Тезисы докладов

Вид материала

Тезисы

Содержание Конструирование тест-системы и скрининг ингибиторов серин-треониновой протеинкиназы streptomyces pk17 – модуляторов программиров E. coli lpk17/aphVIII Новые варианты рекомбинантных антител для лечения рака молочной железы

Подобный материал:

• Тезисы докладов, 3726.96kb.
• Тезисы докладов, 1225.64kb.
• Правила оформления тезисов докладов Тезисы докладов предоставляются в электронном виде, 22.59kb.
• «Симпозиум по ядерной химии высоких энергий», 1692.86kb.
• Требования к тезисам докладов, 16.83kb.
• Тезисы докладов научно-практической, 6653.64kb.
• Тезисы докладов 1 Межвузовская научно -практическая конференция студентов и молодых, 100.64kb.
• Тезисы докладов и заявки на участие, 104.97kb.
• Тезисы докладов, принятые Оргкомитетом для опубликования в Материалах форума, 788.61kb.
• Тезисы докладов, принятые Оргкомитетом для опубликования в Материалах форума, 1066kb.

КОНСТРУИРОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ И СКРИНИНГ ИНГИБИТОРОВ СЕРИН-ТРЕОНИНОВОЙ ПРОТЕИНКИНАЗЫ STREPTOMYCES PK17 – МОДУЛЯТОРОВ ПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ АКТИНОБАКТЕРИЙ.

В.Н.Даниленко, Д.А.Маслов, О.Б.Беккер, М.Г.Алексеева, Д.А.Мавлетова

Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Москва, Россия


Современный подход в борьбе с инфекционными заболевании-ями предполагает целенаправленное поражение механизмов обеспе-чения жизнедеятельности клеток микроорганизмов. Ингибирование этих механизмов индуцирует программированную гибель (ПГ). Серин-треониновые протеинкиназы (СТПК) эукариотического типа идентифицированы у большинства актинобактерий, в том числе у патогенных видов Mycobacterium, Streptococcus и др. Эти ферменты участвуют в фенотипах вирулентности, патогенности, лекарствен-ной устойчивости бактерий. ПГ описана для различных групп бактерий, в том числе рода Streptomyces [1, 2, 3]. Ингибиторы СТПК, конкурентно замещающие АТФ в аденин-связывающем кар-мане, могут быть потенциальными лекарствами нового механизма действия. Проведена классификация СТПК эукариотического типа по аминокислотной последовательности аденин-связывающего кар-мана каталитического домена, в результате которой протеинкиназы разделены на 20 групп. В группу гомологов протеинкиназы AfsK, предположительно участвующих в процессе ПГ [2], входят СТПК таких патогенов, как Frankia и Nocardia [4].

В 2010 году нами была сконструирована и валидирована тест-система E. coli lpk17/aphVIII, ключевым элементом которой являет-ся аминогликозидфосфотрансфераза типа 8 (APHVIII), придающая клеткам устойчивость к аминогликозидному антибиотику каннами-цину [5, 6, 7]. В гене aphVIII была модифицирована область фос-форилирования S-146 с целью приблизить ее последовательность к последовательности сайта автофосфорилирования СТПК LPK17 S. lividans. Недостатком полученной конструкции являлся недостаточ-но большой диапазон устойчивости к канамицину клеток, содер-жащих ген aphVIII и протеинкиназы, и клеток, несущих только ген aphVIII, что связано с низким уровнем экспрессии гена aphVIII.

Были созданы новые генетические конструкции в векторе pET-32a, в которых под контролем промотора РНК-полимеразы бакте-риофага T7 были поставлены ген aphVIII и нуклеотидная последо-вательность каталитического домена lpk17, слитая с последова-тельностью тиоредоксина. Каждый ген имел свой энхансер и сайт связывания с рибосомой. Полученные новые конструкции E. coli aphVIII/lpk17 оказались устойчивыми к канамицину в концентра-циях на два порядка превышающих предыдущие. Для валидации тест-системы использованы стандартные ингибиторы СТПК класса индолилмалеимидов [5]. В результате скрининга были отобраны ингибиторы СТПК, вызывающие программированный лизис S. lividans. Сконструированная тест-система может быть использована для отбора ингибиторов протеинкиназы LPK17 S. lividans, а также протеинкиназ патогенных бактерий рода Frankia и Nocardia [4].

