Биотехнологические основы конструирования и использования иммунобиологических препаратов для молодняка крупного рогатого скота 03. 00. 23 биотехнология

Вид материала

Автореферат диссертации

Содержание Личный вклад соискателя Апробация результатов диссертации Опубликованность результатов. Структура и объем диссертации Материалы и методы исследования Результаты собственных исследований Состояние иммунной системы и обмена веществ у телят при вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекциях

Подобный материал:

•  современного фермерского хозяйства, на базе существующего крестьянского хозяйства,, 72.62kb.
• Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота имеет особое значение., 299.72kb.
• Программа развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной, 16.63kb.
• Примерная тематика курсовых работ и историй болезни, 23.51kb.
• Откорм крупного рогатого скота, 305.74kb.
• Комплексная Программа нпо нарвак по диагностике, профилактике и лечению инфекционных, 72.94kb.
• Доклад на коллегии Управления ветеринарии по теме: «Эпизоотическое состояние Ульяновской, 67.74kb.
• Использования ежегодно, в течение всего года, проводится бонитировка племенного крупного, 79.65kb.
• Ветеринарно-санитарные правила по профилактике и ликвидации хламидиоза крупного рогатого, 202.68kb.
• 2. 2 Использование пектинсодержащего сырья при откорме молодняка крупного рогатого, 158.15kb.

^

Личный вклад соискателя

Исследования по разработке средств и методов иммунологической профилактики и терапии вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций, отработке параметров изготовления иммуностимулирующих и вакцинных препаратов, разработке схем их применения проводились лично соискателем. При выполнении комплексных разработок – иммуностимулирующих и вакцинных препаратов личный вклад соискателя составлял от 60 до 100%.
^

Апробация результатов диссертации

Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены: на заседаниях и РУП «Институт эксперментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского (1991-2008 гг.); Международных, Всесоюзных и Республиканских конференциях, симпозиумах и конгрессах:

Научной конференции «Болезни молодняка сельскохозяйственных животных и их профилактика на комплексах», Таллин: 1984; Научной конференции «Вопросы интенсификации и научно-обоснованного ветеринарного обслужива­ния промышленного жи­вотноводства», Кишинев, 1987; Всесоюзной научной конференции «Стресс и иммунитет», Ростов-на-Дону, 1989; Первом иммунологическом съезде Сочи, 1989; Научно-практической конференции «Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка сельскохозяйственных животных», Минск, 1990; Всесоюзной научно-технической конференции «Современные проблемы иммунологии, биотехнологии и клеточной инженерии в ветеринарной медицине», Нижний-Новгород, 1990; Научной конференции «Siuolaikines veterinarijos problemos», Kaisiadorys, Литва, 1993; Научной конференции «Апитерапия и пчеловодство», Вильнюс, 1993; Научно-практической конференции «Збереженiсть молодняка с/г тварин – запорука розвитку твариництва Украiни», Харькiв, 1994; Научно-практической конференции «Бiотехнологiя ветеринар­них препаратiв», Харькiв, 1993; Международной научной конференции «Общая эпизоотология: им­мунологические, экологи­ческие и методологиче­ские проблемы», Харьков, 1995; Международной научной конференции «Иммунодиагностика и иммунотерапия», Витебск, 1995; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ве­теринарной медицины», Смоленск, 1996; 5-й Научно- практической конференции по апитерапии “Пчелы и ваше здоровье”, Сочи, 1996; Международном координационном совещании «Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных», Воронеж, 1997; Международной научно-практической конференции «Научно-технический про­гресс в сельскохозяйствен­ном производстве», Минск, 1997; Международной научно-практической конференции «Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы» Гродно, 1997; 6-й научно-практической конференции по апитерапии “Пчелы и ваше здоровье” Рыбное, 1997; Международной научно-практической конференции «Проблемы патологии, санитарии и бесплодия в животноводстве», посвященной 100-летию со дня рождения академиков АНБ Х.С.Горегляда и М.К.Юсковца, Минск, 1998; 1 итоговой научно-прак­тической конференции Бел­НИИЭМ, Минск, 1998; Республиканской научно-практической конференции «Инфекция и иммунитет», посвященная 75-летию БелНИИЭМ, Минск, 1999; Учредительной конференции Междуна­родной ассоциации парази­тоценологов, Витебск, 1999; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы па­тологии сельскохозяйст­венных животных», посвященной 70-летию Бел­НИИЭВ им. С.Н.Выше­лесского, Минск, 2000; II Международной научно-практической конферен­ции «Апитерапия сегодня – с биологической аптекой пчел в XXI век», Уфа, 2000; 1 Международной научно-практической конференции и пчеловодству и пчелоте­рапии «От медоцелительства до научной пчелотерапии III тысячелетия» Минск, 2002; Научно-производственной конференции «Внедрение достижений ветеринарной науки в сельскохозяйственное производство», Смоленск, 2002; Международной научно-практической конференции «Современные вопросы патологии сельскохозяйственных животных», Минск, 2003; Шестом Международном форуме по глобальной вакцинологии «Вакцины и иммунизация», Минск, 2003; Международной научно-практической конференции. «Современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства», Ялта, 2005; Simpozionul stiintific international consacrat jubileului de 50 ani de la fondarea Institutului de Zootehnie si Medicina Veterinara "Realizari si perspective in cresterea animalelor", Chisinau, 2006; III з’iзд апiтерапеватiв Украiни. Апiтерапiя: досягнення та перспективи розвитку. Харкiв, 2006.

