Кинетика ферментативных реакций
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
т-субстратного комплекса равна:
Ks = ([S]0 - [ES]) ([E]T - [ES]) / [ES]
Его решение относительно [ES] дает
Из двух возможных решений может быть выбрано только отрицательное, так как только оно удовлетворяет начальным условиям: [ES] = 0 при [S]0 = 0 или [Е]T = 0. По аналогии с уравнением отношения v/Vmax мы получили уравнение начальной скорости. Квадратное уравнение, полученное из уравнения константы диссоциации фермент-субстратного комплекса, найденную чуть выше, с помощью формул v = k2 [ES] и Vmax = k2 [E]T, можно привести к следующему виду:
[S]0 Vmax / v = Ks Vmax / (Vmax - v) + [E]T
Если известно Vmax можно рассчитать Ks.
Следует учесть два предельных случая. В первом случае [S]<<Km.
v = (Vmax / Km) [S] = k[S]
Таким образом, мы получили кажущуюся реакцию первого порядка и k=Vmax/Km - кажущуюся кинетическую константу первого порядка. Ее фактическая размерность - время -1, но она является комбинацией констант скорости первого и второго порядков нескольких элементарных стадий, т.е. k1k2[E]T/(k-1 + k2). При условиях кажущегося первого порядка k является мерой прохождения реакции.
Другой предельный случай: [S] >> Km. Здесь константа Km ничтожно мала по сравнению с [S], и, таким образом, получаем v = Vmax. [2]
1.4 Образование кинетически устойчивого комплекса фермент - продукт
Если в ходе реакции происходит образование кинетически устойчивого комплекса фермент - продукт, механизм реакции выглядит следующим образом:
Применив предположение о стационарном состоянии, можно написать дифференциальные уравнения:
d [ES] /dt = k1 [E] [S] + k-2 [EP] - (k-1 + k2) [ES] = 0[EP] /dt = k2 [ES] - (k-2 + k3) [EP] = 0
Из этих уравнений следует, что
[ES] = [(k-2 + k3) / k2] [EP]
[E] = [(k-1 k-2 + k-1 k-3 + k2k3) / k1k2 [S]] [EP]
Так как v = k3 [EP]
и[E]T = [E] + [ES] + [EP] =
= [(k-1 k-2 + k-1 k-3 + k2k3) / k1k2 [S] + (k-2 + k3) / k2 + 1] [EP] =
= {[k-1 k-2 + k-1 k-3 + k2k3 + k1 [S] (k-2 + k3) + k1k2 [S]] / k1k2 [S]} [EP]
получаем
[EP] = k1k2[S] [E]T / [k-1 k-2 + k-1 k-3 + k2k3 + k1 [S] (k-2 + k3 + k2)]= k1k2k3[S] [E]T / [k-1 k-2 + k-1 k-3 + k2k3 + k1 [S] (k-2 + k3 + k2)] =
= [k2k3 / (k-2 + k3 + k2)] [E]T[S] / [(k-1 k-2 + k-1 k-3 + k2k3) / k1 (k-2 + k3 + k2) + [S]]
То есть
Vmax = [k2k3 / (k-2 + k3 + k2)] [E]Tm = (k-1 k-2 + k-1 k-3 + k2k3) / k1 (k-2 + k3 + k2)
В этом случае уже очень сложно вычислить конкретные значения индивидуальных констант скорости, так как прямо измерить можно только их отношение. Ситуация еще более затрудняется при усложнении механизма ферментативной реакции, когда в реакции участвуют больше двух комплексов, потому что количество констант скорости в уравнении, естественно, гораздо больше, и их соотношения также сложнее. [2]
Однако ситуация упрощается, если после обратимой реакции образования первого комплекса последующие элементарные стадии необратимы. Важными представителями ферментов, подчиняющихся этому механизму, являются протеолитические ферменты и эстеразы. Механизм их реакции можно записать следующим образом:
где ES` - ацилферментное промежуточное соединение, которое разлагается под действием воды. Мы можем написать
d [P2] /dt = d [P1] / dt = v = k1k2k3 [S] [E]0 / [k3(k-1 + k2) + [S] (k2 + k3)]
Vmax = k2k3 [E]0 / (k2 + k3) = kкат [E]0m = k3 (k-1 + k2) / (k2 + k3) k1кат / Km = k2k1 / (k-1 + k2) = k2 / Km
Константа Михаэлиса стадии ацилирования - Km' Ks. Чем больше отношение kкат/Km, тем выше специфичность субстрата. [5]
Определение констант значительно упрощается, если эксперимент проводят в присутствии нуклеофильного агента (N), способного конкурировать с водой. Тогда
k3 = k3 [H2O] и Pi (i = 1, 2, 3) - продукты.
vi = kкат, i [E0] [S] / (Km + [S])кат, 1 = k2 (k3 + k4 [N]) / (k2 + k3 + k4 [N])кат, 2 = k2k3 / (k2 + k3 + k4 [N])кат, 3 = k2k4 [N] / (k2 + k3 + k4 [N])m = Ks (k3 + k4 [N]) / (k2 + k3 + k4 [N])
/vN = Ks (k3 + k4 [N]) / k2k3 [S] [E0] + (k2 + k3 + k4 [N]) / k2k3 [E0]
Так как известно, что Ks/k2 = Km/ kкат, и если нуклеофил отсутствует, то
1/v = Ks / k2 [S] [E0] + (k2 + k3) / k2k3 [E0]
и для определения констант можно использовать точку пересечения прямых в координатах 1/vN (и 1/v) - 1/[S]. Две прямые линии в двойных обратных координатах пересекаются во втором квадранте. В отсутствии нуклеофила точка пересечения прямой с вертикальной осью определяется как 1/Vmax и 1/kкат[E0], а с горизонтальной осью - как -1/Km. Координаты точки пересечения двух прямых: -1/Ks и 1/k3[E0]. Расстояние между 1/Vmax и 1/k3[E0] равно 1/k2[E0].
1.5 Анализ полной кинетической кривой реакции
Уравнение Михаэлиса - Ментен в исходном виде относится только к необратимым реакциям, т.е. к реакциям, где рассматривается только начальная скорость, а обратная реакция не проявляется из-за недостаточного количества продукта и не влияет на скорость реакции. В случае необратимой реакции полную кинетическую кривую можно легко анализировать (для произвольного интервала времени t), интегрируя исходное уравнение Михаэлиса - Ментен. В этом случае, следовательно, сохраняется предположение, что в ходе реакции образуется только один промежуточный фермент-субстратный комплекс. Так как для интервала времени t не ставится никаких ограничений, концентрация субстрата в момент анализа не может быть равной первоначально введенной его концентрации. Таким образом, также необходимо принимать во внимание изменение [S] в ходе реакции. Пусть S0 - начальная концентрация субстрата, (S0 - y) - концентрация в момент времени t. Тогда, на основе исходного уравнения Михаэлиса - Ментен (если y - количество превращенного субстрата), мы можем написать
dy / dt = Vmax (S0 - y) / (Km +S0 - y)
Взяв обратные величины и разделив переменн?/p>