1. Прозоров А. А. и Даниленко В.Н. Микробиология, 2010, т. 79, № 2, с. 147-159.
   
2. Manteca A. et al. Proteomics. 2006. V. 6. N22. P. 6008-6022.
   
3. Беккер О. Б. и др. Микробиология. 2012. В печати.
   
4. Zakharevich N. V. et al. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2011, in press.
   
5. Danilenko V. et al. Journal of Medicinal Chemistry. 2008. V. 51. N 24. P.7731-7736.
   
6. Danilenko V.N. et. al. Current Topics in Medicinal Chemistry 2011. V. 11. N. 11. P.1352-69.
   
7. Беккер О. Б. и др. ActaNature 2010, т. 2 № 3(6), 126-39.
   

НОВЫЕ ВАРИАНТЫ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ

ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

С.М.Деев, О.А.Стремовский, С.В.Лукаш, Ю.М.Ходарович

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН


Рекомбинантные антитела, направленные против опухолеас-социированных антигенов, являются сравнительно новым и эффек-тивным классом противоопухолевых препаратов. Однако рекомби-нантное антитело не всегда способно эффективно воздействовать на опухоль, даже если на поверхности опухолевых клеток есть соответствующий антиген. Это связано в значительной степени с тем, что некоторые опухоли вырабатывают механизм подавления антителозависимой цитотоксичности. Так, существующий в настоя-щее время препарат "Герцептин" содержит антитело против рецеп-тора HER2/neu, который гиперэкспрессирован в 30 % опухолей мо-лочной железы. Применение препарата существенно улучшает ре-зультаты лечения опухоли, однако часть HER2/neu-положительных опухолей проявляют резистентность к этому препарату. Для преодоления устойчивости опухолей к стандартным антителам нами было сделано два новых варианта антитела. Первое антитело представляет собой полноразмерное антитело - аналог "Герцептина" IgE изотипа. Мы ожидаем, что антитела IgE изотипа, связанные с опухолью, будут запускать реакцию эффекторных клеток, таких как Th2 клетки, моноциты, эозинофилы и базофилы, и, таким образом, будут стимулировать воспалительный процесс, направленный против опухоли. Была продемонстрирована эффективная экспресс-сия этого антитела в культурах клеток эукариот и получены стабильные линии – продуценты антитела. Показано, что антитело связывается с антигеном с константой диссоциации 0.7 нМ, что примерно соответствует константе диссоциации герцептина (0.1 нМ). В настоящее время проводится изучение цитотоксических свойств антитела на культуре клеток аденокарциномы яичника человека SKOV3. Второй вариант антитела представляет собой иммуноконъюгат мини-антитела с рибонуклеазой барназой. В пред-варительных исследованиях нами было показано, что подобный иммуноконъюгат, называемый иммуноРНКазой, сконструирован-ный на основе мини-антител и рибонуклеазы барназы и полученный в бактериальной экспрессирующей системе, обладает селективно-стью антитела и высокой цитотоксичностью, обусловленной дейст-вием рибонуклеазы. Нами была создана генно-инженерная кон-струкция, предназначенная для экспрессии и секреции имму-ноРНКазы в культуре клеток млекопитающих. Было показано, что барназа сохраняет рибонуклеазную активность в составе имму-ноРНКазы, а сама иммуноРНКаза секретируется из клеток. Данная конструкция была использована для трансфекции линии клеток SKOV-3. Клетки SKOV-3 гиперэкспрессируют на своей поверхнос-ти рецептор HER2/neu и, таким образом, должны быть чув-ствительны к действию иммуноРНКазы. Было показано, что в отличие от чистой барназы иммуноРНКаза не оказывает заметного цитотоксического действия. Причины более низкой цито-токсичности иммуноРНКазы в настоящее время изучаются.