
Об’єкт дослідження – поведінка та інтегративні функції мозку щурів з експериментальною патологією головного мозку, стан про- та антиоксидантної системи, процесів біоенергетики в тканинах головного мозку ex vivo; гістологічні зрізи неокортексу; викликана біоелектрична активність спинного мозку та периферичних нервів.
Предмет дослідження – нейротропні ефекти похідних бензотіазолу.
Методи дослідження – фармакологічні, токсикологічні, фізіологічні, біохімічні, морфологічні, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. На підставі оцінки результатів комплексного дослідження нейротропних ефектів похідних бензотіазолу за умов експериментальної ішемії головного мозку вперше показано, що амдифлузол (робоча назва найактивнішої молекули) має церебропротекторні властивості, які реалізуються зниженням летальності щурів, послабленням нейродегенеративних процесів, зменшенням зони некрозу у головному мозку, зниженням розвитку неврологічного дефіциту у тварин, послабленням ознак порушення функціонального стану ЦНС, гальмуванням надмірної активації процесів вільно-радикального окислення та відновленням показників енергетичного обміну. Нейрофізіологічними дослідами встановлено, що амдифлузол і препарати рилузола ефективно блокують проведення збудження до інтернейронів спинного мозку, ефективно зменшують рефлекторне збудження мотонейронів у моносинаптичній рефлекторній дузі. Дослідження нових похідних бензотіазолу у порівнянні з відомим блокатором глутаматергічної передачі рілутеком (МНН – рилузол, Aventis Pharma, Франція) дозволило припустити, що в основі церебропротекторних властивостей амдифлузола лежить властивість ефективно гальмувати глутамат-кальцієву ексайтотоксичність у патогенезі ішемії головного мозку. Амдифлузол має протисудомні властивості: збільшує тривалість життя в умовах коразолового тесту, зменшує кількість щурів з тонічними судомами та тривалість судом в умовах максимального електрошоку; має анальгетичну активність при використанні альгометричних тестів, які основані на сомато-сенсорних реакціях тварин з використанням термічного, електричного та хімічного подразників. Дослідження мітопротекторних властивостей амдифлузола ex vivo показали, що він блокує відкриття мітохондріальних пор нейронів, спричинене дією нейротоксину МРТР (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine). Визначено нейропротективний ефект амдифлузола на виділених збагачених фракціях нейронів в умовах моделювання глутаматної ,,ексайтотоксичності” in vitro. Додавання до інкубаційної суміші амдифлузола (10 мкМ) запобігало клітинній загибелі, зменшуючи розвиток як апоптозу, так і некрозу.
Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень експериментально обгрунтовують доцільність використання найбільш активної молекули в ряду похідних бензотіазолу під робочою назвою амдифлузол для профілактики і лікування ішемічних ушкоджень головного мозку, підвищеної судомної готовності мозку, паркінсонічного синдрому. Практичне значення результатів дослідження підтверджено патентом на винахід №80748 України (2007 р.).
Результати роботи впроваджено у навчальний та науковий процес кафедр фармакології Дніпропетровської державної медичної академії, Запорізького державного медичного університету, Луганського державного медичного університету, Львівського національного медичного університету ім. Д. Галицького.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто визначені мета і задачі роботи, проведені експериментальні дослідження, науковий аналіз та інтерпретація отриманих результатів, формулювання основних положень висновків. Автором особисто проведено патентно-інформаційний пошук, статистична обробка даних, підготовка наукових праць до публікації, написання і оформлення роботи.
Проведення морфологічних досліджень зразків тканин мозку експериментальних тварин виконано за консультативною допомогою професора кафедри патологічної фізіології Запорізького державного медичного університету, д.м.н. А.В. Абрамова.
