Книги по разным темам Pages:     | 1 | 2 | 3 |

Как известно, большинство микроорганизмов, рас­пространенных в природе, к которым относятся ме-тилотрофы, не могут служить хорошими продуцен­тами ароматических аминокислот, вследствие нали­чия эффективных механизмов регуляции биосинтеза этих соединений в микробной клетке, хотя эта спо­собность появляется у ряда их мутантных форм [15 — 17]. Активными микробными продуцентами L-фснилаланина являются, как правило, мутанты, у которых снят негативный контроль со стороны таких ключевых ферментов биосинтеза этой аминокисл­оты, как префенатдегидратаза (ПД) и дезоксиара-биногептулозофосфатсинтстаза (ДАГФ-синтетаза) [18, 19]. Определенный интерес в связи с этим представляет исследование способности продуциро­вать L-фенилаланин лейцинзависимым метилотроф-ным мутантом В. methylicum, достаточно удобным, хотя и малоизученным объектом для биотехнологи­ческого применения. Поэтому начальный этап биохи­мических исследований В, methylicum был связан с получением ауксотрофных мутантов, для которых в большинстве случаях характерны ограниченный спектр мутантных фенотипов и кроме того довольно высо­кий уровень реверсий [20 — 23]. Исходный лейцин-зависимый штамм В. methylicum, продуцент L-фени­лаланина, был отобран в лаборатории генетики ме-тилотрофов НИИ генетики и селекции промышлен­ных микроорганизмов на предыдущем этапе работы после обработки В. methylicum нитрозогуанидином по устойчивости к аналогу фенилаланина мета-фторфенилаланину (50мкг/мл.). Выделенные таким образом аналогорезистентные мутанты конвертиро­вали метанол и накапливали при этом фенилаланин

в ферментационной среде. Сравнительные анализы аминокислоты методом тонкослойной хроматографии и масс-спектрометрии показали, что фенилаланин, секретиру-емый В. mcthylicum, полностью идентичен коммер­ческому L-фенилаланину.

Мы изучали влияние степени замещенности дей­терием низкомолекулярных субстратов воды и мета­нола в составе питательных сред на рост полученного ауксотрофа, величину лаг-фазы и времени клеточ­ной генерации (см. таблицу), а также секрецию дейтериймеченного фенилаланина. Продолжитель­ность лаг-фазы, время генерации и максимальная секреция фенилаланина В. melhylicum в условиях изотопных экспериментов (см. таблицу, опыт 2, 4, 6, 8, 10) представлены на гистограмме (рис. 1).

Секреция

, г/л

Рис. 1. Характеристики бактериального роста В. methylicutn {выход биомассы, время генерации и максимальная секреция фенилала­нина) на средах с изотопным составом, соответствующим номерам экспериментов 2, 4, 6, 8, 10 в таблице

Как видно из представленных данных, в отсутст­вие дейтериймеченных субстратов при росте исходной бактерии на протонированной среде продолжитель­ность лаг-фазы не превышала 24 ч (см. таблицу, опыт 1). С увеличением содержания тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64 ч на средах с 98 % D2O и 2 % CD3OD по объему (см. таблицу, опыт 10). Если замена метанола на его дейтерированный аналог не вызывала существенного ингибирования роста бактерий и не сказывалась на выходе микробной биомассы, то на средах с высоким содер­жанием оксида дейтерия микробный рост был замет­но подавлен. Вследствие этого в экспериментах, где оксид дейтерия преобладал в среде (см. таблицу, опыт 9, 10), выход биомассы был значительно ниже, чем в контрольных экспериментах и в тех случаях, когда использовали простую воду и дейтеро-метанол (см. таблицу, опыт 2).

Как видно, длительность времени генерации бактериальной культуры с уве­личением изотопного насыщения среды дейтерием увеличивается. Из данных таблицы видно, что про­должительность лаг-фазы и время клеточной гене­рации бактерии при переходе со стандартной на дейтерированные среды находятся в определенной корреляции. Так например, в условиях эксперимента 10 продол­жительность лаг-фазы увеличивается в 2,6 раза, а время генерации возрастает в 2,2 раза.