^ Опубликованность результатов.

По теме диссертации опубликовано 105 научных работ, в том числе 7 монографий, 11 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации, 32 статьи в журналах и сборниках трудов СНГ, 39 статей и тезисов докладов в материалах конференций, 1 свидетельство на научное открытие, 15 патентов и авторских свидетельств, 14 рекомендаций.

^

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 483 страницах машинописного текста и состоит из: введения, общей характеристики работы, обзора литературы по теме и выбора направления исследований, изложения общей методики и основных методов исследований, 8 глав собственных исследований, анализа и обобщения результатов исследований, выводов и практических предложений. Список использованной литературы включает 467 наименование работ отечественных и зарубежных авторов. Материалы диссертации иллюстрированы 115 таблицами, 42 фотографиями и рисунками. В приложении на 82 страницах, приводятся документы и таблицы, подтверждающие результаты отдельных работ, их научную и практическую значимость.


^ Материалы и методы исследования

Работа выполнена в условиях отдела вирусных инфекций РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского» и в животноводческих хозяйствах РБ в период с 1991 по 2008 год.

Для конструирования вакцин и проведения иммунологических исследований и получения бактериальных липополисахаридов, пробиотиков использованы штаммы вирусов – инфекционного ринотрахета КМИЭВ-6, диареи КМИЭВ-7, парагриппа-3 КМИЭВ-8, ротавирус КМИЭВ-3, коронавирус КМИЭВ- 1 и бактерий: E. coli, St. epidermidis № 56, M. lysodeicticus, Bac. subtilis, Bacillus alvei КМИЭВ-11.

В качестве основного объекта исследований были использованы коровы и телята черно-пестрой породы из животноводческих хозяйств Республики Беларусь. Для диагностики ИРТ использовано 7068 сывороток крови от крупного рогатого скота из хозяйств Республики Беларусь; к вирусу диареи - соответственно 7692, ПГ-3 – 3159, ротавирусу – 1165, коронавирусу – 1165.

В опытах по изучению состояния иммунитета у телят и иммунологической перестройки организма после обработки иммунобиологическими препаратами (иммуностимуляторами, вакцинами), лечебной и профилактической эффективности испытуемых средств в производственных условиях использовано 23799 телят в возрасте от 1 дня до 6-месяцев, 14025 коров., 290 кроликов породы шиншилла и белый великан массой 1 – 4 кг, 295 белых мышей, 152 белых крыс.

