Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных
Автореферат докторской диссертации по биологии
|
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТАкетоадипата (так называемый ?-кетоадипатный путь). Такой путь типичен для конверсии (хлор)ароматических соединений у бактерий.
Образование 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеноновой кислоты (кета-изомера полуальдегида 2-гидроксимуконовой кислоты) указывает на то, что у штаммов G. oxydans 2Т, R. planticola33 4СРА, R. planticola36D и R. planticola36Т расщепление ароматического кольца происходило не по орто-, а по мета - пути.
Обнаружение 2-гексеналя в качестве интермедиата процесса деградации хлорфеноксиуксусных кислот для штаммов P. kilonensis34Т, Stenotrophomonassp. ЗЗТ и Xanthomonassp. 33DCP также свидетельствует в пользу реализации мета - пути конверсии хлорароматиков для этих культур, когда ароматическое кольцо раскрывается таким образом, что образуются муконовые полу альдегиды, дальнейший метаболизм которых, как правило, ведет к образованию пирувата, муравьиной кислоты и ацетальдегида, вступающих затем в основной обмен (цикл Кребса).
Такой характер образования промежуточных продуктов был установлен для ограниченного числа микроорганизмов-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот. Штамм Pseudomonassp. CBS3 (Klages U., Markus A. and Lingens F., 1981) осуществлял мета - расщепление ароматического кольца ключевого метаболита деградации 4-ХФУК - 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты. Из деструкторов 2,4-Д только у штамма Azotobacterchroococcum(Balajee S., Mahadevan A., 1990) было обнаружено мета - расщепление, которое присутствовало как альтернативный (к ?-кетоадипатному) путь конверсии субстрата. Для бактерий, выполняющих диссимиляцию 2,4,5-Т, мета - путь ранее описан не был.
Таким образом, на примере A. xyloxidansЗЗР, G. oxydans2Т, P. kilonensis34Т, R. planticola33 4СРА, R. planticola36D, R. planticola36T, Stenotrophomonassp. ЗЗТ и Xanthomonassp. 33DCP впервые описан мета - путь ассимиляции 2,4,5-Т.
Результаты сравнительного анализа показали, что на примере вновь выделенных штаммов-деструкторов родов Agrobacterium, Achromobacter, Bacillus, Citrobacter, Gluconobacter, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonasи Xanthomonasвпервые для представителей данных таксонов описаны реакции ассимиляции хлорфеноксиуксусных кислот.
3. Сравнительный анализ генетических детерминант катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот
3.1. ПЦР-анализ ДНК геномов штаммов-деструкторов с применением геноспецифических праймеров гена tftABurkholderiacepaciaАС1100
Ранее для BurkholderiacepaciaAC 1100 были описаны особенности генетического контроля пути деструкции 2,4,5-Т, ключевыми особенностями которогоа являются отрыв остатка уксусной кислотыа и образованиеа 2,4,5-
24
трихлорфенола. Вслед за этим происходило дехлорирование молекулы трихлорфенола и разрыв ароматического кольца. Указанные реакции детерминировали //?-гены, входящие в кластер tftAB.
Конечным продуктом реакций этого пути являлся 3-оксоадипат, который в форме промежуточных метаболитов (ацетил-СоА и сукцинил-СоА) включался в ЦТК (Daubaras D.L. et al., 1995; Xun L., Wagnon K.B., 1995; Hiibner A. et al., 1998; Zaborina О. et al., 1998; Ohtsubo Y. et al., 1999).
Ген tftAкодирует 2,4,5-Т-оксигеназу, которая катализирует первую реакцию метаболизма 2,4,5-Т, приводящую к образованию 2,4,5-трихлорфенола. Для определения в геномах прокариот гомологов tftA-гена было предложено использовать систему геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров (Huong N.L. et al., 2007; Rice J.F. et al., 2005). С применением этой системы было успешно показано наличие у Burkholderiasp. M38-VN3-2W последовательностей, гомологичных оригинальному гену tftAштамма BurkholderiacepaciaАС1100 (Huong N.L. et al., 2007).
Разработанная Huong N.L. система геноспецифичных праймеров была применена для сравнения генетических структур, контролирующих деструкцию 2,4,5-Т в клетках изучаемых штаммов- деструкторов.
