Кинетика ферментативных реакций
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
птимальном рН и функциональные группы активного центра находятся в наиболее реакционноспособном состоянии, и субстрат находится в форме, предпочтительной для связывания этими группами фермента. [6]
При построении кривых, описывающих зависимость активности фермента от рН, измерения при всех значениях рН обычно проводят в условиях насыщения фермента субстратом, поскольку величина Km для многих ферментов изменяется с изменением рН.
Кривая, характеризующая зависимость активности фермента от рН, может иметь особенно простую форму в тех случаях, когда фермент действует на электростатически нейтральные субстраты или субстраты, у которых заряженные группы не играют существенной роли в каталитическом акте. Примером таких ферментов служит папаин, а также инвертаза, катализирующая гидролиз нейтральных молекул сахарозы и сохраняющая постоянную активность в интервале рН 3,0-7,5.
Значение рН, соответствующее максимальной активности фермента, не обязательно совпадает со значением рН, характерным для нормального внутриклеточного окружения этого фермента; последнее может быть как выше, так и ниже оптимума рН. Это позволяет предположить, что влияние рН на активность фермента может быть одним из факторов, ответственных за регулирование ферментативной активности внутри клетки. Поскольку в клетке содержатся сотни ферментов, и каждый из них по-разному реагирует на изменение рН, значение рН внутри клетки является, возможно, одним из важных элементов в сложной системе регуляции клеточного метаболизма. [5]
2.3 Определение количества фермента по его активности
Содержание фермента в данном растворе или в тканевом экстракте можно определить, измеряя его каталитический эффект. Для этого необходимо знать:
) общую стехиометрию катализируемой реакции;
) возможную потребность в кофакторах - в ионах металлов или коферментах;
) зависимость активности фермента от концентраций субстрата и кофактора, т.е. величины Km как для субстрата, так и для кофактора;
) значение рН, соответствующее максимальной активности фермента;
) область температур, при которых фермент устойчив и сохраняет высокую активность.
Кроме того, необходимо иметь в своем распоряжении какую-нибудь достаточно простую аналитическую методику, позволяющую определять скорость исчезновения субстрата или скорость появления продуктов реакции.
Всегда, когда это возможно, анализ на содержание фермента проводится в стандартных условиях, при которых поддерживается оптимальное значение рН и концентрация субстрата, превышающая концентрацию насыщения; в этом случае начальная скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и пропорциональна только концентрации фермента. Для ферментов, нуждающихся в кофакторах - ионах металлов или коферментах, концентрация этих кофакторов также должна превышать концентрацию насыщения, с тем, чтобы фактором, лимитирующим скорость реакции, была концентрация фермента. Обычно измерение скорости образования продукта реакции может быть проведено с большей точностью, чем измерение скорости исчезновения субстрата, так как для поддержания кинетики нулевого порядка субстрат, как правило, должен присутствовать в сравнительно высоких концентрациях. Скорость образования продукта (или продуктов) реакции можно измерять химическими или спектр о фотометрическими методами. Второй способ более удобен, поскольку он позволяет непрерывно регистрировать ход реакции на лепте самописца. [5]
По международному соглашению за единицу ферментативной активности принимается количество фермента, способное вызвать превращение одного микромоля субстрата в минуту при 25С в оптимальных условиях. Удельной активностью фермента называют число единиц ферментативной активности в расчете на 1 мг белка. Эту величину используют в качестве критерия чистоты ферментного препарата; она возрастает по мере очистки фермента и для идеально чистого препарата достигает максимального значения. Под числом оборотов понимают число молекул субстрата, подвергающихся превращению в единицу времени в расчете на одну молекулу фермента (или на один активный центр) в условиях, когда скорость реакции лимитируется концентрацией фермента.
2.4 Активация ферментов
Регуляция ферментов может осуществляться путем взаимодействия с ними различных биологических компонентов или чужеродных соединений (например, лекарств и ядов), которые принято называть модификаторами или регуляторами ферментов. Под действием модификаторов на фермент реакция может ускоряться (активаторы) или замедляться (ингибиторы).
Активация ферментов определяется по ускорению биохимических реакций, наступающему после действия модификатора. Одну группу активаторов составляют вещества, влияющие на область активного центра фермента. К ним относятся кофакторы ферментов и субстраты. Кофакторы (ионы металлов и коферменты) являются не только обязательными структурными элементами сложных ферментов, но и по существу их активаторами.
Ионы металлов бывают довольно специфичными активаторами. Часто для некоторых ферментов требуются ионы не одного, а нескольких металлов. Например, для Na+, K+-АТФазы, осуществляющей транспорт одновалентных катионов через клеточную мембрану, необходимы в качестве активаторов ионы магния, натрия и калия.
Активация с помощью ионов металлов осуществляется по разным механизмам. В некоторых фе