Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных

Автореферат докторской диссертации по биологии

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

Идентификацию изолятов проводили по результатам сравнительного анализа культурально-морфологических, морфометрических и физиолого-биохимических признаков в соответствии с критериями дифференциации бактерий, предложенными в 9-м издании руководства Определитель бактерий Берджи (1997), а также согласно принципам молекулярного типирования клеток прокариот.

При амплификации гена 16S рРНК использовали универсальные для большинства прокариот олигонуклеотидные праймеры (Edwards U. et al., 1989) и амплификатор Bio-Rad MJMini (США). Определение последовательности гена 16S рРНК производили с применением секвенатора Avant 3150 (Applied Biosystems, США) со стандартным набором реактивов по методикам, рекомендованным производителем.

Для генетического анализа использовали базу данных нуклеотидных последовательностей GenBank и возможности Ribosomal Database Project. Выравнивание последовательностей осуществляли с использованием редактора BIOEDIT с помощью программы CLUSTALW v 1.75. Построение деревьев осуществляли в формате пакета программы TREECON. Достоверность ветвления филогенетических деревьев просчитывалась в программе MEGA4.

Протеомные профили клеток бактерий были изучены с помощью времяпролетного масс-спектрометра Microflex (Bruker Daltonic, Германия). Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона m/z (отношение массы к заряду) от 2000 до 20000. Анализ данных проводился в программном пакете Biotyper 2.0 (Seng P. et al, 2009; Szabados F. et. al., 2010).

Плазмидный статус штаммов исследовали с применением метода щелочного лизиса с небольшими модификациями (Маниатис Т. и др., 1984). Элиминацию плазмид проводили по стандартной методике с небольшими модификациями (Герхард Ф., 1990). В качестве элиминирующего агента применяли этидиум бромид или акридиновый оранжевый.

При конъюгации клеток бактерий пользовались указаниями, изложенными в руководстве Методы общей бактериологии (Герхард Ф., 1990). Суспензии клеток донора и реципиента засевали в свежую среду МПБ и проводили наращивание смешанной культуры в течение 8-12 ч при +30С. По окончании инкубации в суспензию добавляли селективные агенты (2,4-Д и 2,4,5- Т) и инкубировали клетки в течение 1-2 часов в условиях аэрации. Далее клетки рассевали на МПА. Контролем чистоты эксперимента служил посев клеток штаммов донора и реципиента на МПА с селективными агентами.

Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК осуществлялась при модификации стандартного метода (Маниатис Т. и др., 1984). В ходе проверки компетентности проводили трансформацию клеток E.coliНВ 101 с применением препарата плазмиды pBR322, несущей ген устойчивости к ампициллину. В качестве контроля чистоты эксперимента выполняли посев клеток без трансформации на среду того же состава.

Фракционирование препаратов ДНК осуществляли путем электрофореза в 1%-м агарозном геле в камере для Bio-Rad Wide mini-sub Cell GT (США) при напряжении электрического поля 6 В/см 25В. После окрашивания фрагментов ДНК гель фотографировали в проходящем УФ-свете при помощи системы документации (Biometra, Германия).

В анализе последовательностей, гомологичных //??-генам, применяли метод дот-блот гибридизации препаратов ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. Для этого получали препарат плазмиды pJP4 штамма CupriavidusnecatorJMP134 методом щелочного лизиса с небольшими модификациями (Маниатис Т. и др., 1984). Метку в препараты ДНК вводили методом замещения нуклеотидов с использованием набора Nick-Translation System (Promega, США). При приведении сравнительного анализа //?-генов ДНК-матрицы для ПЦР-реакций получали по методике N.L. Huong с коллегами (Huong N.L. et al., 2007) с незначительными модификациями. Амплификацию гена tftA осуществляли с использованием препарата ДНК штамма Burkholderia sp. M38-VN3-2W в качестве положительного контроля (Huong N.L. et al., 2007).

Ферментативный гидролиз препаратов ДНК и ПДРФ-анализ проводили по стандартным методикам с учетом рекомендаций производителя (Fermentas, Литовская Республика). Определение размеров фрагментов ДНК осуществляли относительно набора маркерных фрагментов ДНК фага ? с использованием программы Gel Analysis.

Для определения чувствительности штаммов к антибиотикам использовали метод диффузии в агар с применением дисков (Лабинская А.С, 1978).