Выполнено более 3800 серологических, 5000 вирусологических, 5250 иммунологических и 750 биохимических исследований.

Для решения поставленных задач по изучению эпизоотической ситуации, разработке, изучению и внедрению средств и методов профилактики и терапии вирусных пневмоэнтеритов телят был использован комплекс различных методов исследований.

1. Клинико-эпизоотологическое обследование животноводческих хозяйств, в которых эпизоотическая обстановка по массовым желудочно-кишечным и респираторным заболеваниям телят была напряженной, проводили по Бакулову (1982),. Эпизоотическая обстановка учитывалась с использованием статистического, описательно-исторического, клинико-гематологического, патологоанатомического, серологического и иммунологического методов исследований по общепринятым методикам.

Диагноз желудочно-кишечных и респираторных болезней телят вирусной и бактериальной этиологии устанавливали, используя метод эпизоотического обследования, в комплексе с клиническим исследованием животных, патолого-анатомическими изменениями у вынужденно убитых и павших животных. Для оценки эпизоотического процесса определяли заболеваемость и смертность.

Для определения эффективности иммуностимулирующих и вакцинных препаратов при пневмоэнтеритах телят проводили клиническое обследование животных - температуру тела, пульс и дыхание определяли выборочно у отдельных животных в зависимости от эпизоотической ситуации хозяйств. Всего общему клиническому обследованию и наблюдению было подвергнуто более десяти тысяч голов крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Беларусь.

2. Серологические методы включали исследование сывороток крови от здоровых и больных животных с различным клиническим состоянием и после введения сывороток и иммунизации вирус-вакцинами. С целью установления противовирусных антител использовали следующие серологические реакции:

а) реакцию нейтрализации (РН) ставили с целью выявления антител к вирусам ИРТ, ВД, ПГ-3, рота- и коронавирусам в исследуемых сыворотках крови кроликов для оценки иммуногенности вакцин по общепринятой методике (В. Н. Сюрин с соавт., 1986);

б) реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) ставили с целью выявления антител к вирусам ИРТ, ВД, рота- и коронавирусам в сыворотках крови с помощью эритроцитарных диагностикумов (П. А. Красочко с соавт., 1988, 1995);

в) реакцию задержки гемагглютинации (РЗГА) для диагностики парагриппа-3 и установления уровня поствакцинальных антител ставили с помощью набора диагностикумов производства Приволжской биофабрики (В. Н. Сюрин с соавт., 1986);

г) иммуноферментный анализ (ИФА, Elisa) ставили по В. Н. Сюрину с соавт. (1983) в нашей модификации;

4. Иммунологические исследования проводили по следующим направлениям:

а) оценка специфического гуморального иммунитета по содержанию иммуноглобулинов М- и G-классов;

б) оценка состояния клеточного иммунитета по содержанию Т  и В лимфоцитов, фагоцитарного числа, фагоцитарного индекса;

в) оценка состояния неспецифического гуморального иммунитета путем определения бактерицидной активности сыворотки крови, бета-лизинов, титра интерферона, концентрации лизоцима, общего белка.

Количественное определение содержания иммуноглобулинов в сыворотках крови крупного рогатого скота проводили с помощью простой радиальной иммунодиффузии в агаровом геле по Манчини (1964).

Содержание Т лимфоцитов определяли путем постановки реакции спонтанного розеткообразования со стабилизированными эритроцитами барана, а В лимфоцитов - с эритроцитами мыши по Д. К. Новикову и В. И. Нови­ковой (1979).

Фагоцитарное число и фагоцитарный индекс нейтрофилов устанавливали по Н. С. Кисляк и Р. В. Ленской (1978) с помощью тест-культуры кишечной палочки или суспензии полистиролового латекса диаметром 0,1 – 0,2 мкм.

