Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
тих индивидов можно считать здоровыми от ТБ.
2.1.2 Характеристика выборки больных туберкулезом
Исследованная выборка больных туберкулезом была сформирована из индивидов, не родственных между собой. Выборка была однородной как по расовой принадлежности, так и по этническому происхождению, средний возраст составил 30,615,4 года. Все пациенты были русскими; женщин - 99 (32,6%), средний возраст которых составил 26,3 14,6 года, мужчин -205 (67,4%), средний возраст - 32,8 15,4 лет.
Диагноз туберкулеза легких устанавливался на основании данных микроскопии мокроты с обязательным рентгенологическим исследованием легких для определения формы заболевания и распространенности специфического процесса (общепринятые методы).
Обследованные пациенты имели следующие клинические формы туберкулеза: у 43 человек был диагностирован первичный туберкулез (у 35 - туберкулез внутригрудных лимфоузлов, у 3 - первичный туберкулезный комплекс, у 2 - плеврит туберкулезной этиологии первичного периода, у 2 - гематогенно-диссеминированный туберкулез легких), 150 пациентам был поставлен диагноз инфильтративного туберкулеза легких, 65 - диссеминированный туберкулез легких, 27 пациентам - очаговый туберкулез, у пятерых обследованных индивидов развилась казеозная пневмония, у 4 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких, такому же количеству больных был выставлен диагноз туберкуломы легких, 3 пациентам - туберкулез почек, 2 - туберкулез бронха, 1 - плеврит туберкулезной этиологии.
2.1.3 Характеристика семейной выборки пробандов, больных туберкулезом
Исследованная семейная выборка была зарегистрирована по пробандам - больным туберкулезом, находившихся на лечении в противотуберкулезных учреждениях г. Томска в период с 2000 по 2004 г. Всего было обследовано 42 семьи (109 человек), в том числе 25, зарегистрированных по пробандам - детям в возрасте от 1 года до 15 лет. Семнадцать семей было выбрано по взрослым пробандам в возрасте от 17 до 48 лет (табл. 3).
Таблица 3 Структура семейного материала выборки изученной по полиморфным ДНК-маркерам генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN
ВыборкаКоличество детей в семьеВсего12345Полные семьи (изучены оба родителя и дети)19(57)0001(7)20(64)Неполные семьи (изучен один родитель и дети)16(32)1(3)00017(35)Нет данных о родителях05(10)0005(10)
Примечание. В скобках указано количество индивидов.
Часть пробандов-детей составили мальчики (n=10), а девочек было в 1,5 раза больше (n=15). Средний возраст пробандов-детей разного пола достоверно не различался (7,2 года у мальчиков и 7,5 лет у девочек). Среди взрослых пробандов было 7 женщин (средний возраст - 19,8 лет) и 10 мужчин (средний возраст - 23,9 лет). Всем пробандам был поставлен диагноз туберкулеза, причем первичный и вторичный генез заболевания встречался с одинаковой частотой. Среди обследованных родственников пробандов первой степени родства было 28 лиц мужского пола, из них 8 человек болели туберкулезом, и 39 -женского, из них с туберкулезом 14.
2.2 Методы исследования
2.2.1 Клинико-лабораторные методы исследования
Клинико - эпидемиологический анализ больных туберкулезом включал: возраст начала заболевания, социальную категорию, вредные привычки (курение, злоупотребление алкоголем, употребление наркотиков), сопутствующую патологию, наличие контакта с туберкулезным больным, а также данные о туберкулезе у родственников больного. Анализу подвергались выраженность клинических проявлений (жалобы, объективный статус больного), результаты лабораторных и инструментальных методов исследования (микроскопия и посев мокроты на МБТ, чувствительность к противотуберкулезным препаратам, рентгенологическое исследование легких, общий анализ крови) на момент начала заболевания.
Для решения задачи по оптимизации и стандартизации сбора информации о больном ТБ была разработана специальная карта "Унифицированный носитель информации", содержащая блоки, охватывающие сведения о жалобах больного, эпидемиологическом анамнезе, анамнезе заболевания, объективном статусе, результатах лабораторного и инструментального обследования. В дальнейшем на основании сведений из этих карт была создана электронная база данных в формате Microsoft Excel.
2.2.2 Молекулярно - генетические методы анализа полиморфизма генов
Всего было изучено 9 полиморфных вариантов пяти генов - кандидатов подверженности туберкулезу. Исследовали 4 полиморфных варианта гена NRAMP1: 469+14G/C (INT4) - трансверсия гуанина на цитозин в 4 интроне, С274Т - консервативная замена в 3 экзоне, 1465-85 G/A - транзиция в 13 интроне и D543N - неконсервативная замена цитозина на аденин в 15 экзоне; два полиморфизма VDR гена: B/b, F/f; полиморфный вариант IL1B гена в 5 экзоне +3953А1/А2; VNTR полиморфизм гена IL1RN, расположенный во 2 интроне. Также выборки генотипировали по полиморфизму гена IL12В, обусловленному трансверсией аденина на цитозин в 3`-UTR области (табл. 4).
Для генотипирования индивидов по указанным полиморфизмам использовали образцы тотальной ДНК, выделенной из цельной венозной крови по стандартной неэнзиматической методике [Маниатис Т. и др., 1984; Lahiri D. et al., 1992]. Выделенную ДНК замораживали и хранили при температуре -20 С до проведения эксперимента. Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл.5).
Смесь для ПЦР содержала 0,5-2,0 мкл специфической пары праймеров с концентрацией 1 о.е./мл, 1,2-1,8 мкл 10 буфера для амплификации с концентрацией MgCl2 0,5-2,0 mM, 0,5-1,0 е. а. Taq