На рисунке 6 представлена электрофореграмма, полученная в ходе ПНР -анализа гомологов tftAгена BurkholderiacepaciaAC 1100 .
12а 3а 4а 5 6 |
Рисунокаа 6аа -аа Электрофоретический |
||
анализ ПНР-продуктов гомологов гена tftAштаммов Citrobactersp. 36 4СРА, |
|||
Ют.п.н.Ч> |
R. planticola 36T, P. aeruginosa 36DCP. Условные обозначения: |
||
1,5 т.п.н.---------------- к |
1а - маркер (Fermentas); 2а - Burkholderia sp. M38-VN3- 2W, контроль; 3а - Citrobacter sp. 36 4CPA; |
||
500 пн.Ч> |
4а - R. planticola 36T; 5а -P. aeruginosa 36DCP; 6а - контроль (матрица - niQ). |
По результатам проведенного анализа можно сделать вывод об отсутствии ПНР-продуктов в случае использования в качестве матриц геномной ДНК исследуемых штаммов, а, следовательно, об отсутствии последовательностей гена tftAв геномах Citrobactersp. 36 4СРА, R. planticola36T и P. aeruginosa36DCP.
Аналогичные результаты были получены для штаммов A. xyloxidansЗЗР, A. tumefaciens21SG, Agromycessp. 34DCP, A. globiformis17S, A irakense38D, В. cereusЗЗТ, В. subtilis16, В. salcis38Р, Е. asburia33D, Е. cloacae34 4СРА, G. oxydans2T, P. agglomerans36P, P. fluorescens39D, P. kilonensis34T, P. putida
25
19S, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R.rubropertinctus 5D, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T nXanthomonas sp. 33DCP.
3.2. Дот-блот гибридизация препаратов геномных ДНК штаммов -деструкторов и плазмиды pJP4 CupriavidusnecatorJMP134
На примере плазмиды pJP4 штамма CupriavidusnecatorJMP134 Fukumori F. и Hausinger R. установили, что, несмотря на то, что наличие кластера tfd-генов не определяет способность к деструкции 2,4,5-Т, фермент tfdA, кодируемый геном tfdAплазмиды pJP4, способен катализировать конверсию 2,4,5-Т до 2,4,5-трихлорфенола (Fukumori F., Hausinger R.P., 1993).
Известно, что плазмида pJP4 штамма CupriavidusnecatorJMP134 имеет в своем составе два гомологичных, но не идентичных генных кластера -tfdC\D\E\F\ (//?/?-кластер) и tfdD\\C\\E\\F\\ (//?/ц-кластер) (Laemmli СМ. et al., 2000; Itoh К. et al, 2002; Ledger T. et al., 2006).
С учетом приведенных выше данных был проведен поиск гомологов кластера генов tfdA-Fплазмиды pJP4 в геномах исследуемых штаммов.
На рисунке 7 представлены результаты дот-блот гибридизации препаратов геномных ДНК вновь выделенных штаммов с 32Р - меченым препаратом плазмиды pJP4.
1234567а 89аа 10
кшшштттшшшт
А
Б
в
Рисунок 7 - Результаты дот-блот гибридизации препаратов геномных ДНК штаммов с препаратом 32Р ДНК плазмиды pJP4.
Условные обозначения: К-контроль - препарат ДНК CupriavidusnecatorJMP134; А, Б, В - препараты ДНК штаммов A. globiformis17S (1), В. cereusЗЗТ (2), В. subtilis16 (3), Citrobactersp. 36 4СРА (4), G. oxydans2T (5), P.fluorescens39D (6), P. kilonensis34T (7), R. planticola33 4CPA (8), Stenotrophomonassp. 33T(9) nXanthomonassp. 33DCP (10).
Принимая во внимание то, что такой же результат был обнаружен для препаратов ДНК штаммов A. xyloxidansЗЗР, Agromycessp. 34DCP, А. tumefaciens21SG, A. irakense38D, В. salcis38Р, Е. asburia33D, Е. cloacae34 4СРА, P. agglomerans36P, P. aeruginosa36DCP, P. putida19S, R. rubropertinctus5D, R. planticola36D, R. planticola36T и S.аа marcescens22 S,а становится
26
очевидным факт отсутствия в геномах вновь выделенных бактерий последовательностей, гомологичных модельной плазмиде pJP4.
