Книги по разным темам Pages:     | 1 | 2 | 3 |

УДК 579.871.08+577.112.385.4.08

О. В. МОСИН, Е. Н. КАРНАУХОВА, А. Б. ПШЕНИЧНИКОВА, Д. А. СКЛАДНЕЕ*. О. Л. АКИМОВА

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова, 117571

НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, 113545

Биосинтетическое получение деитериймеченного L-фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium rnethylicum

На примере L-фенилаланинсекретирующего мутанта Brevibacterium methylicum продолжены исс­едования по использованию метилотрофных бактерий для биосинтетического получения амино­кислот, меченных стабильными изотопами. Представлены данные по адаптации L-фенилаланин­секретирующего метилотрофа В, methylicum к максимальной концентрации дейтерия в среде: 98% D2O и 2% CD3OD по объему. Разработанный метод позволяет получать изотопно-меченный L-фенилаланин разной степени изотопного обогащения, вплоть до полной замены атомов водорода на дейтерий, что подтверждено данными масс-спектрометрического анализа. Контроль биосинте­тического включения дейтерия в секретируемые аминокислоты был осуществлен с использованием производных типа метиловых эфиров N-дансил-аминокислот и последующей масс-спектрометрией электронного удара.

Метилотрофные бактерии — группа микроорга­низмов, способных расти на метаноле и других восстановленных производных углерода, являются весьма притягательными биотехнологическими объ­ектами, возможности практического применения ко­торых реализованы явно недостаточно [1, 2].

Одним из наиболее важных направлений работ с метилотрофными микроорганизмами являются исс­ледования, направленные на поиск или конструиро­вание новых продуцентов аминокислот и других биологически активных соединений. В плане нача­тых исследований по получению аминокислот, ме­ченных стабильными изотопами [3 — 6], практиче­ский интерес представляет использование метилот-рофов, особенно продуцентов аминокислот для пол­учения целевых соединений за счет биоконверсии низкомолекулярных меченых субстратов. Традици­онным подходом при этом остается селекция проду­центов биологически активных соединений (БАС) [7,8].

Безусловно, наиболее целесообразным является использование облигатных метилотрофов, которые способны ассимилировать меченые Ci-субстраты в качестве единственного источника углерода [9]. Как было показано на примере L-лейцинсскретирущего облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum, полная замена в среде метанола на его 13С-аналог практически не сказывается на величине лаг-фазы и уровне накопления биомассы, а степень биосинте­тического изотопного обогащения характеризуется главным образом изотопной чистотой 13Ci-субстра­та [3].

Известно, что исчерпывающее биосинтетическое обогащение дейтерием бактериальных микроорга­низмов при высоких концентрациях изотопа в среде может вызвать ингибирование биосинтеза клеточ­ных протеинов и тем самым замедлить бактериаль­ный рост [10]. В отличие от микроводорослей [11], бактерии весьма чувствительны к высокому содер­жанию дейтерия в среде и, как правило, не способны выдерживать концентрации оксида дейтерия более чем 75 % [4, 12]. В связи с этим разработка способов возможной адаптации метилотрофных микроорга­низмов к максимальному содержанию дейтерия в среде представляется очень актуальной.

Целью данной работы было исследование динами­ки роста микробной биомассы и секреции деитерий­меченного L-фенилаланина лейцинзависимым му-

тантом В. methylicum за счет биоконверсии дейтеро-метанола на средах с тяжелой водой разного уровня дейтерирования.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Бактериальные штаммы. Исследования проводи­ли с факультативным лейцинзависимым (макси­мальная потребность в L-лейцине — 100 мкг/мл) метилотрофом В. methylicum, продуцентом L-фе­нилаланина, полученным из коллекции культур ВК ПМ НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ В 5652).

Исходный штамм поддерживали на агаризованной (2 %-ный агар) среде М9 [13] с метанолом (2 %). Штаммы хранили в водном 70 %-ном растворе глицерина при -10.

Адаптированный к максимальному содержанию дейтерия в среде лейциновый ауксотроф В. met­hylicum был получен в серии пассажей с последова­тельным отбором хорошо растущих клонов на ага-ризованных средах (с 2 % СDзОD по объему), содержащих ступенчатое увеличение концентрации дейтерия (начиная с нсдсйтерированных сред, вплоть до полной замены воды и метанола на их дсйтери-рованные аналоги).

Адаптированный к дейтерию штамм В. methylicum поддерживали на агаризованных средах М9 (см. выше) с максимальным содержанием дсйтеро-ком-понентов.

