Идентификация микроводорослей Euglena glacilis и анализ их чувствительности к ингибирующим веществам
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
ляли в среде Лозино-Лозинского при температуре 20С и естественном освещении. Пересев культуры клеток в свежую среду осуществляли через каждые 3 суток для поддержания их в состоянии логарифмического роста. Определение количества клеток микроводоросли осуществляли в камере Горяева с помощью микроскопа. Подсчитанное количество клеток находилось в интервале 103-104 кл./мл.
В качестве антибиотиков использовали стрептомицин сульфат. Раствор стрептомицина концентрации 100 г/дм3 готовят путем внесения во флакон с 0,1 г антибиотика 1 см3 стерильной дистиллированной воды.
Измерение рН растворов выполняли на рН-метре-121. Значение рН для среды Лозино-Лозинского было 7,0.
Исследования проводились на образцах, искусственно загрязненных антибиотиками в диапазоне концентраций 0,0001-1000 ед./г. Для этого препараты антибиотиков вносили в подготовленный препарат содержащий водоросли Euglena gracilis.
Для наблюдения за подвижностью клеток микроводоросли Euglena gracilis использовали микроскоп производства БелОМО, обьект-микрометр, капилляры, зажимы, цифровой таймер с точностью отсчета 0,1 с. Для автомаизации измерений на окуляр микроскопа помещали фотонасадку с фотодиодом ФД-256. После усиления с помощью микросхемы К140УД8А сигнал регистрировался на самопиiе КСП-4.
В физиологический раствор (4 мл) добавляли 0,5 мл антибиотика соответствующей концентрации и 0,5 мл микроводоросли Euglena gracilis, выдерживали в течение 15 мин, заполняли капилляры и измеряли подвижность клеток с помощью микроскопа при увеличении 20x10. В качестве контроля использовали образцы с добавлением 0,5 мл чистой среды Лозина-Лозинского и 0,5 мл клеток. Для увеличения точности показаний измерения проводили на 9 клетках микроводоросли. Результаты обрабатывали статистически, используя программное обеспечение Microsoft Excel. Во время поиска пищи и при оптимальных условиях существования клетки микроводоросли совершают поступательные движения в разных направлениях. В присутствии ингибирующих веществ скорость поступательного движения клеток снижается. При воздействии токсичных веществ поступательный характер движения клеток изменяетсяна вращательный и они теряют жизнеспособность. "ияние ксенобиотиков на клетки Euglena gracilis характеризовали изменением относительного значения скорости:
(36)
где VK - средняя скорость движения клеток в контрольном образце;
В - относительная подвижность клеток.
Ингибирующий (IС50) эффект действия антибиотиков определяли величиной концентраций, которые соответствовали 50%-ному изменению относительной подвижности клеток. Порог обнаружения (Сmin) характеризовали величиной концентрации антибиотика, вызывавшей изменение относительной подвижности на 10%. Результаты исследований подвижности микроорганизмов Euglena gracilis в питательной среде в присутствии антибиотиков представлены в таблице 1 и на рисунке 13.
Чувствительность клеток микроводоросли Euglena gracilis к антибиотикам в искусственной питательной среде находилась в интервале 0,001-0,1 мг/л. На рисунке 13 приведен график изменения относительной подвижности клеток микроводоросли в зависимости от логарифма концентрации антибиотика стрептомицин сульфат. Как видно из рисунка, зависимость носит линейный характер и может быть описана уравнением
B=?aтАвlgC + b, (37)
где a, b - экспериментально найденные константы.
Сравнительный анализ подвижности микроводоросли Euglena gracilis в искусственной питательней среде показывает, что клетки сохраняют высокую чувствительность к антибиотикам и в сложных средах.
Таблица 1 - "ияние антибиотиков на подвижность микроводоросли Euglena gracilis
Вещество Концентрация, ед./млВ, %Сmin, ед./млIC50, ед/млКонтроль -100--Стрептомицин 1000400,002101004510501,0550,165
Рисунок 13 - Зависимость относительной подвижности клеток Euglena gracilis от логарифма концентрации антибиотика стрептомицин сульфат в питательной среде Лозино-Лозинского (Т= 20С)
Процедура анализа антибиотиков предложенным методом значительно проще и быстрее, чем редуктазным методом. Это позволяет использовать данный метод для тестирования мясомолочной продукции. В изученной области концентрации антибиотиков клетки микроводоросли сохраняли жизнеспособность, следовательно действие антибиотиков на данные микроорганизмы носит ингибирующий, а не токсичный характер. При смене питательной среды клетки быстро восстанавливали исходную активность. Для оценки устойчивости микроводоросли Euglena gracilis к антибиотикам определяли значение IC50 в искусственной питательной среде. Таким образом, в работе предложен быстрый, простой и чувствительный метод количественного определения антибиотиков в мясомолочной продукции, основанный на измерении подвижности клеток микроводоросли Euglena gracilis, позволяющий в течение 15-20 мин обнаружить присутствие антибиотиков в концентрации 0,001 ед./мл с относительной погрешностью 10%.
2.3.3 Анализ влияния разобщителей дыхания и синтеза АТФ на подвижность клеток
В качестве препарата разобщителя дыхания и синтеза АТФ была взята ацетилсалициловая кислота. Разобщители окислительного фосфорилирования, являясь амфипатическими, повышают проницаемость мембраны для протонов, тем самым снижая электрохимический потенциал и выключая АТФ-синтетазу по типу короткого замыкания.
Для определения влияния разобщителей дыхания и синтеза АТФ на микроводоросли были проведены измерения тепловыделения микроводоросли Euglena gracilis микрокалориметрическим методам. Испытывали действие разобщителей при ?/p>