Следует принять во внимание то, что ранее Smejkal С. с коллегами
предпринимали попытку, оказавшуюся безуспешной, амплифицировать
консервативные //??-гены среди членов консорциума с представителями рода
Stenotrophomonas, способного деградировать гербициды 4-(2,4-
дихлорфенокси)бутиловуюа кислотуаа (2,4-DB)аа иаа 4-(4-хлор-2-
метилфенокси)бутановую кислоту (МСРВ) (Smejkal C.W. et al., 2003). Наблюдения Smejkal С. и соавторов согласуются с полученными в данной работе результатами сравнительного анализа генетических структур вновь выделенного Stenotrophomonassp. ЗЗТ.
Таким образом, на основе результатов ПНР-анализа проведенный с
использованием геноспецифических олигонуклеотидных праймеров и ДНК-
ДНК гибридизации можно сделать заключение о том, что в геномах
исследуемыха штаммова отсутствуюта кластеры,а гомологичные
последовательностям tftAи tfdA, кодирующим субъединицу 2,4,5-Т-оксигеназы и 2,4-Д/а-кетоглутарат диоксигеназу.
Приведенные данные делают очевидным то, что генетические системы, детерминирующие процессы деструкции 2,4,5-Т у изучаемых штаммов-деструкторов, являются оригинальными.
Следует отметить, что результаты исследований генетических особенностей вновь выделенных штаммов хорошо согласуются со сведениями об особенностях метаболизма хлорированных ароматических производных, которые были описаны выше в данной работе для A. xyloxidansЗЗР, А. tumefaciens21SG, Agromycessp. 34DCP, A. globiformis17S, A. irakense38D, В. cereusЗЗТ, В. subtilis16, В. salcis38Р, Citrobactersp. 36 4CPA, E. asburia33D, E. cloacae34 4CPA, G. oxydans2T, P. agglomerans36P, P. aeruginosa36DCP, P. fluorescens39D, P. kilonensis34T, P. putida19S, R. planticola33 4CPA, R. planticola36D, R. planticola36T, R. rubropertinctus5D, S. marcescens22S, Stenotrophomonassp. ЗЗТ и Xanthomonassp. 33DCP, указывающими на то, что изучаемые штаммы выполняют оригинальные каталитические реакции конверсии моноароматических галогенидов.
Приведенный выше анализ детерминант деструкции хлорированных ароматических кислот, свидетельствует в пользу того, что генетические системы контроля катаболизма хлорированных ароматических соединений у вновь обнаруженных штаммов родов Achromobacter, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonasи Xanthomonasотличаются от известных и обнаружены впервые.
27
4. Структурно-функциональные особенности плазмид штаммов-деструкторов 4.1 Сравнительный анализ плазмид деструкторов
Ранее было показано, что генетические системы катаболизма синтетических соединений, множественной устойчивости к антибиотикам, устойчивости к тяжелым металлам могут располагаться на плазмидах (El-Deeb А.В., 2001; Ledger Т. et al., 2006; Ye J. et al., 2010). Плазмиды обеспечивают подвижность экологически важных групп генов как внутри клетки (между хромосомой и плазмидой), так и между разными видами через механизмы горизонтального переноса.
Одним из наиболее изученных примеров плазмид, несущих кластеры генов катаболизма ксенобиотиков, является плазмида pJP4 штамма CupriavidusnecatorJMP134 (Trefault N. et al., 2004).
Анализ плазмидного статуса вновь выделенных культур показал, что штаммы-деструкторы Citrobactersp. 36 4СРА, R. planticola33 4CPA, R. planticola36D, R. planticola36T, S. marcescens22S, Stenotrophomonassp. 33T, P. kilonensis34T и Xanthomonassp. 33DCP обладают плазмидами
На рисунке 8 приведены результаты фракционирования плазмидной ДНК штаммов Stenotrophomonassp. ЗЗТ, P. kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP.