Рост культур осуществляли в термостатированных установках УВМТ-12-250 при 115-120 об/мин. Контроль биомассы выполнялся путем измерения значений оптической плотности клеточной суспензии с использованием фотоколориметра КФК-2 (Россия) при длине волны 590 нм и чувствительности равной 2.

Анализ содержания фенола и хлорфенола проводили согласно стандартному фотометрическому методу с применением 4-аминоантипирина (Губен-Вейль И., 1963). Количество фенолов определяли по градуировочному графику, построенному в стандартных условиях определения. Содержание хлорфеноксикислот в культуральной жидкости контролировали согласно руководству Методы определения микроколичеств пестицидов (Клисенко М.А., 1984). Идентификацию интермедиатов осуществляли на хромато-масс-спектрометре NERMAG R-30-10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 5360.

Все эксперименты проведены не менее чем в трех повторностях. В ходе обработки данных определялась средняя арифметическая, стандартное отклонение и доверительный интервал. Обработка результатов проводилась с использованием программы Excel 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Из образцов почвенной биоты, подвергавшейся воздействию факторов нефтехимического производства, были выделены изоляты, способные к росту в условиях использования фенола, 2,4-дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной, 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислот в качестве единственного источника углерода и энергии. 1. Идентификация микроорганизмов-деструкторов

Выявленные культуры были идентифицированы согласно совокупности

культурально-морфологических,а морфометрических,аа физиолого-

биохимических признаков, а также в соответствии с принципами молекулярного типирования прокариот как штаммы Achromobacter xyloxidans ЗЗР, Agrobacteriumtumefaciens21SG, Agromycessp. 34DCP, Arthrobacter globiformis17S, Azospirillumirakense38D, Bacilluscereus33T, Bacillussubtilis16, Brenneriasalcis38P, Citrobactersp. 36 4CPA, Enterobacterasburia33D, Enterobactercloacae34 4CPA, Gluconobacteroxydans2T, Pantoeaagglomerans36P, Pseudomonasaeruginosa36DCP, Pseudomonasfluorescens39D, Pseudomonaskilonensis34T, Pseudomonasputida19S, Raoultellaplanticola33 4CPA, Raoultellaplanticola36D, Raoultellaplanticola36T, Rhodococcusrubropertinctus5D, Serratiamarcescens22S, Stenotrophomonassp. 33T и Xanthomonassp. 33DCP.

Рисунок 1 - ACM - изображения клеток Azospirillumirakense38D (1), Stenotrophomonassp. 33T (2,3), Citrobactersp. 36 4CPA (4), Rhodococcusrubropertinctus5D (5), Pseudomonasfluorescens39D (6), Gluconobacteroxydans2T (4). Изображения клеток Xanthomonassp. 33DCP при разрешении 6000X (7), Gluconobacteroxydans2T при разрешении 24000X (8), полученные с использованием электронной микроскопии. Стрелкой обозначены жгутики бактерий.

Основные диагностические морфологические и морфометрические характеристики микробных клеток были получены с использованием методов электронной и АСМ-микроскопии (рис. 1).

В ходе исследования физиолого-биохимических признаков были выявлена устойчивость изолятов 2Т, 33 4СРА, 36D, 36Т, 22S к антибиотикам (тетрациклину, хлорамфениколу, канамицину, биомицину) и ионам тяжелых металлов (кобальта, кадмия, серебра). В клетках нескольких культур, в частности, 36 4СРА, 34Т, 22S, ЗЗТ и 33DCP были обнаружены экстрахромосомные элементы.

Сравнительный анализ последовательностей 16S рРНК позволил установить филогенетические кластеры, в которые входили обнаруженные штаммы, и определить наиболее близкие им виды, представленные в базе данных нуклеотидных последовательностей GenBank.

