Кинетика ферментативных реакций
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
рментах они входят в состав каталитического участка. В ряде случаев ионы металлов облегчают связывание субстрата с активным центром фермента, образуя как бы своеобразный мостик. Нередко металл соединяется не с ферментом, а с субстратом, образуя металлосубстратный комплекс, который предпочтителен для действия фермента. [1]
Специфичностью участия коферментов в связывании и катализе субстрата объясняется активация ими ферментативных реакций. Особенно заметно активирующее влияние кофакторов при действии на фермент, который не насыщен кофакторами.
Субстрат тоже в известных пределах концентраций является активатором. После достижения насыщающих концентраций субстрата активность фермента не возрастает. Субстрат повышает стабильность фермента и облегчает формирование нужной конформации активного центра фермента.
Ионы металлов, коферменты и их предшественники и активные аналоги,
субстраты можно использовать на практике как препараты, активирующие ферменты.
Активация некоторых ферментов может осуществляться путем модификации, не затрагивающей активный центр их молекул. Возможно несколько вариантов такой модификации:
1) активация неактивного предшественника - профермента, или зимогена. Например, превращение пепсиногена в пепсин;
2) активация путем присоединения какой-либо специфической модифицирующей группы к молекуле фермента;
3) активация путем диссоциации неактивного комплекса белок - активный фермент. [6]
2.5 Ингибирование ферментов
Существуют реагенты, способные взаимодействовать более или менее специфично с той или иной боковой цепью белков, что приводит к ингибированию активности фермента. Это явление позволяет изучать природу аминокислотных боковых остатков, принимающих участие в данной ферментативной реакции. Однако на практике следует учитывать многочисленные тонкости, делающие однозначную интерпретацию результатов, полученных со специфическими ингибиторами, довольно трудной и зачастую сомнительной. Прежде всего, чтобы реакция с ингибитором подходила для изучения природы участвующих в реакции боковых цепей, она должна удовлетворять следующим критериям:
) быть специфичной, т.е. ингибитор должен блокировать только нужные группы;
) ингибировать активность фермента, и это ингибирование должно становиться полным при увеличении числа модифицированных групп;
) реагент не должен вызывать неспецифическую денатурацию белка.
Выделяют 2 группы ингибиторов: обратимого и необратимого действия. В основе подразделения лежит критерий восстановления активности фермента после диализа или сильного разведения раствора фермента с ингибитором.
По механизму действия выделяют конкурентное, неконкурентное, бесконкурентное, субстратное и аллостерическое ингибирование. [3]
Конкурентное ингибирование
Конкурентное ингибирование было открыто при изучении ингибирования, вызываемого аналогами субстрата. Это торможение ферментативной реакции, вызванное связыванием с активным центром фермента ингибитора сходного по структуре с субстратом и препятствующего образованию фермент-субстратного комплекса. При конкурентном торможении ингибитор и субстрат, будучи сходными по строению, конкурируют за активный центр фермента. С активным центром связывается то соединение молекул, которого больше.
Такие представления о механизме ингибирования были подтверждены экспериментами по кинетике реакций конкурентного ингибирования. Так, было показано, что в случае конкурентного ингибирования аналог субстрата не влияет на скорость разложения уже образовавшегося комплекса фермент-субстрат, т.е. при использовании бесконечно большого избытка субстрата получается одна и та же максимальная скорость как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора. Напротив, ингибитор влияет на величину константы диссоциации и константы Михаэлиса. Из этого можно сделать вывод, что ингибитор реагирует с группами белка, участвующими тем или иным образом в связывании субстрата, следовательно, из-за взаимодействия его с этими группами прочность связывания субстрата уменьшается (т.е. уменьшается число молекул фермента, способных связывать субстрат).
Позже было показано, что кинетически конкурентное ингибирование может быть вызвано не только аналогами субстратов, но и другими реагентами, химическая структура которых абсолютно отличается от структуры субстрата. В этих случаях также предполагалось, что данный реагент взаимодействует с группой, ответственной за связывание субстрата.
Для конкурентного ингибирования теоретически могут существовать две возможности:
- связывающие и каталитические центры фермента перекрываются; ингибитор связывается с ними, но влияет только на группы центра связывания;
- центр связывания и каталитический центр в молекуле фермента пространственно обособлены; ингибитор взаимодействует с центром связывания.
Существуют следующие элементарные стадии реакции:
где I - ингибитор, а KI - константа диссоциации комплекса фермент - ингибитор.
Относительная скорость (отношение скорости ферментативной реакции, измеренной в присутствии ингибитора (vi), к максимальной скорости) равна
vi / V = [ES] / [E]T
поскольку для общей концентрации фермента справедливо
[E]T = [E] + [ES] + [EI]
то1 / vi = (Ks / V[S]) (1 + [I] / KI) + 1 / V
Очевидно, если [I]