Кинетика ферментативных реакций
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
уменьшении концентрации донора протонов константа превращается в константу Михаэлиса Km, а при очень низких уровнях донора протонов получаем константу диссоциации KS. [2]
1.2 Преобразование уравнения Михаэлиса - Ментен
Исходное уравнение Михаэлиса - Ментен является уравнением гиперболы, где одна из констант (Vmax) - асимптота к кривой. Другая константа (Km), отрицательное значение которой определяется второй асимптотой, равна концентрации субстрата, необходимой для достижения Vmax / 2. В этом легко убедиться, так как если
v=Vmax / 2, то
Vmax / 2 = Vmax [S] / (Km + [S])
Vmax / Vmax = 1 = 2 [S] / (Km + [S])m + [S] = 2 [S], т.е. [S] = Km при v = Vmax/2.
Уравнение Михаэлиса - Ментен можно алгебраически преобразовать в другие формы, более удобные для графического представления экспериментальных данных. Одно из наиболее распространенных преобразований сводится просто к тому, что приравнивают друг другу величины, обратные левой и правой части уравнения
т.е.
В результате преобразования получаем выражение
которое носит название уравнения Лайнуивера-Бэрка. Согласно этому уравнению, график, построенный в координатах 1/[S] и 1/v, представляет собой прямую, тангенс угла наклона которой равен Km/Vmax, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен 1/Vmax. Такой график, построенный по методу двойных обратных величин, имеет то преимущество, что он даёт возможность более точно определить Vmax; на кривой, построенной в координатах [S] и v, Vmax является асимптотической величиной и определяется значительно менее точно. Отрезок, отсекаемый на оси абсцисс, на графике Лайнуивера-Бэрка равен -1/Km. Из этого графика можно также извлечь ценную информацию, касающуюся ингибирование фермента. [3]
Другое преобразование уравнения Михаэлиса-Ментен состоит в том, что обе части уравнения Лайнуивера-Бэрка умножают на Vmax*v и после некоторых дополнительных преобразований получают
Соответствующий график в координатах v и v/[S] представляет се 4, рис. 1]. Такой график (график Эди-Хофсти) не только даёт возможность очень просто определить величины Vmax и Km, но и позволяет выявить возможные отклонения от линейности, не обнаруживаемые на графике Лайнуивера-Бэрка.
Уравнение также можно линеаризовать в другой форме
[S] / v = Km / Vmax + [S] / Vmax
В этом случае следует строить зависимость [S] / v от [S]. Наклон полученной прямой равен 1 / Vmax; отрезки, отсекаемые на осях ординат и абсцисс, равны (Km / Vmax) и (- Km) соответственно. По имени автора этот график называют графиком Хейнса. [1]
Статистический анализ показал, что методы Эди - Хофсти и Хейнса дают более точные результаты, чем метод Лайнуивера - Берка. Причиной этого является то, что в графиках Эди - Хофсти и Хейнса и зависимые, и независимые переменные входят в величины, откладываемые на обеих осях координат.
1.3 Влияние концентрации субстрата на кинетику реакции
Во многих случаях условие постоянства концентрации субстрата не выполняется. С одной стороны, избыток субстрата не используется в реакции in vitro с некоторыми ферментами из-за часто происходящего ингибирования ферментативной активности субстрата. В этом случае можно применять только оптимальную его концентрацию, и это не всегда обеспечивает избыток субстрата, необходимый для выполнения кинетических уравнений обсуждаемых выше механизмов. Более того, в клетке in vivo избыток субстрата, необходимый для осуществления этого условия, обычно не достигается.
В ферментативных реакциях, где субстрат не находится в избытке и, следовательно, его концентрация меняется в ходе реакции, константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна
KS = ([S] 0 - [ES] - [P]) [E]T - [ES])/[ES]
([S]0 - концентрация субстрата при t = 0). В этом случае начальная скорость реакции (в стационарном состоянии) определяется формулой
v= Vmax [St] / (Km + [St])
где [St] - концентрация субстрата в момент времени.
Тем не менее, можно написать приблизительное решение для двух случаев, когда [S]о = [St]:
) если это неравенство выполняется из-за больших значений t, т.е. когда более 5% от начальной концентрации субстрата израсходовалось за время реакции;
) если концентрацией фермента нельзя пренебречь по сравнению с концентрацией субстрата и, таким образом, нужно принимать во внимание концентрацию фермент-субстратного комплекса.
Если t велико, а концентрация [ES] пренебрежимо мала по сравнению с [S]0, то уравнение константы диссоциации фермент-субстратного комплекса переходит в следующее:
KS = ([S]0 - [P]) ([E]T - [ES]) / [ES]
Для значения концентрации [St], которая меняется в ходе реакции, удовлетворительным приближением служит значение ([S]0 + [St])/2. Так как [St] = [S]0 - [Р], среднюю скорость; можно выразить как
Подставив это выражение и приблизительное значение [St] в
v= Vmax [St] / (Km + [St]),
получим:
При сравнении значений, рассчитанных на основе этого приближения, со значениями, полученными из точного, проинтегрированного уравнения Михаэлиса - Ментен, оказывается, что ошибка в определении Km составляет 1 и 4% при расходовании 30 и 50% субстрата соответственно. Следовательно, ошибка при данном приближении незначительна по сравнению с ошибкой измерения.
Когда расход субстрата не превышает 5% начальной концентрации, но концентрация фермента так велика, что [ES] по сравнению с [S]0 нельзя не учитывать, константа диссоциации фермен