Апробація результатів роботи. Головні положення роботи викладені та обговорені на в матеріалах ІІІ міжнародної науково-практичної конференції “Динаміка наукових досліджень – 2004” (Дніпропетровськ, 2004), Х Конгресу СФУЛТ (Чернівці – Київ – Чікаго, 2004), І Міжнародної науково-практичної конференції „Науковий потенціал світу – 2004” (Дніпропетровськ, 2004), Міжнародного медико-фармацевтичного конгресу „Ліки та життя” (Київ, 2005), 9-го Міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2005), VIIІ міжнародної науково-практичної конференції “Наука і освіта – 2005” (Дніпропетровськ, 2005), VII міжнародного симпозіуму “Інсульт: діагностика, профілактика, лікування” (Судак, 2005), ІV міжнародної науково-практичної конференції “Динаміка наукових досліджень – 2005” (Дніпропетровськ, 2005), VI Національного з’їзду фармацевтів України „Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України” (Харків, 2005), ІІ науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005), ІІІ Національного з’їзду фармакологів України „Фармакологія 2006 – крок у майбутнє” ( Одеса, 2006), VII міжнародної конференції студентів та молодих учених «Новини і перспективи медичної науки - 2007» (Дніпропетровськ, 2007), III з‘їзду фармакологів Росії «Фармакология – практическому здравоохранению», (Санкт-Петербург, 2007), міжнародного медико-фармацевтичного конгресу „Ліки та життя”, (Київ, 2007), І Національного конгресу «Человек и Лекарство - Украина» (Київ, 2008), Х Міжнародної конференції «Актуальні питання неврології» (Судак, 2008), Всеукраїнського Конгресу «Сьогодення та майбутнє фармації» (Харків, 2008), науково-практичної конференції “Безпечна фармакотерапія в Україні” (Тернопіль, 2008), науково-практичної конференції «Вклад молодих вчених в розвиток медичної науки і практики», (Харків, 2008), V міжнародної медико-фармацевтичної конференції студентів і молодих вчених (Чернівці, 2008), VIII Всеукраїнської науково-практичної конференції за участю міжнародних спеціалістів «Клінічна фармація в Україні» (Харків, 2008), І (62) міжнародного конгресу студентів і молодих вчених «Актуальні проблеми сучасної медицини», (Київ, 2008), міжнародної конференції студентів і молодих вчених «Актуальні проблеми сучасної медицини», (Полтава, 2008), XXVI науково-практичної конференції з міжнародною участю “Ліки- людині. Сучасні проблеми створення, дослідження та апробації лікарських засобів», (Харків, 2009), VI міжнародної медико-фармацевтичної конференції студентів і молодих вчених (Чернівці, 2009), VI міжнародної наукової конференції студентів та молодих вчених «Сьогодення та майбутнє медицини» (Вінниця, 2009), міжнародної наукової конференції студентів та молодих вчених «Молодь – медицині майбутнього» (Одеса, 2009), VII International Conference of Student Research Groups of Medical University of Warshaw "Medical problems in the year 2009" (Starogard Gdanski, 2009), наукового симпозіуму "Сучасні аспекти практичної неврології" (Ялта, 2009), XVI Російського національного конгресу "Человек и лекарство" (Москва, 2009).
Публікації. Результати роботи опубліковані в 26 статтях у наукових фахових виданнях, у 1 патенті, в 32 матеріалах і тезах конференцій, із них 3 - за кордоном.
ВИСНОВКИ
У роботі наведено теоретичне узагальнення і нове рішення наукового завдання, що визначається експериментальним обгрунтуванням доцільності та ефективності застосування з профілактичною та лікувальною метою похідних бензотіазолу в умовах патологій головного мозку (ішемія, підвищена судомна готовність, паркінсонічний синдром).
- Проведений скрінінг нейро- та психотропних властивостей, протиішемічної активності на моделі гострої ішемії головного мозку білих щурів дозволив із 9 вивчених сполук – похідних активної молекули рилузола – непрямого антагоніста вивільнення глутамату – виділити амдифлузол (речовина №4, 2-аміно-6-дифторометоксібензотіазол) і боризол (МНН рилузол, ЗАТ НВЦ “БХФЗ”, Україна) як речовини з співставленою, а в деяких випадках кращою церебропротекторною активністю, вони істотно знижують летальність тварин з ГПМК і сприяють більш швидкому усуненню неврологічної симптоматики, мають протисудомну, протигіпоксичну, антитоксичну, відстрочену анальгетичну дію при їх однократному профілактичному застосуванні.