С целью увеличения эффективности изотопного мечения клеточных БАС и аминокислот и интенси­фикации роста метилотрофа на полностью дейтерированных средах мы адаптировали полученный му­тант В. methylicum к максимальному содержанию дейтерия в среде культивирования. Для этого были проведены пять серий адаптационных пассажей на агаризованных средах (с 2 % СD3ОО по объему) при ступенчатом увеличении концентрации оксида дей­терия в них (см. таблицу). Последовательно отбира­ли наиболее продуктивные по уровню накопления дейтерированной биомассы клоны В. methylicum и пересевали их на среды с большей степенью дейтерирования, вплоть до полной замены воды и мета­нола на их дейтерированные аналоги (выживаемость на полностью дейтерированных средах не более 40 %). Полученный в результате ступенчатого отбора шта­мм В. methylicum, адаптированный к дейтерию, пе­реносили затем с максимально насыщенных дейте­рием агаризованных сред на жидкие среды М9, приго­товленные исключительно из 98 % D2O (99,9 % D) и содержащие 2 % СОзОD, и культивировали, как описано в эксперименте.

Динамика роста бактерии В. mеthylicum, адаптированного к высокому содержанию дейтерия в среде, и способ­ность секретировать L-фенилаланин в условиях мак­симально насыщенных дейтерием сред представлены на рис. 2.

дО время, ч

Секреция

Рис. 2. Динамика роста В. methylicum (la, 10'а, 10d) и секреция фенилаланина (16, 10'б, 10б) на средах с изотопным составом, соответствующим номерам эксперимента в таблице: I а,б — исходный метилотроф на стандартной среде М9; 10'а,б — адап­тированный к высокому содержанию дейтерия В. melhylicum на полностью дейтерированной среде; 10 а,б — неадаптированный метилотроф на полностью дейтерированной среде

Выход биомассы, время генерации и максималь­ная секреции фенилаланина исходным мутантом (10) и мутантом, адаптированным к высокому содер­жанию дейтерия в среде (10'), на средах, максималь­но насыщенных дейтерием, приведены в гистограм­ме на рис. 3 относительно контрольного (У). Срав­нивали ростовые данные адаптированного к дейте­рию метилотрофа и секрецию фенилаланина (опыт 10') с исходным В. methylicum на стандартной среде М9 (опыт I) и на полностью (98 % D2О) дейтери­рованных средах с 2 % CD3OD (опыт 10).

Как видно из графиков на рис. 2, степень заме­щенности дейтерием воды и метанола не оказывает

м •

и биомассы, % 0тк0нтролн<го L-Ptic, г/л

Время

Рис. 3. Выход биомассы, время генерации и максимальная сек­реция фенилаланина на средах с изотопным составом, соответст­вующим номеру эксперимента в таблице: 10 — исходный метилотроф; 10' — адаптированный к высокому содержанию дейтерия В. me­thylicum; 1 — исходный метилотроф на стандартной недейтери-рованной среде

значительного влияния на секрецию фенилаланина, в то время как выход микробной биомассы на дей-терированной среде значительно уменьшается. Не­значительное снижение уровня секреции фенилала­нина (до 0,5 г/л) наблюдалось лишь в изотопных экспериментах (см. рис. 2, 10 б), когда использовали исходный метилотроф на средах с максимальным насыщением дейтерием. Уровень накопления микро­бной биомассы адаптированным метилотрофом на полностью дейтерированной среде выше, чем для исходного В. methylicum (см. рис. 2, 10 а), несмотря на двухкратное увеличение продолжительности лаг-фазы (рис. 2, опыт 10' а), в то время как секреция фенилаланина у адаптированного метилотрофа су­щественным образом не отличалась от таковой на недейтерированной среде. В отличие от адаптиро­ванного к дейтерию В. methylicum, рост исходного мутанта на полностью дейтерированной среде с 98%-ной тяжёлой водой сильно ингибируется дейтерием (см. рис. 2, 10 и).

Как видно из рис. 3, время клеточной генерации для адаптированного метилотрофа (2,5 ч) близко к исходному на стандартной среде. Несложный селек­ционный подход позволил получить штамм В. met­hylicum, способный конвертировать дейтеро-метанол на максимально насыщенных дейтерием средах в клеточные БАС и секретирусмый L-фенилаланин. При этом выход фенилаланина у адаптированного мутанта не сократился (см. рис. 2). Таким образом, было показано, что некоторые виды метилотрофных бактерий, например, факультативный метилотроф В. methylicum, в принципе могут быть адаптированы к высокому содержанию дейтерия в среде без потери ростовых и биосинтетических способностей бактери­альной культуры.

Механизм биосинтеза L-фенилаланина В. methy­licum и роль лейцина в этом процессе не объяснены окончательно.

Что же касается самого фенилаланина, то он, как известно, синтезируется в клетках микроорганизмов и, в частности, в коринебактериях из своего предше­ственника — префеновой кислоты, которая через стадию образования фенилпирувата превращается в фенилаланин под действием клеточных трансаминаз [24 — 26].