Для приготовления питательных сред с различным содержанием СОзОО и D2O использовали соли марки х. ч., D2О (99,9 % D) и CD3OD (99,6 % О), получе­нные из Всесоюзного центра Изотоп (Санкт-Пе­тербург, РФ), а также L-лейцин (Reanal, Венг­рия). Для получения производных аминокислот использовали Н-диметиламинонафталин-5-сульфо-хлорид (дансилхлорид) (Sigma, США) и диазометан. Для получения диазометана применяли N-нитрозо-метилмочевину, закупленную у Merck (Германия).

Посевной материал выращивали до ранней фазы экспоненциального роста бактериальной культуры на средах разного уровня дейтерирования, затем вносили в ферментационные среды с соответствую­щим изотопным насыщением D2O и СОзОD (табли­ца) в количестве 5 об. % и культивировали, как описано ниже.

Выращивание посевного материала и фермента­цию проводили на синтетической среде М9 [13] с десятикратным избытком NH4C1 (так как в предва-

Влияние изотопного состава питательной среды на величину лаг-фазы, выход биомассы и время генерации В. methylicum

Номер опыта	Компоненты среды, об. %				аг-фаза, ч	Выход биомассы, % от контрольного	Время генерации, ч
	Н20	D20	CHjOH	CD3OD
1	98	0	2	0	24	100	2,2
2	98	0	0	2	30	92	2,4
3	73,5	24,5	2	0	32	90	2,4
4	73,5	24,5	0	2	35	86	2,6
5	49	49	2	0	40	70	3,0
6	49	49	0	2	44	60	3,2
7	24,5	73,5	2	0	46	56	3,5
8	24,5	73,5	0	2	49	47	3,8
9	0	98	2	0	60	33	4,4
10	0	98	0	2	64	30	4,8

Данные приведены для В. methylicum, не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия.

рительных экспериментах по оптимизации состава питательных сред показано, что такое увеличение концентрации хлористого аммония в среде стимули­рует биосинтез L-фенилаланина несмотря на неко­торое увеличение продолжительности лаг-фазы) и L-лсйцином. После стериллизации рН доводили до величины 7,0—7,2 при помощи NaOH. В качестве источника углерода использовали метанол (2 % от объема среды) или его дейтериймеченный аналог. Культивирование бактерий проводили при 37 в условиях интенсивной аэрации растущей культуры в колбах емкостью 750 мл с наполнением 100 — 150 мл среды. Морфологию клеток В. methylicum иссле­довали с помощью поляризационно-интерфсрснци-онного микроскопа Biolar (Польша). Рост культу­ры контролировали на спектрофотометре Beckman DU 6 (США) при X 620 нм.

Все эксперименты по биосинтетическому включе­нию дейтерия проводили параллельно с контроль­ным (см. таблицу) на стандартной недейтерирован-ной среде.

Для каждого эксперимента по биосинтетическому введению дсйтериевой метки в В. methylicum клетки на ранней фазе экспоненциального роста осаждали центрифугированием (10000 мин"1, 5 мин). После отделения биомассы супернатант лиофилизовали. Сухой остаток супернатанта, содержащий фенила-ланин, переводили в метиловые эфиры N-дансил-производных аминокислот, как описано в работе [3]. ТСХ осуществляли на пластинках Silufol (Че-хо-Словакия) в системах: (А) — изопропанол-амми­ак (7:3) и (Б) — хлороформ-метанол-ацетон (7:1:1). Количественное определение секретируемого фе-нилаланина производили методом ТСХ на пластин­ках Silufol в системе (А). Образцы КЖ объемом 10 мкл наносили на пластинки. Элюирование прояв­ленных нингидрином пятен фенилаланина проводи­ли 0,5 %-ным раствором хлористого кадмия в 50 %-ном этаноле. Концентрацию аминокислоты опреде­ляли спектрофотомстрически с использованием кри­вой корреляции при X 540 нм.

Очистку метиловых эфиров N-дансил-производ­ных аминокислот из КЖ, содержащей дейтерий, осуществляли с помощью колоночной (150 х 40 мм) хроматографии на силикагеле L 40/100 (Chemapol, Чехо-Словакия) с градиентной элюцией системой хлороформ-метанол (от 0 до 10 % метанола).

Детекцию при ТСХ проводили 0,2 %-ным раство­ром нингидрина в ацетоне. N-Дансильные производ­ные аминокислот идентифицировали в системе (Б) по характерной флуоресценции в УФ-свете.

Аминокислоты идентифицировали сопоставлени­ем их спектральных и хроматографичсских характе­ристик с литературными данными [14], сравнением со стандартными аналогами, а также подтверждали данными масс-спсктрометричсского (МС) анализа их производных.

Масс-спектры электронного удара производных аминокислот измерены на приборе МВ-80 A (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Pages:     | 1 | 2 | 3 |    Книги по разным темам