Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе
Информация - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие материалы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
еденными и разведенными в 5 и 2 раза.
Пробы сыворотки крови получали от новорожденных телят до приема молозива во всех случаях использовали не разведенными.
Подготовленные пробы крови, молозива, и молока вносили в лунки геля с антисывороткой с помощью пастеровской пипетки. При этом лунку заполняли полностью, не переливая пробы за ее пределы.
Параллельно с опытными пробами на каждом стекле ставили контроль разливали в лунки стандартный препарат определенного иммуноглобулина. При этом его разводили буферным раствором с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора препарата содержалось 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мл белка. Таким образом, на каждом стекле получалось 6 лунок с контрольной пробой препарата.
После заполнения лунок, стекла помешали в эксикатор с водой и выдерживали при комнатной температуре, при определении содержания иммуноглобулинов G и А в течение 24 ч, а при определении иммуноглобулина М 48 ч.
По окончании сроков инкубации стекла извлекали из эксикатора и измеряли диаметр кольца преципитата вокруг лунок с помощью линейки Беринг-Верке, после окрашивания агаровых пластин. С этой целью стекла с агаром погружали на двое суток в буфер. В течение этого срока буфер трижды заменяли новой порцией. После отмывания от не участвующих в реакции веществ, пластинки агара высушивали при комнатной температуре под фильтровальной бумагой. Затем пластинки (без фильтровальной бумаги) помещали в 0,1 %-ный раствор амидо-черного 10В на 3 ч, промывали трехкратно раствором уксусной кислоты и высушивали.
Для приготовления 0,1 %-ного раствора амидо-черного 10В, брали 1 г краски, растворяли в 100 мл ледяной уксусной кислоты (СН3СООН), после чего объем раствора доводили дистиллированной водой до 1 л. Раствор хранили в темной посуде при комнатной температуре. Раствор уксусной кислоты для промывания: брали 70 мл ледяной уксусной кислоты и доводили объем дистиллированной водой до 1 л.
Для расчета содержания иммуноглобулинов в испытываемых пробах строили калибровочную кривую на полулогарифмической бумаге: на оси ординат откладывали концентрацию белка в пробах стандарта, по оси абiисс диаметр кольца преципитации. Калибровочную кривую строили отдельно по каждому иммуноглобулину определенного класса.
Количество иммуноглобулина в испытуемой пробе определяли путем сравнения диаметра кольца преципитации вокруг ее лунки с калибровочной кривой [G. Mancini, A. O. Carbonara and J.F. Heremans, 1965; У. Дж. Герберт, 1974; В. М. Чекишев, 1977; П. А. Емельяненко, О. И. Грызлова, Г. Н. Печникова и М. Н. Тулупова, 1980; P. В. Петров, 1987; Н. С. Жосан, 1989; Н. В. Матузенко, Е. В. Андреев, А. И. Собко, 1990].
2.1.13. Экспресс-метод для определения содержания иммунных глобулинов. Кровь получали от телят из яремной вены до приема молозива и через 24 ч после рождения. Сначала ее выдерживали около часа в (30-35 С), а затем в холодильнике 10-12 ч. После чего отделяли сыворотку в отдельные пробирки.
Раствор цинк сульфата (208 мг/л ZnSO47H2O) готовили в мерной колбе на дистиллированной воде, которую выдерживали 4-5 дней и затем кипятили в течение 10-15 мин iелью растворения диоксида углерода.
Для приготовления стандарта мутности брали 3 мл раствора хлорида бария (BaCl22H2O) в 100 мл дистиллированной воды, вносили в мерную колбу на 100 мл и доводили до метки 0,2N раствором серной кислоты. Полученный раствор соответствует 20 ед. цинк сульфатному тесту [A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970].
Калибровочную таблицу для калориметрического определения содержания иммуноглобулинов на ФЭК-56М получали путем разведения стандарта мутности.
Для определения иммунных глобулинов подбирали пробирки одинакового диаметра и наливали в каждую по 6 мл цинк сульфатного раствора, а в контрольною пробирку 6 мл дистиллированной воды. Во все опытные пробирки (по количеству образцов) и в контрольную добавляли по 0,1 мл исследуемой сыворотки и выдерживали при комнатной температуре (20 С) 60 мин. После экспозиции пробирки взбалтывали, чтобы обеспечить одинаковое перераспределение осадка и помещали в фотоэлектроколориметр, который предварительно устанавливали на 0 по дистиллированной воде. Измерение проводили на ФЭК-56М, ври длине волны 4005 нм (синий светофильтр) в кюветах толщиной слоя 10 мм. Показание прибора ФЭК-56М определяли образцах сыворотки через контрольную пробирку умножением различия на фактор 10. 20 единиц цинк сульфатного теста помутнения были эквивалентны соответственно 20-30 мг/мл содержания колостральных иммунных глобулинов в сыворотке крови теленка [A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970].
2.1.14. Определение уровня пассивной защиты у новорожденных телят. Метод основан на том, что белки сыворотки крови могут преципитироваться различными солями, включая сульфит натрия (Na2SO3). Этот феномен зависит от концентрации соли и молекулярной характеристики белков. Готовили 14-, 16-, и 18 %-ный растворы Na2SO3, используя для этих целей безводный реактив. Соответственно 14, 16 и 18 г его растворяли в 100 мл дистиллированной воды. Кроме безводного сульфита натрия использовали Na2SO37Н2О, при этом количество его для приготовления соответствующих концентраций увеличивали вдвое.
В пробирки вносили по 1,9 мл раствора сульфита натрия каждой концентрации и добавляли по 0,1 мл испытуемой сыворотки. Пробирки тщательно встряхивали и выдерживали 1 ч при комнатной температуре. Реакцию считали отрицательной, если преципитат не образуется и положительной, если видны хлопья преципитированного белка или заметно даже небольшое его присутствие, в данном случае уровень иммуноглобу