Продолжая обсуждать механизм секреции фени­лаланина этим метилотрофом следует отмстить, что общей особенностью сскретируемой целевой амино­кислоты было значительное увеличение ее проду­кции на ранней фазе экспоненциального роста В. mehtylicum, когда выход микробной биомассы был незначителен (см. рис. 2). Затем во многих экспери­ментах наблюдалось, как правило, ингибирование биосинтеза фенилаланина на поздней фазе экспо­ненциального роста и снижение его концентрации в среде. Как показали микроскопические наблюдения за растущей популяцией микроорганизмов, подо­бный характер динамики секреции фенилаланина не коррелирует с качественными изменениями росто­вых характеристик культуры на различных стадиях роста, что служит подтверждением морфологической однородности микробной популяции. По-видимому, накопленный в процессе роста фенилаланин ингиби-ровал ферменты собственного пути биосинтеза. Кро­ме того, как показано еще на других микробных продуцентах L-фенилаланина! при культивирова­нии микроорганизмов без рН-статирования не иск­лючено обратное превращение экзогенного фенила­ланина в интермедиаторные соединения его биосин­теза [25, 26]. Кроме основной сскретируемой ами­нокислоты в среде, как правило, присутствуют сле­довые количества других аминокислот (аланин, ва-лин, а также тирозин и триптофан) и других мета­болитов, четко детектируемых масс-спектрометри-чсским анализом [3].

Степень биосинтетического обогащения секрети-руемого L-фенилаланина была определена масс-спе­ктрометрическим анализом метиловых эфиров N-дансильных производных аминокислот методом эле­ктронного удара. Согласно сравнительным данным масс-спектрометрического анализа производных на-тивного и дейтерироваиного фенилаланина со сред разного уровня дейтерирования (см. таблицу), сте­пень биосинтетического включения дейтерия в мо­лекулу фенилаланина коррелирует с концентрацией дейтерия в среде. Так например, в масс-спектре дейтерированного производного фенилаланина (мо­лекулярная масса недейтерированного соединения 412), полученного из В. methylicum в условиях мак­симального насыщения среды дейтерием (см. табли­цу, опыт 10), четко детектируется высокоинтенсив­ный пик молекулярного иона с m/z 420 (М+ + 8) и менее интенсивный пик с примесью m/z 419 (М.++ 7). Предварительные данные свидетельствуют о высо­кой степени включения дейтерия в молекулу фени­лаланина в условиях полной замены воды и метано­ла на D2О и СDзOD, что составляет (с учетом точности метода) 7-8 атомов из 8 детектируемых по скелету молекулы. При этом сгкообмсниваемые атомы D(H) амино- и карбоксильной групп не рас­сматриваются.

Основными преимуществами В. methylicum, адап­тированного к максимальному содержанию дейтерия в среде и способного конвертировать дейтеро-мета­нол для получения униформно дсйтерированных аминокислот и белка (в отличие от некоторых тра­диционных способов с использованием других мик­робных продуцентов [27, 28] и микроводорослей [29]) являются хорошие ростовые и биосинтетиче­ские способности этого метилотрофа на максимально дейтерированных средах.

При помощи адаптированного штамма В. met­hylicum можно достаточно быстро наработать в ла-

бораторных условиях граммовые количества уни­формно меченного дейтерием L-фенилаланина. Та­ким образом, использование в прикладных целях полученного в настоящей работе мутанта В. met­hylicum, адаптированного к полностью дейтериро-ванным средам, содержащим тяжёлую воду и дейтеро-метанол и, в частности, для биосинтетическо­го получения фенилаланина разной степени обогащенности дейтерием {вплоть до полной замены всех атомов водорода на дейтерий) является весьма эффективным,

В заключение следует отметить, что более высо­кая эффективность изотопного мечения клеточных БАС может быть обеспечена путем полной замены протонированных компонентов среды на их дейтери-рованные аналоги, а также используя лейцин, уни­формно меченный дейтерием, который в принципе можно получать из гидролизатов тотального белка биомассы этого метилотрофа. Анализ биосинтетиче­ского включения дейтерия в аминокислоты тоталь­ного белка биомассы будет опубликован отдельно.

Авторы выражают благодарность ст. н. с. ВНИЦ молекулярной диагностики О. С. РешетовоЙ за уча­стие в получении масс-спектров изучаемых образцов производных аминокислот.

ИТЕРАТУРА

1. Романовская В. А.,
2. Мохамед эль Сайд II Микробиология. —

1986. — Т. 48. — № 2. — С. 97 — 107.

Pages:     | 1 | 2 | 3 |    Книги по разным темам