Идентификация микроводорослей Euglena glacilis и анализ их чувствительности к ингибирующим веществам
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
та сетки, мм;
- коэффициент перевода см в мм;
n - коэффициент разведения исследуемой суспензии [15].
2.2.2 Методы определения подвижности клеток
Получаем растворы антибиотика стрептомицина (1000-0,1 ед./см3).
Проводят измерение скорости движения клеток E.gracilis в контрольном образце и в образце с химическим веществом. В приготовленные растворы вносят культуру микроводоросли в экспоненциальной стали роста в соотношении 9: 1 и выдерживают на протяжении 15 мин, после чего образец вводят в капилляры. Заполненные капилляры помещают в объект микрометра, фиксируют зажимами и наблюдают под микроскопом с объективом 20. Измеряют с помощью секундомера время пробега клеток в капиллярах между двумя фиксированными метками шкалы объект микрометра в поле зрения микроскопа.
Для увеличения точности и воспроизводимости показаний измерения проводят на 10 клетках микроводоросли, усредняя полученные результаты.
При визуальном наблюдении движения клеток под микроскопом определяют среднее время прохождения клетками E.gracilis фиксированного расстояния (0,5 мм). В варианте с цифровой камерой регистрируют треки движения микроорганизмов и определяют пути, пройденные клетками, по шкале объект микрометра за фиксированный интервал времени.
Абсолютное значение скорости движения клеток микроводоросли рассчитывают из следующего соотношения [15]:
, (32)
где l - путь пробега, мм;
t - время пробега клеток между фиксированными метками, с.
Среднее значение скорости находят по [15] формуле 33:
, (33)
где n - число наблюдаем клеток микроводоросли.
Среднеквадратичную ошибку среднего определяют по следующей формуле [15]:
, (34)
2.2.3 Методы определения жизнеспособности клеток
Для анализа жизнедеятельности микроорганизмов используются термограммы. Различают дифференциальную и интегральную термограммы.
Под дифференциальной термограммой понимают зависимость мощности тепловыделении образца от времени наблюдения.
Интегральная термограмма отражает общее количество тепла, выделенного к определенному моменту, как функцию времени. Микрокалориметр непосредственно регистрирует дифференциальную термограмму, и затем рассчитывается интегральная термограмма.
Тепловыделение может быть обусловлено физико-химическими, биохимическими, микробиологическими процессами. В последнем случае термограмма отражает энергетический обмен микроорганизмов с окружающей средой в процессе жизненного цикла популяции клеток.
Так как различные процессы жизнедеятельности микроорганизмов сопровождаются выделением тепла, то мерой физиологической активности клеток с энергетической точки зрения может являться скорость их тепловыделения, которая отражает как интенсивность протекающих метаболических реакций, так и скорость размножения клеток.
В основе биокалориметрии, как и других косвенных инструментальных методов анализа живых организмов, лежит зависимость величины регистрируемого сигнала от численности и физиологической активности клеток в анализируемом объекте.
Для характеристики тепловыделения отдельного вида микроорганизмов может быть использована величина удельной теплопродукции клеток [16]:
, (35)
где qi - мощность тепловыделения клеток i-го вида;
Ni - количество клеток i-го вида [16].
Перед тем как приступить к работе с прибором, его необходимо прогреть в течение 1ч. После чего установив параметры, необходимые для измерения можно приступить к измерениям. К прибору прилагаются две микрокюветы объемом 1 мл, которые заполняются раствором сравнения (дистиллированная вода) и суспензией, изучаемых микроорганизмов. Суспензию микроорганизмов готовят следующим образом: к полученной чистой культуре приливают физраствор. Медленно, круговыми движениями перемешиваем. Затем отбираем 0,5 мл и переливаем в микрокувету на 1 мл. В эту же кювету помещаем 0,5 мл среды Лозино-Лозинского. В другую кювету помещаем дистиллированную воду. Заполненные микрокюветы помещают в микрокалориметр и проводят измерения.
2.3 Результаты и их обсуждение
2.3.1 Описание выделения и идентификации микроводорослей
Выделение микроводорослей производилось из пробы сточной воды методам Пастера. Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме. Исследуемый материал последовательно разводят в жидкой питательной среде: берут ряд пробирок с физиологическим раствором, исследуемый материал вносят в первую пробирку, перемешивают, из неё переносят во вторую и т.д. Проводили 5 разведений. В 4 разведении содержалась одна клетка микроводоросли Euglena gracilis. В качестве питательной среды использовали среду Лозино-Лозинского. Среду готовили следующим образом. К 1 дм3 дистилированной воды добавляли 0,1 г NaCl, 0,01 г KCl, 0.01 г MgSO4, 0.01 г CaCl2, 0.02 г NaHCO3. Доводили рН среды до 7,0. Среду можно хранить в холодильнике при 8С в течение недели. Выращивали микроводоросли при температуре 20С и естественном освещении.
Зеленые формы выделенных организмов становятся беiветными при выращивании в темноте, но снова приобретают зеленую окраску на свету.
2.3.2 Изучение влияния антибиотиков на подвижность микроводорослей
В качестве тест-объекта в работе использовали клетки микроводоросли Euglena gracilis из коллекции кафедры биотехнологии и биоэкологии БГТУ. Культивирование клеток микроводоросли осуществ