100

Serratia marcescens Serratia marcescens - Serratia marcescens

100

-а Serratia marcescens

,_ I- Serratia marcescens

ж Serratia marcescens

Serratia marcescens ATCC 13880T

- ж 22S (HQ896493)

------ Serratia rubidaea JCM1240T

----- Serratia ficaria JCM 1241T

Serratia liquefaciens JCM 1245T 100аа ,_ Citrobacter werkmanii CDC 0876-58T Citrobacter braakii CDC 080-58T Citrobacter freundii DSM 30039T

------ Escherichia coliK-12

100а Citrobacter koseri CDC 8132-86 IЧ Citrobacter koseri CDC 3613-63T r- Citrobacteramalonaticus CDC 9020-77

100

Citrobacter farmeri CDC 8T .Ч ж 36 4CPA(JF812082J

I---- Citrobacter sedlakii CDC 4696-861

\Ч Citrobacter rodentium CDC 1843-73T

0,02

100

i Rac

Raoultella ornithinolytica ATCC 31898 Raoultella planticola 8433 Raoultella ornithinolytica JCM 7251 Raoultella ornithinolytica JCM6096T Raoultella ornithinolytica 590681

Raoultella planticola 4131 Raoultella ornithinolytica FSK9555 ж- Raoultella planticola ATCC 43176 Raoultella trevisanii ATCC 33558T Raoultella planticola DR3 Raoultella planticola 7444 Raoultella planticola 7

jЧ Ra

Raoultella planticola DSM 3069T 33 4CPA (DQ333356)

Raoultella terrigena ATCC33257T Raoultella terrigena SW4 Raoultella terrigena m 5 Raoultella terrigena m 30

Raoultella terrigena m 19

Raoultella planticola JCM 72511

Рисунок 2 - Филогенетическое положение штаммов 36 4СРА, 22 S (А) и 33 4СРА (Б). Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" - анализа (значащими признаются величины показателя "bootstrap" более 50).

В ходе типирования бактерий с учетом молекулярных маркеров было установлено, что культуры 36 4СРА и 22S принадлежат к филогенетической подгруппе энтеробактерий (рис. 2А).

Штамм 36 4СРА был отнесен к филогенетической подгруппе гетерогенного рода Citrobacter. Уровень сходства последовательностей генов 16S рРНК штамма 36 4СРА с последовательностями различных видов этой подгруппы составлял 97,6 - 98,8%, что оказалось заметно ниже внутривидового уровня для типовых видов С. koseri и С. farmery(99,4%). Внутри филогенетического кластера, составленного этими видами, штамм 36 4СРА образовывал самостоятельную ветвь (рис. 2А). Согласно полученным данным был сделан вывод о том, что штамм 36 4СРА представляет новый вид филогенетической подгруппы рода Citrobacterи он был обозначен как Citrobactersp. 36 4СРА.

Штамм 22 S входил в кластер, образованный несколькими штаммами Serratiamarcescens, включая типовой. Уровень сходства последовательностей 16S рРНК изучаемого штамма со штаммами кластера Serratiamarcescensоказался очень высоким и составил 99,4 - 99,8%. Этот уровень соответствовал внутривидовому для вида S. marcescens(98,8%). Уровень сходства последовательностей с другими видами рода Serratiaбыл заметно ниже - 98,3 -98,5% (рис. 2А). Результаты анализа сходства последовательностей генов 16S рРНК позволили отнести изучаемый штамм к роду Serratiaи виду marcescens.

Сравнительный анализ последовательностей генов 16S рРНК штаммов 33 4СРА, 36D и 36Т показал, что последовательности генов 16S рРНК этих штаммов идентичны и входят в филогенетический кластер видов рода Raoultellaplanticola, Raoultellaornithinolyticaи Raoultellatrevisanii(рис. 2Б). При этом наиболее близким к ним является типовой штамм вида Raoultellaplanticola(99.8%) (рис. 2Б). Такой уровень сходства соответствует внутривидовому для R. planticola(99,8%), что позволило однозначно идентифицировать штаммы 33 4СРА, 36D и 36Т как Raoultellaplanticola.

На основании анализа последовательности 16S рРНК было показано, что штамм ЗЗТ входит в филогенетический кластер рода Stenotrophomonasс уровнем сходства 98 - 99%, что ясно свидетельствовало о том, что штамм ЗЗТ является представителем рода Stenotrophomonas. При этом наиболее близкими видами к штамму ЗЗТ являлись Stenotrophomonas maltophilia LMG 958Т и Stenotrophomonas africae LMG 22072 (рис. ЗА).

Вместе с тем, принимая во внимание то, что согласно АСМ-изображениям у клеток штамма ЗЗТ было обнаружено наличие двух полярно расположенных жгутиков (рис. 1, изображения 2 и 3), в то время как для вида Stenotrophomonas maltophiliaописано перитрихиальное жгутикование (Определитель бактерий Берджи, 1997), было сделано заключение о том, что штамм Stenotrophomonassp. ЗЗТ не может быть классифицирован как Stenotrophomonasmaltophiliaи близкий к нему Stenotrophomonasafricae, и его следует классифицировать как новый вид рода Stenotrophomonas.

Достоверность классификации штамма ЗЗТ была проверена в ходе протеомного фингерпринтинга. По результатам анализа профиля белковых масс было установлено, что штамм Stenotrophomonassp. ЗЗТ близок к штамму Stenotrophomonassp. 109 Neb28 NFL Значение логарифмического показателя вероятности идентификации, составляло 2,005. Это убедительно указывало на то, что штамм ЗЗТ следует идентифицировать как новый вид рода Stenotrophomonas.

nXcmlhcmonasadoriodaLh/G747T' XantharcnasЬопоптгРКС 7ЗЗТ 63 XanthamiasbnmLM3947TXanthamiaspisiLM3847T

________ ю Xanaiamiascassa\ueLM3673T

XanaiamiasveskafciriaLM3911TXanthamiascucutbitaelXGTs XanthamiasсщяаеТШ/116794Т 1ЧXanthamiasраж1ИХ?}5743Т

---- StenotovphamiasМщМа1Х?}22075Т

------- StжшщМа1КС22(ЛЗТ

------------- Stenobq3mmiashimiLM323959T

- + 3??2?77451)

looll---- Stemtn^arcmsm2ltqM1iaLhf}958r

7i'-------------------------- Stenctn^amiwqfiicaeLhf}22072

ЧXanthamaiaspqniiUvD5743-T XanthanmisvesicatcriaIMJ911T ЧXanlharuiastheicdaLMJ8684T Xanthamias cucwbitaeUvGT

Xantharmas canpestris 568-T JumlhcmnasvascdaLMJ 736? ЧPseudammas cisscdaLMJ 2167T

----- Xanthamias coctaa LMJ867ST

----- Xanthamias axcnqxxisLMJ538?

-+33ECP(HQ891021)

------- Xanthamias sacchari LMJ471T

- Xanthamias albilineansLMJ494-T -XantharionascanpestrisLMJ876 - Xanthamias nelansLA/G8670T

57'ЧXanthanonash}acinthilMJ739T

0.005

Г,

Pseudamws carugataLSM7228T Pseudamws UlawnsisLEM13647T Pseudamws thivenalensis CFBP11261T

------- ж 34T<HX91022)

Ps.fiederiksbergpnsisLSM13022T

Pseudamws campions ПМ14939Т

loo1 Pseudamws trenwe CFBP 611 IT Pseudamws сИаащЛшГШЛ19603Т

ЧPseudamws сИаащЛшГШЛ6698 Kg Pseudamws cedrim CPKL 96-198Г' Pseudamws cedrim ПМ14938Г

______________ IЧ Pseudamws mdwti Ip4-2T

100'------ Pseudamws moaei ???12647?

0.C05

Рисунок 3 - Филогенетическое положение штаммов ЗЗТ (A), 33DCP (Б) и 34Т (В). Масштаб показывает эволюционное расстояние последовательности гена 16S рРНК, соответствующее 5 нуклеотидным заменам на каждые 1000 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap''-анализа (значащими признаются величины показателя "bootstrap" более 50).

По данным типирования штамма 33DCP с использованием последовательности 16S рДНК было установлено, что штамм принадлежит к филогенетическому кластеру, образованному представителями рода Xanthomonas. Уровень сходства последовательностей 16S рДНК изучаемого штамма и различных видов рода Xanthomonasсоставлял более 99%. На основании этих данных было сделано заключение, что штамм 33DCP является представителем рода Xanthomonas.

Исследование белковых профилей штамма 33DCP не обнаружило достоверную близость ни с одним бактериальным штаммом, поэтому этот штамм был дифференцирован как штамм нового вида рода Xanthomonas(рис. ЗБ).

Из рис. ЗВ видно, что изолят 34Т принадлежит филогенетически гетерогенному роду Pseudomonas. Уровень гомологии последовательности гена 16S рРНК штамма 34Т и близких ему видов превышал 99%. Наиболее близкими к нему видами являлись P. thivervalensisCFBP 11261Т, P. corrugataDSM 7228Т и P. kilonensisDSM 13547Т.

Анализ профиля белковых масс клеток данного штамма выявил, что онимеет наибольшее сходство со штаммом PseudomonaskilonensisDSM 13647Т НАМ. Значение логарифмического показателя вероятности идентификации, равное 2,045, подтверждало достоверность таксономического определения этого штамма. На основании полученных данных штамм 34Т был идентифицирован как Pseudomonaskilonensis34Т (рис. ЗБ).

Согласно совокупности результатов филогенетического анализа было установлено, что в составе смешанных популяций присутствовали 4 штамма рода Pseudomonas, а именно, P. aeruginosa36DCP, P. fluorescens39D, Р. kilonensis34Т и P. putida19S, 3 штамма рода Raoultella- R. planticola33 4СРА, R. planticola36D и R. planticola36T и по два деструктора родов Enterobacter-Е. asburia33D и Е. cloacae34 4СРА, а также Bacillus- В. cereusЗЗТ и В. subtilis16.

Таким образом, было обнаружено, что в составе биоты техногенной экосистемы присутствовали деструкторы фенола и его хлорированных производных нескольких таксонов протеобактерий, а именно родов: Achromobacter, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonasи Xanthomonas.

Данные таксономические группы протеобактерий были представлены штаммами альфа-подкласса (A. irakense38D и G. oxydans2Т), бета-подкласса (A. xyloxidansЗЗР) и гамма-подкласса (A. tumefaciens21SG, В. salcis38Р, Citrobactersp. 36 4СРА, Е. asburia33D, Е. cloacae34 4СРА, P. agglomerans36P, P. aeruginosa36DCP, P. fluorescens39D, P. kilonensis34T, P. putida19S, R. planticola33 4CPA, R. planticola36D, R. planticola36T, S. marcescens22S, Stenotrophomonassp. 33T, Xanthomonassp. 33DCP), а также группой актиномицетов (Agromycessp. 34DCP, A. globiformis17S и R. rubropertinctus5D). Кроме этого были обнаружены представители бациллярной линии (В. cereusЗЗТ и В. subtilis16).

Следует отметить, что ряд исследователей обнаруживал среди деструкторов представителей бактерий родов Achromobacter(Vedler Е. et al., 2000; Quan X. et al, 2004), Bacillus(Gurujeyalakshmi G. et al., 1989; Козловский С. и др., 1993; Kim I., Oriel P., 1995; Gunther K. et al, 1995; Lang E. et al., 1996.; Li D.-Y. et al., 2006; Matafonova G. et al, 2006; Herrera Y et al, 2008; Wang C. et al, 2008; Liu D.-Y. et al, 2008; Singh S. et al, 2008; Tallur P. et al., 2006; Kirchner U. et al, 2003; Satchanska G. et al, 2006), Citrobacter(Martinez M.et. al., 2000; Narde K. et al., 2004) и Rhodococcus(Hensel J. et al., 1983; Горлатов С. и др., 1989; Janke D. et al, 1989; Мальцева О. и др., 1991; Stoecker М. et al., 1994; Briglia M. et al, 1996; Lang E. et al., 1996; Моисеева О. и др., 1999; Соляникова И. и др., 1999; Финкельштейн 3. и др., 2000; Prieto М. et al, 2002; Ferraroni М. et al, 2003; Rehfuss M. et al, 2005; Goswami M. et al, 2005; MargesinR. et al, 2005; Плотникова E. и др., 2006; Pamukoglu M., Kargi F. 2008; Gouda M. et al, 2007).

Принимая во внимание то, что ранее не были выделены бактерии-деструкторы фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т родов Agrobacterium, Agromyces, Azospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonasи Xanthomonas, следует сделать вывод о том, что способности представителей указанных таксономических групп вовлекать в обмен веществ и энергии галогенсодержащие производные ароматического ряда выявлены впервые на примере вновь выделенных штаммов A. tumefaciens21SG, Agromycessp. 34DCP A. irakense38D, В. salcis38Р, Е. asburia33D, Е. cloacae34 4СРА, G. oxydans2T, P. agglomerans36P, R. planticola33 4CPA, R. planticola36D, R. planticola36T, S. marcescens22S, Stenotrophomonassp. 33T nXanthomonassp. 33DCP.

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

Blog

Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных