Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе
Информация - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие материалы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
закрывали ватно-марлевыми пробками. Оптическую плотность среды определяли на фотоэлектроколориметре ФЭК-М, используя зеленый светофильтр. После этого кюветы ставили в термостат при температуре 37 С. Повторно определяли оптическую плотность содержимого кювет через 3, 5, 7, 9, 12 и 24 ч. Установку 0 на ФЭК-е производили с помощью кюветы, заполненной дистиллированной водой. Оценку бактерицидной активности сыворотки крови проводили по формуле:
А=100- 100,
Где: А бактерицидная активность (в %);
Д оптическая плотность;
Т время экспозиции кювет в термостате (в часах).
Затем вычисляли среднюю напряженность бактерицидной активности (НБА) по формуле:
Средняя НБА = ,
Где: НБА средняя напряженность бактерицидной активности молозивной сыворотки;
А1, А2, А3.....Аn бактерицидная активность сыворотки молозива через 3, 5, 7, 9, 12 и 24ч (в %);
Т1, Т2, Т3....... Тn продолжительность термостатирования (в часах).
2.1.11. Постановка опсонофагоцитарной реакции. При постановке опсонофагоцитарной реакции руководствовались методикой, описанной В. Я. Мозгис (1982). Для приготовления антигена культуру Е. coli выдерживали в термостате при температуре 37 С в течение 18-24 ч в МПБ, а затем на МПА в течение 24 ч. Проверяли на чистоту и смывали стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. По оптическому стандарту доводили концентрацию до 2-х млрд. микробных тел в 1 мл. Приготовленную взвесь нагревали в водяной бане при 70 С в течение 30 мин.
Для опсонофагоцитарной реакции применяли только суточную агаровую культуру Е. coli.
Исследования проводили в следующей последовательности. В пронумерованные стерильные пробирки наливали до 0,5 мл 2 % прокипяченного и охлажденного раствора лимоннокислого натрия, 1 мл крови от исследуемых телят и тщательно смешивали, сюда же вносили по 0,5 мл антигена. После осторожного перемешивания пробирки помещали в термостат при 38 С на 3 мин, предварительно погрузив их на 2-3 мин в водяную баню с температурой 38 С. Затем пробирки из термостата извлекали, готовили мазки, сушили на воздухе, нумеровали, фиксировали в метиловом спирте в течение 5 мин и окрашивали по Романовскому-Гимза.
Для приготовления рабочего раствора краски, дистиллированную воду усредняли фосфатными буферами: 1. Двухосновной фосфат натрия (Na2HPO412H2O) 17,814 г на 1 л (рН 8,302). 2. Одноосновной фосфат калия (KH2PO4) 13,638 г на 1 л (рН 4,529). Если к литру дистиллированной воды прибааляли по 5 см3 того и другого раствора, то рН такой воды был равен 6,813.
Краску готовили ex tempore из расчета 1,5 капли краски на 1 мл усредненной воды с рН 6,813. Мазки окрашивали в течение 45 мин, промывали водопроводной водой и высушивали на воздухе. Окрашенные мазки исследовали под иммерсионной системой микроскопа и окуляра 7.
Подсчет фагоцитированных микробов производили в 100 нейтрофилах. На основе подсчета определяли фагоцитарную интенсивность (среднее число поглощенных микробов одним нейтрофилом) и фагоцитарную активность (процент фагоцитирующих нейтрофилов). С кровью подопытных животных поставили 450 реакций.
2.1.12. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови, молозиве и молоке крупного рогатого скота.
Предварительно готовили фосфатный буфер 0,03М, рН 3,0. С этой целью 10,74 г натрия фосфорнокислого двух замещенного (Na2HPO412H2O) и 5,84 г хлорида натрия помещали в мерную колбу, растворяли в дистиллированной воде и доводили объем до 1 л. Подобным образом готовили раствор из 4,08 г однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2PO4) и 5,84 г хлорида натрия.
Растворы под контролем потенциометра смешивали в соотношении обеспечивающим рН буфера 8,0.
Пробы сывороток крови получали путем выдержки взятой крови из яремной вены животных 20-30 мин при 37 С в термостате. После отделения образовавшегося сгустка от стенок пробирок стеклянной палочкой, кровь помещали на 16-20 ч в холодильник. На следующий день сыворотку отсасывали в стерильную центрифужную пробирку, центрифугировали 15-20 мин при 3000 об/мин.
Пробы молозива и молока после взятия выдерживали 16-20 ч при 4 С и центрифугировали в течение 1 ч при 6000 об/мин. Затем снимали верхний слой жира, отсасывали надосадочную жидкость, которую и использовали для определения.
Пластинки из 3 %-ного агара Дифко, смешанного с антисывороткой готовили следующим образом: 360 мг агара помещали в колбу, заливали 12 мл буфера и прибавляли 0,25 мл 1 %-ного раствора мертиолата. Колбу помещали в баню с холодной водой, которую затем нагревали до кипения и выдерживали смесь до полного расплавления агара.
После расплавления гель охлаждали до 56 С и к нему приливали равный объем антисыворотки в рабочем разведении и снова нагревали до температуры 56 С. Смесь тщательно перемешивали и выливали на стекло, помещенное на столике с уровнем в строго горизонтальном положении.
После застывания геля в нем делали лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм друг от друга.
При определении содержания иммуноглобулина G пробы сыворотки крови разводили буфером рН 8,0 в 20 и 30 раз. Пробы молозива первого дня лактации в 100, 50 и 20 раз, пробы молозива последующих дней лактации в 50, 20 и 10 раз, использовали не разведенные и разведенные в 10 раз пробы молока.
При определении содержания иммуноглобулина М пробы сыворотки крови и молозива разводили в 10 и 5 раз, пробы молока использовали не разведенными и разведенными в 5 раз.
При определении содержания иммуноглобулина А пробы сыворотки крови использовали не разведенными, пробы молозива и молока не разв