Изучение микробного биоценоза слизистой оболочки зева
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
вичному обследованию подвергнуто еще 13 человек. Таким образом, всего обследовано 36 студентов. Данные о характеристике контингента и методах обследования представлены в таблице №1.
Таблица 1
Контингент, материалы и методы исследования
№ п.п.КонтингентКоличество обследуемыхМатериалыМетодыЧисло проб1.Студенты 2 курса л/ф12Отделяемое из зеваМикробиологический: Тинкториальные свойства (окраска по Граму); определение кислотоустойчивых микроорганизмов (окраска по Цилю-Нильсену); определение капсул по Бури-Гинсу; определение капсул по Йоне; оценка адгезии на эпителиоцитах и интенсивности воспалительного процесса по состоянию нейтрофилов (окраска по Романовскому-Гимзе). Бактериологический Изучение некоторых факторов болезнетворности (гиалуронидаза, плазмокоагулаза, гемотоксин, лецитиназа). 36 36 12 24 36 288 1522.Студенты 3 курса л/ф24
Материалом для исследования служило отделяемое из зева, изолированное путем отбора стерильными тампонами в период практических занятий на кафедре.
Всего проведено микробиологических исследований - 144. Мазки окрашивали по следующим методам:
- Метод Грама в модификации Синева.
- препарат фиксировать над пламенем;
- на препарат положить фильтр-бумагу, пропитанную 1% раствором генцианвиолета, добавить 2 капли воды - 2 мин.;
- бумагу удалить, оставшуюся краску слить;
- окрасить мазок раствором Люголя - 1 мин.;
- раствор Люголя слить, мазок промыть 96% спирте (30-40 с.);
- тщательно смыть спирт водой;
- окрасить водным фуксином - 2 мин.;
- промыть водой и высушить.
- Метод Циля-Нильсена.
- нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой, и подогревать до появления паров (3-5 мин.);
- бумагу снять, мазок охладить и обеiветить 5% H2SO4 (2-4 c.);
- тщательно промыть водой;
- окрасить синькой Леффлера (3-5 мин.)
- промыть водой и высушить.
Кислотоустойчивые бактерии в результате такой окраски становятся рубиново-красными, остальные - синими.
III. Метод Романовского-Гимзы.
- мазки фиксировать в метиловом спирте - 2-3 мин.;
- препарат окрашивают рабочим раствором красителя (1 капля готовой краски на 1 мл воды с рН 7,2) в течение 1 часа;
- промыть водой (рН 7,2) и высушить.
В результате такой окраски протоплазма клеток окрашивается в синий цвет, ядерные элементы - в красно-фиолетовый.
IV. Метод Бури-Гинса.
- на предметное стекло нанести каплю разведенной туши (1:9), смешать ее с исследуемым материалом;
- приготовить тонкий мазок, высушить;
- фиксировать пламенем;
- окрасить фуксином (5 мин.);
- промыть и высушить.
В результате такой окраски бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы - беiветные, общий фон - черный.
V. Метод Йоне.
- мазок фиксировать в смеси Никифорова;
- на фиксированный препарат налить 0,02% водный раствор генцианвиолета и подогреть над пламенем;
- налить на препарат 1% уксусной кислоты - 10 с.;
- промыть, высушить, микроскопировать.
Для выделения чистой культуры микроорганизмов предварительно делали посевы на солевой и сахарный МПБ (72 посева), каждый из которых в последующем рассевался на 2 чашки с 5% кровяным МПА и на 2 чашки со средой Чистовича (всего 288 проб).
При выделении культур микроорганизмов изучали характер роста последних на вышеперечисленных средах, обращая внимание на наличие пигмента. Из колоний готовили мазки с окраской по Граму. Отобранные культуры микроорганизмов, представляющие для нас интерес (кокковые формы, палочковидные микроорганизмы) для накопления чистых культур, отсевали на скошенный МПА и кровяной МПА. В последующем определяли некоторые факторы болезнетворности, такие как: гиалуронидазу, плазмокоагулазу, лецитиназу, фибринокиназу, гемотоксин.
Методики определения факторов болезнетворности
- Определение гиалуронидазы.
Гиалуронидаза - бактериальных фермент, расщепляющий составную часть соединительной ткани - гиалуроновую кислоту, обуславливает действие фактора проникновения бактерий.
Приготовление субстрата (гиалуроновой кислоты) и определение рабочей дозы из пупочных канатиков по методу Смирновой Л.Г. Пупочные канатики, собранные в 0,5% раствор карболовой кислоты, тщательно промыть дистиллированной водой, очистить от крови и сосудов, пропустить через мясорубку, полученную массу взвесить и залить полуторным объемом дистиллированной воды. Отстоять 30 мин при повторном встряхивании. Вылить полученную жидкость на воронку с наложенной в 2-3 слоя стерильной марлей, отжать и бросить на 1 мин в кипящую воду, количественно соответствующую первоначальному весу измельченных канатиков. Вскипятить субстрат 1 раз. Полученную жидкость быстро отфильтровать через двойной слой стерильной марли в стерильные пробирки, в каждую добавить 2 капли хлороформа. Пробирки закрыть ватно-марлевыми пробками и хранить в холодильнике.
Постановка реакции.
Предварительное титрование субстрата.
Рабочий титр - та наименьшая концентрация раствора, при которой гиалуроновая кислота образует ясно видимый сгусток после инкубирования в термостате и добавления уксусной кислоты.
Таблица 2
Определение рабочего титра гиалуроновой кислоты
№ пробирки12345Субстрат (мл)0,50,40,30,20,1Н2О (мл)0,50,60,70,80,9
Смешиваем субстрат и дистиллированную воду согласно данным таблицы №3, термостатируем при t = 37C в течение 15 мин, затем охлаждаем в течение 5 мин и добавляем 2 капли 2 н. раствор