23130 п.н.------------------- > 9416 п.н.--------------------- * 6ЬУ/ п.н.--------------------- * 1361а п.н,а l 2322 п.н.--------------------- 2027 п.н. , |
12а 3 4 |
Рисунокаа 8аа -аа Электрофореграмма плазмидной ДНК штаммов Stenotrophomonassp.аа ЗЗТ, P.аа kilonensis34Т и Xanthomonassp. 33DCP. Условные обозначения: 1а - маркер Hindlllфрагменты ДНК фага ? с указанием размеров; 2а - препарат плазмиды Xanthomonassp. 33DCP; 3а - препарат плазмиды P. kilonensis34Т; 4а - препарат плазмиды Stenotrophomonas sp. ЗЗТ. |
По результатам электрофоретического анализа было сделано заключение о том, что клетки штаммов Stenotrophomonassp.а ЗЗТ, P.а kilonensis34Т и Xanthomonassp. 33DCP несут плазмиды, которые были обозначены как pST33T, рРК34Т и pXS33, соответственно.
С помощью ПДРФ-анализа было установлено, что размер плазмид pST33T Stenotrophomonassp. и рРК34Т P. kilonensis34Т ЗЗТ составляет около 27 т.п.н., а плазмиды pXS33 Xanthomonassp. 33DCP - около 46 т.п.н.
28
В клетках R. planticola 33 4 СРА, R. planticola 36D и R. planticola 36Т были обнаружены плазмиды, обозначенные как pRP33 4СРА, pRP36D и pRP36T, соответственно (рис. 9).
|
Условные обозначения: 1,2 - маркер - Pstl- и HindlU-фрагменты ДНК фага ?, с указанием размеров;
|
Рисунока 9а - Результаты электрофоретическогоа фракционирования BamHI-фрагментова (А), HindIII-фрагментова (В) и Pstl-фрагментова (С) препаратов плазмид pRP33 4СРА, pRP36D и pRP36T. Рамками показана область рестрикционного полиморфизма плазмид.
Проведенный RFLP-анализ показал, что все три плазмиды имеют BamHI-, Hindlll- и Pstl-сайты рестрикции, при этом у плазмид pRP33 4СРА и pRP36T обнаруживались идентичные профили фрагментов ДНК, в то время как в структуре pRP36D имелись существенные отличия (рис. 9).
29
На основании полученных данных были определены размеры плазмид: pRP33 4СРА и pRP36T - около 110 т.п.н., а плазмиды pRP36D - около 127 т.п.н.
Клетки Citrobacter sp. 36 4СРА и S. marcescens 22S несли плазмиды рАН 36 4СРА и pSM 22S, размеры которых составляли 5,2 т.п.н. и 48 т.п.н., соответственно.
С целью локализации кластеров генов, детерминирующих деградацию хлорфеноксикислот, был использован метод элиминации плазмид, индуцированной обработкой клеток микроорганизмов ДНК - тройными агентами. В ходе сравнительных исследований было установлено, что с потерей плазмид клетки Citrobactersp. 36 4СРА, R. planticola33 4CPA, R. plant?cola36D, R. planticola36T, S. marcescens22S, Stenotrophomonassp. 33T, P. kilonensis34T и Xanthomonassp. 33DCP утрачивали способность использовать 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии.
Эти данные свидетельствуют о том, что детерминанты, контролирующие катаболизм хлорфеноксиуксусных кислот Citrobactersp. 36 4СРА, P. kilonensis34T, S. marcescens22S, Stenotrophomonassp. 33T и Xanthomonassp. 33DCP, располагаются на плазмидах.
На основе полученных характеристик плазмиды рАН 36 4СРА, pSM 22S, pRP33 4СРА, pRP36D, pRP36T, pST33T, pPK34T и pXS33 классифицированы как новые D-плазмиды бактерий.
4.2. Горизонтальный перенос плазмид и экспрессия функций катаболизма хлорфеноксикислот в других бактериальных хозяевах
Результаты изучения способности плазмид pRP33 4СРА, pRP36D и pRP36T к трансферу и экспрессии катаболических функций в различных хозяевах приведены таблице 3.
Из данных таблицы 3 следует, что конъюгативный перенос плазмид pRP33 4СРА и pRP36D в клетки родственного штамма R. planticola36Т в модельной системе показал, что все трансконъюганты экспрессировали генотипы, соответствующие донорским плазмидам.
