Зависимость нейротропных эффектов салицилатов кобальта и цинка от кальция
Курсовой проект - Химия
Другие курсовые по предмету Химия
лекс ганглиев фиксировали за нервы вольфрамовыми крючочками к дну камеры. Её объём составлял 0,5 мл, скорость смены растворов - 20-25 мл/час. Через камеру постоянно пропускали проток раствора Рингера следующего ионного состава (в мМ/л): NaCl - 100, CaCl2 - 10, KCl - 4, MgCl2 - 4, трис-HCl - 10 (pH 7,5).
Затем приступали к микропрепарированию - снятию соединительнотканной оболочки с ганглиев. Наружные соединительнотканные оболочки ганглиев удалялись механическим путём, без применения обработки ферментом, поскольку фермент изменяет активность различных мембранных структур и функциональное состояние клетки. Под бинокулярным микроскопом МБС-1 (пучок света подавался оптоволоконным осветителем ОВС-1 сбоку, под углом 45o) специальным микрокрючком захватывали соединительнотканные оболочки ганглия и срезали их глазными ножницами для вскрытия сенехии, после чего отчётливо были видны тела нейронов округлой формы.
При проведении экспериментов соблюдался температурный режим +20…+22С.
2.2 Метод внутриклеточного отведения биопотенциалов
После осуществления подготовки к эксперименту производили прокол мембраны выбранного нейрона электродом, о введении которого судили по изображению луча на программной панели монитора компьютера.
Исследование активности нейронов производилось с помощью жидкостных микроэлектродов, заполненных 2,5 М раствором KCl, сопротивлением не менее 10 МОм. Микроэлектроды изготавливали из стеклянных трубочек (стекло марки Пирекс) с внутренним капилляром на полуавтомате для вытягивания микроэлектродов МЭ-4. Диаметр трубочек составлял 1,4-1,5 мм.
В нейрон вводили один микроэлектрод, который был связан с входным предусилителем, соединенным с усилителем нейронной активности УФУ-БКН. За электрической активностью нейронов наблюдали с монитора компьютера. В качестве индифферентного электрода использовали электрод от стимулятора ЭСЛ-2 с диодным мостиком 1 Ом - 1 кОм. Через индифферентный электрод подавался калибровочный сигнал с амплитудой 75 мВ и длительностью 100 мс. Микроэлектроды были связаны с электрической частью установки через солевой мостик и Ag-AgCl электрод.
2.3 Приготовление растворов тестируемых веществ
Тестируемыми веществами служили АТФ и соли салициловой кислоты - СК и СЦ.
СК и СЦ - были синтезированы на кафедре неорганической химии Таврического национального университета им.В.И. Вернадского. Как свидетельствовали данные элементного анализа, химическая чистота этих соединений составляла не менее 95 %. В качестве источника АТФ использовался 1-% раствор аденозинтрифосфата натрия ("Здоровье народа", Украина).
Индивидуальные растворы СК и СЦ, а также их комбинации с хлоридом кадмия или хлоридом бария, разводили раствором Рингера для холоднокровных того же состава, что и раствор подаваемый в экспериментальную камеру. Разведение осуществляли таким образом, чтобы концентрация каждого тестируемого вещества в растворе составляла 0,5*10-3 М. Выбор этой концентрации обусловлен тем, что она принадлежит к диапазону наиболее выраженного нейротропного действия СК и СЦ [16, 17].
2.4 Программа эксперимента и внеклеточная аппликация веществ
Эксперименты проводились по следующей программе:
) Поиск фоновоактивного нейрона.
После анатомирования производили прокол мембраны выбранного нейрона, о попадании электрода в клетку судили по показаниям луча на экране монитора.
) Проверка временной устойчивости нейрона, его работоспособности.
Исследование начинали в том случае, если электрофизиологические характеристики нейрона оставались стабильными на протяжении 10 - 15 мин. Соблюдение данного условия необходимо для более четкого определения принадлежности клетки к определенному идентифицированному нейрону.
) Регистрация и запись фоновой активности нейрона в течение 1 минуты.
) Контрольный эксперимент: регистрация и запись нейронной активности при аппликации индивидуальных 0,5*10-3 М растворов солей салициловой кислоты (СК или СЦ) - 4 мин.
) Непосредственно эксперимент: регистрация и запись биопотенциалов нейрона при экспозиции комбинированных растворов СК+АТФ или СЦ+АТФ - 4 мин.
Количество однократно выводимых из пипеток растворов тестируемых веществ составляло 1 мл, что обеспечивало полную замену раствора Рингера в экспериментальной камере на тестируемый раствор заданной концентрации.
2.5 Регистрация данных и обработка результатов
Сигнал с выхода усилителя тока поступал на каскад усиления с измененным коэффициентом передачи (1-100), а далее - на однокаскадный активный фильтр низких частот с программируемой частотой среза (0.5; 1; 2 и 3 кГц). С выхода фильтра сигнал поступал на аналогово-цифровой преобразователь (АЦП), который через интерфейс прямого доступа был подключен к памяти персональной ЭВМ. Интерфейс прямого доступа к памяти управлялся с терминала компьютера. Режим функционирования каналов регистрации токов, частота, амплитуда и другие параметры контролировались компьютером.
Программное обеспечение "Action Potential", необходимое для регистрации и записи электрической активности нейронов на персональном компьютере, разработано в нашей лаборатории при помощи Sybase Watcom C++ v11.0 для операционной системы Windows (95, 98 2000 или ХР) [А. с.].
Распределение экспериментальных данных сравнивались с нормальным по критерию Колмогорова-Смирнова. Поскольку весь массив полученных данных характеризовался ненормальным ?/p>