- Амдифлузол, боризол і рілутек в умовах ГПМК знижують горизонтальну рухову активність ішемізованих щурів (на 60-70%), дослідницьку (кількість заглядань у нірки зменшується на 60-75%), але не емоційно-вегетативну активність у гострий період (з 1 по 4 доби після оклюзії загальної сонної артерії) порівняно з контролем (щури з ГПМК). При вивченні м‘язового тонусу ішемізованих щурів досліджені речовини не мають виражених міорелаксантних властивостей при щоденному застосуванні на протязі 14 діб. Чітко простежується позитивна динаміка проявів їх впливу на згасання відтворення реакції пасивного уникнення при наявності судинної патології мозку (на 50-70% більше щурів зі збереженою навичкою, ніж у контролі). У тварин в умовах ГПМК боризол, рілутек і амдифлузол покращують процеси відтворення енграм пам’яті порівняно з контрольними тваринами на 10%. Характерною рисою досліджених речовин є відсутність негативного впливу препаратів на мнестичні функції мозку в умовах ГПМК.
- Застосування амдифлузола, боризола і рілутека в умовах ГПМК нормалізує біоенергетичні процеси у тканинах головного мозку. При цьому співвідношення АТФ/АДФ у групі інтактних щурів становить 6, у щурів з ГПМК – 3,7, а у щурів, яких лікували дослідженими речовинами – 4,5 – 4,9. Можливий механізм підвищення фонду АТФ – за рахунок стимуляції СДГ-залежного шляху, опосередкованого активацією шунта Робертса (досліджені речовини збільшують вміст сукцинату в 2,5 – 3 рази у порівнянні з контролем). Похідні бензотіазолу знижують активність вільно-радикальних процесів і реактивують антиоксидантну систему ферментів.
- Амдифлузол, боризол і рілутек в умовах ГПМК запобігають виникненню структурних порушень у сенсо-моторній зоні фронтальної кори мозку за рахунок активації компенсаторних механізмів над деструктивними змінами у тканинах ГМ, препарати поліпшують трофіку ішемізованих нейроцитів.
- Нейрофізіологічними дослідами встановлено, що боризол, рілутек і амдифлузол ефективно блокують проведення збудження до інтернейронів спинного мозку, ефективно зменшують рефлекторне збудження мотонейронів у моносинаптичній рефлекторній дузі.
- За ступенем нейропротекторної дії амдифлузол достовірно зменшує інтенсивність галоперидолової каталепсії у тварин. У щурів з паркінсонізмом, викликаним нейротоксином МФТП, препарат також усував неврологічну симптоматику – тремор та ригідність.
- Внутрішньошлункове лікувальне введення амдифлузола на протязі 3-х діб щурам з паркінсонізмом сприяє збереженню цілісності мембран нейроцитів, про що свідчить зменшення гіперферментемії ВВ-КФК. Також призначення амдифлузола приводить до нормалізації активності індуцибельної NO-синтази і зменшенню гіперпродукції NO в умовах паркінсонізму, викликаного нейротоксином МФТП.
- Дослідження мітопротекторних властивостей амдифлузола ex vivo показали, що препарат блокує МФТП-індуковане відкриття мітохондріальних пор нейронів на 17,5%. При додаванні до суспензії амдифлузола вміст токсичних продуктів ОМБ за такими показниками, як АФГ та КФГ, знижується на 18% та 36% (р<0,05) відповідно.
- Визначено нейропротективний ефект амдифлузола на виділених збагачених фракціях нейронів в умовах моделювання глутаматної ,,ексайтотоксичності” in vitro. Додавання до інкубаційної суміші амдифлузола (10 мкМ) запобігало клітинній загибелі, зменшуючи розвиток як апоптозу, так і некрозу.
- Амдифлузол в умовах коразолового тесту та МЕШ проявляє виражену протисудомну активність, яку можна співставити з ефектом класичного антиконвульсанту вальпроєвої кислоти, що дозволяє припустити їх ефективність у відношенні абсансів та парціальних та/або тоніко-клонічних нападів. Амдифлузол має анальгетичну дію в тесті електро- та термоподразнення хвоста щура, на моделі «оцтово-кислі» корчі у мишей. Амдифлузол має виражену ГАМК-позитивну дію. В механізмі протисудомних властивостей амдифлузола перш за все полягає його агоністична дія на ГАМКА-рецептори, в меншому ступені - на біосинтез ГАМК.