Сходный результат был получен и с использованием плазмид pRP33 4СРА, pRP36D, pRP36T для штамма G. oxydans2Т.
В тоже время переход плазмид pRP33 4СРА, pRP36D, pRP36T в клетки штаммов Citrobactersp. 36 4СРА и S. marcescens22S не наблюдался.
Обнаруженные данные свидетельствовали в пользу возможности трансфера катаболических плазмид pRP33 4СРА, pRP36D и pRP36T в клетки других штаммов путем конъюгации.
Следует отметить, что экспрессия катаболических генов деградации хлорфеноксиуксусных кислот и функций устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов в новом хозяине осуществлялась в полном объеме.
30
Таблица 3 - Результаты анализа конъюгативного переноса плазмид RP33 4СРА, pRP36D и pRP36T в условиях чистой культуры
ШТАММ-РЕЦИПИЕНТ |
ШТАММ-ДОНОР |
Наличие трансконьюгантов |
Генотип трансформированных клеток |
R. planticola 36Т |
R. planticola 3 3 4CPA |
+ |
kan+tfd+, tft+, tcp+ |
R. planticola 36D |
+ |
bio+cad+ tfd+, tft+, tcp+ |
|
Citrobacter sp. 36 4СРА |
R. planticola 3 3 4CPA |
Ч |
Ч |
R. planticola 36D |
Ч |
Ч |
|
R. planticola 36T |
Ч |
Ч |
|
S. marcescens 22S |
R. planticola 3 3 4CPA |
Ч |
Ч |
R. planticola 36D |
Ч |
Ч |
|
R. planticola 36T |
Ч |
Ч |
|
G. oxydans 2T |
R. planticola 3 3 4CPA |
+ |
tet+ cob+, cad+ tfd+, tft+, tcp+ |
R. planticola 36D |
+ |
cat+ cad+ tfd+, tft+, tcp+ |
|
R. planticola 36T |
+ |
tet arg tfd+, tft+, tcp+ |
Условные обозначения детерминант устойчивости: - к антибиотикам: tet - к тетрациклину; cat+ - хлорамфениколу; kan+ - канамицину; bio+ - биомицину; -к ионам тяжелых металлов: cob+- к Со2+; сасГ - Cd2+; arg+ - Ag+ .
В ходе работы была также проверена возможность передачи обнаруженных плазмид путем трансформации.
Из данных, приведенных в таблице 4, видно, что трансформированные клетки штамма E.coliНВ 101 с приобретением плазмид рАН 36 4СРА и pSM22S приобретали способность к конверсии селективных ксенобиотиков, а именно, 2,4-Д и 2,4,5-Т.
Из данных табл. 4, также следует, что клетки штамма R. planticola33 4СРА с приобретением плазмиды рАН 36 4СРА приобретали способность к конверсии 2,4-Д и 2,4,5-Т.
31
Таблица 4 - Результаты тестирования катаболической активности штаммов при трансформации рАН 36 4СРА и pSM22S
ШТАММ РЕ1ТЙПИЕНТ |
ПЛАЗМИДА |
СРЕДА М9 с добавлением |
|
2,4-Д |
2,4,5-Т |
||
E.coliHB 101 |
рАН 36 4СРА |
+ |
+ |
pSM22S |
+ |
+ |
|
отсутствует (контроль) |
Ч |
Ч |
|
R. planticola 33 4СРА |
рАН 36 4СРА |
+ |
+ |
отсутствует (контроль) |
Ч |
Ч |
Условные обозначения: (+) - наличие роста, (-) - отсутствие роста
Обретение способности использовать хлорфеноксиуксусные кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии означает, что свойство деструкции ксенобиотиков может быть реализовано в различных бактериальных хозяевах в случаях трансфера плазмид.
Полученные результаты указывают на возможность передачи среди бактериальных членов популяций генетических кластеров, контролирующих реакции катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот, расположенных на плазмидах рАН 36 4СРА Citrobacter sp. 36 4СРА и pSM22S S. marcescens 22S (путем трансформации) и на плазмидах pRP33 4СРА, pRP36D и pRP36T штаммов R. planticola(путем конъюгации).
|
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии