Вакцинное производство при лептоспирозе
Курсовой проект - Сельское хозяйство
Другие курсовые по предмету Сельское хозяйство
клеток (70-100 млн. м. к. /см3); нестандартна при изготовлении; процесс ее производства в промышленных объемах в стеклянных баллонах трудоемок.
По мнению специалистов ДП Витебская биофабрика им. Я.Р. Коваленко" далеко до конца не исчерпан ростовой потенциал сывороточных сред. Под руководством главного технолога биофабрики, кандидата ветеринарных наук Зайцева В.В. разработан целый ряд новых рецептур питательных сред на основе сывороточной среды. Сущность их не раскрывается, так как она является ноу-хау.
Модифицированные питательные сывороточные среды обеспечивают накопление лептоспир до 500-800 млн. м. к. /см3. При этом важно отметить, что среда пригодная для длительного культивирования и в отличии от аналогичных сред и твин-альбуминой среды Рассела не только не снижает антигенной активности, но и, напротив, повышает ее в 1,3-2,0 раза.
Сотрудниками биофабрики также предложена среда на основе лизированной крови овец и разработан метод очистки сыворотки от специфических антител, исключив таким образом ее выбраковку. Кроме того, для культивирования лептоспир ими приготовлена среда на основе гидролизатов белков казеина. В качестве белковой основы среда содержит гидролизат белков казеина и дополнительно - биостимулятор при следующем соотношении компонентов (об. %):
гидролизат казеина - 10
биостимулятор - 5-10
фосфатно-буферный
раствор - 10
вода очищенная - остальное.
Проведенные экспериментальные исследования показали, что жидкая питательная среда, содержащая гидролизат казеина и биостимулятор, обеспечивает высокое накопление лептоспир (80-120 млн. м. к. /см3) и может быть использована для однократного производственного посева лептоспир без снижения антигенной активности. Способ приготовления данной среды прост и экономичен, но рецептуру приготовления необходимо усовершенствовать. Способ приготовления среды на основе гидролизата белков казеина признан изобретением и защищен патентом (Патент РБ № 951024, С 12 N 1/20, 1999).
Оптимизацию состава питательных сред осуществляли с помощью математической теории планирования многофакторных экспериментов, статистической обработки результатов и регрессивного анализа.
Сравнительную оценку экспериментальных и контрольных образцов питательных сред проводили в соответствии с методическими рекомендациями.
Питательную потребность в процессе культивирования лептоспир изучали, используя спектрометрию инфракрасного (ИК) и комбинированного рассеивания (КР) и хроматомасс-спектроскопию.
В процессе культивирования лептоспир определяли морфологию, жизнеспособность, антигенные свойства, продолжительность лаг-периода (время от момента посева до фазы нарастания скорости роста популяции), длительность экспоненциальной фазы (время от фазы нарастания скорости роста популяции до фазы замедления роста), максимальную удельную скорость роста (прирост биомассы на единицу времени), время генерации (удвоение концентрации лептоспир).
Получение матровой расплодки
Чистые с хорошим накоплением культуры лептоспир, полученные во флаконах, высевают по 700-800 см3 в стеклянные бутыли вместимостью 15-18 дм3, содержащие 8-12 дм3 среды. Бутыли с засеянной питательной средой выдерживают в термостате при температуре 27-280С в течение 5-10 суток.
Чистые культуры, имеющие накопление биомассы не менее 80 млн. м. к. /см3, типичную морфологию, используют как матровую расплодку для засева производственной партии питательных сред.
Определение накопления лептоспир производят в счетной камере Петрова-Хаусера или Тома по прилагаемой к ним методике. При отсутствии счетной камеры концентрацию лептоспир в культуре определяют следующим методом. Испытуемую культуру разводят питательной средой 1: 1 (к 1 см3 культуры добавляют 1 см3 среды). На предметное стекло наносят микропипеткой каплю культуры (0,02 см3) и накрывают стандартным покровным стеклом. Капля должна заполнять все пространство под покровным стеклом, но не выступать из-под него. Учет количества лептоспир проводят под микроскопом с моно - или бинокулярной насадкой, используя объектив 40 и окуляр 7-10.
Подсчитывают количество лептоспир в 15 полях зрения по диагоналям препарата, после чего определяют среднее содержание в одном поле зрения с учетом сделанного разведения.
Чистоту роста определяют путем просмотра культур под микроскопом в темном поле и высева 0,3-0,5 см3 культуры на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом по две пробирки с каждой средой.
При выдерживании посевов при температуре 36-380С в термостате в течение 5 суток не должно быть роста микрофлоры, так как лептоспиры на этих средах не растут.
Матровую расплодку поддерживают и хранят в отдельном помещении, закрепив за каждым штаммом отдельный стелаж.
Приготовление производственных расплодок лептоспир
Матровую расплодку засевают в бутыли вместимостью 16 литров, содержащие 10-12 дм3 питательной среды, из расчета 10% к среде (1,0-1,2 дм3 культуры на 10-12 дм3 питательной среды). Культивируют лептоспиры в течение 5-10 суток при температуре 26-280С без доступа света.
Контроль за ростом лептоспир осуществляют путем просмотра бутылей в проходящем свете и проб культуры из бутылей в темном поле микроскопа при увеличении 40 х 7-10.
Кроме того, в процессе выращивания культуру выборочно от 10% бутылей проверяют на стерильность. Культуры, в которых при просмотре в проходящем свете, или микроскопии, или при проверке на стерильность выявлено наличие посторонней микроф