Идентификация микроводорослей Euglena glacilis и анализ их чувствительности к ингибирующим веществам
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
ие (151)мин. Среду можно хранить в холодильнике при 8С в течение недели.
Стрептомицин: раствор стрептомицина концентрации 100 г/дм3 готовят путем внесения во флакон с 0,1 г антибиотика 1 см3 стерильной дистиллированной воды.
Физиологический раствор: В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют 8,5 г хлористого натрия, разливают раствор в чистые пробирки по 100 см3 и стерилизуют при (1212)С в течение (202)мин.
Оборудование. Световой микроскоп "Биолам-2М" с фотонасадкой МФН-11, цифровая микрокамера, таймер с точностью отсчета 0,1 с, пробирки, пипетки, капилляры, предметные стекла, камера Горяева, чашки Петри.
2.1.2 Выделение чистых культур микроводорослей и их идентификация.
Метод Пастёра. Пользуясь жидкими питательными средами, можно выделить микроорганизмы из их смеси постепенным разбавлением культуры каким-либо стерильным раствором до тех пор, пока в одной капле останется одна клетка микроорганизма. В колбочки с небольшим количеством питательной среды высевают по одной капле разведенной культуры. В тех колбочках, где выросла одна колония (в виде пятна на дне), попала одна клетка и образовалась чистая культура. В качестве питательной среды для выделения микроводорослей Euglena glacilis используется среда Лозино-Лозинского, в ней содержится необходимый комплекс питательных микро- и макроэлементов, способствующий росту микроводорослей.
Систематических признаков у микроводорослей не так моного, и их определение связанно со значительными трудностями. Важными морфологическими признаками являются форма и размеры тела, число и длянна жгутиков, их расположение, наличие и отсутствие хролопластов, окраска и др. хроматофоры микроводорослей окрашиваются акридиновым оранжевым. Функциональное состояние водорослей на разных этапах очистки также оценивают при помощи акридинового оранжевого. Живые клетки микроводорослей окрашиваются в ярко-красный цвет, водоросли с угнетенным процессом фотосинтеза дают оранжево-розовую люминестенцию.
Зеленые формы Euglena glacilis становятся беiветными при выращивании в темноте, но снова приобретают зеленую окраску на свету.
.2 Методы анализа
2.2.1 Методы определения содержания микроводорослей
Подсчет клеток в счетных камерах:
Метод прямого подсчета клеток микроорганизмов в счетных камерах успешно применяют для определения общего количества микроорганизмов, содержащихся во взвесях (суспензиях).
Известны счетные камеры разных конструкций (Горяева, Фукс - Розенталя, Петрова - Хауссера, Тома - Цейса и др.).
Метод количественного учета микроорганизмов с помощью счетных камер имеет ограничения применения, связанные с тем, что в счетных камерах проводится учет всех клеток микроорганизмов без их дифференциации на живые и мертвые клетки. Кроме того, счетные камеры могут быть использованы лишь для подсчета относительно крупных объектов - клеток водорослей, дрожжей, спор грибов, микроскопируемых при объективе от 8 до 40.
В качестве примера можно привести камеру Горяева, которая внешне представляет собой толстое предметное стекло, разделенное поперечными бороздками, образующими три поперечно расположенные плоские площадки в соответствии с рисунком 12а. Средняя площадка продольным прорезом разделена пополам, причем на каждой половине нанесена квадратная сетка. Две боковые площадки расположены на 0,1 мм выше средней, они служат для притирания покровного стекла в соответствии с рисунком 12б.
Сетка разделена на определенное число больших и маленьких квадратов, по-разному сгруппированных. Постоянной величиной во всех сетках является маленький квадрат АВСD в соответствии с рисунком 12в, сторона которого равна 1/20 мм, площадь его - 1/400 мм, а объем при высоте камеры 1/10 мм - 1/4000 мм или 1/4000000 мл. Так называемый большой квадрат АВСD состоит из 16 малых квадратиков. Камера Горяева имеет площадь 9 мм, объем камеры 9 мм и разбита на 225 больших квадратов (15 рядов по 15 больших квадратов в каждом ряду) [15].
Заполнение камеры и подсчет клеток:
Каплю взвеси наносят капилляром или пипеткой на сетку камеры и сверху накрывают чистым покровным стеклом. Жидкость под покровным стеклом должна равномерно без пузырьков распределиться по всей сетки, не выступая в желобок между стенками. Большими пальцами покровное стекло плотно притирают к боковым площадкам камеры до появления картины интерференции (колец Ньютона). Заполненную камеру помещают на предметный столик микроскопа и через 2 минуты микроскопируют с объективом от 8 до 40 (в поле зрения должны быть отчетливо видны как квадратики, так и клетки микроорганизмов). Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или 0,5%-ным раствором формалина.
а - вид сверху; б - вид сбоку; в - вид при малом увеличении; h - высота камеры
Рисунок 12 - Счетная камера Горяева
Обычно просчитывают количество клеток в пяти больших квадратах (т. е. в 80 малых), расположенных по диагонали. Учитывают все клетки, размещенные внутри квадрата и на пограничных линиях, если они большей частью лежат внутри квадрата. Клетки, разделенные пограничной линией пополам, считают только на двух из четырех границ квадрата, а клетки, лежащие большей своей половиной вне данного квадрата, совсем не учитывают. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по [15] формуле:
(31)
где М - количество клеток в 1 мл суспензии;
a - среднее количество клеток в квадрате сетки;
h - высота камеры, мм;
S - площадь квадра