Бактерицидную активность сыворотки крови определяли по О. В. Смирновой и Т. А. Кузьминой (1966) упрощенным нефелометрическим методом по отношению к кишечной палочке (референтный тест-штамм 0 55).

Содержание лизоцима в сыворотках крови определяли нефелометрическим методом по В. Г. Дорофейчуку (1968) по изменению оптической плотности микробной взвеси референтного штамма M. Lysodeictius.

Бактериальный титр интерферона определяли нефелометрическим методом по Н.С.Мурашовой с соавт. (1986) с помощью тест-штамма Staphilococcus epidermidis № 56.

Общий белок сыворотки крови определяли рефрактометрически с помощью рефрактора РПЛ-2.

5.Физико-химические методы исследований включали:

а) выделение иммуноглобулинов классов M и G из сыворотки крови крупного рогатого скот проводили по Й. Броку (1987), а их очистку методом гель-филь­тра­ции на ультрагеле АсА22;

б) выделение бактериального липополисахарида из Bacillus alvei КМИЭВ-11проводили путем термогидролиза с помощью уксусной кислоты по В. М. Никитину (1982) в модификации П.А.Красочко с сотавт. (1989). Полученный липополисахарид стерилизовали автоклавированием.

6. Гематологические исследования выполнялись на гематологическом анализаторе «Medonic CA 620» (Швеция) с использованием реактивов производства фирмы «Cormey» (Польша). Биохимические исследования крови проводились на бихимическом анализаторе «Соrmey-Lumen» с использованием наборов Сormay serum HN производства фирмы «Cormey» (Польша).

7. Биометрическая обработка цифрового материала, полученного в экспериментальных исследованиях, проводилась по Р.Б. Стрелкову (1966) с учетом рекомендаций П. Ф. Рокицкого (1967), а также с использованием персонального компьютера ISA/PCI 80486DX2-66 и программы Microsoft Exel, графическое обеспечение – с помощью программы Graph Exel.

Экономическую эффективность применения научных разработок рассчитывали согласно «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий», утвержденной ГУВ МСХ и П РБ в 2000 г., а также в соответствии с «Методикой определения экономической эффективности использования в сельском хозяйстве результатов научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ новой техники, изобретений и рационализаторских предложений», утвержденной МСХ СССР в 1983 г.


^ РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение причин возникновения респираторных и желудочно-кишечных заболеваний молодняка крупного рогатого скота

в Республике Беларусь

На основе анализа результатов исследований нами установлено, что в возникновении респираторных и желудочно-кишечных заболеваний молодняка крупного рогатого скота играют роль следующие факторы:

-основными возбудителями респираторных и желудочно-кишечных инфекций телят являются вирусы инфекционного ринотрахеита, диареи, парагриппа-3, рота- и коронавирусы, а также условно-патогенная бактериальная микрофлора, осложняющая течение заболевания;

- иммунодефицитное состояние организма новорожденных телят (первичный иммунодефицит) или у телят старше 1-месячного возраста под воздействием неблагоприятных технологических и экологических факторов (вторичный приобретенный иммунодефицит);

-способность вирусов инфекционного ринотрахеита, диареи, парвовирусов, проникать через плацентарный барьер и внутриутробно инфицировать плод с его дальнейшей иммунотолерантностью и вирусоносительством;

-создание стрессовых ситуаций (нарушения технологии содержания и кормления животных, несбалансированность рационов по основным питательным веществам, микро- и макроэлементам, витаминам, низкоэнергетическое питание скота, малый фронт кормления животных, скученное содержание телят на ограниченной площади);

- влияние неблагоприятных экологических факторов внешней среды;

-комплектование групп животных на комплексах или крупных фермах сборными телятами без учета степени инфицированности хозяйств-поставщиков или ферм-поставщиков;

-содержание в одном помещении разновозрастных животных с различным клиническим и иммунологическим состоянием;

-нарушение принципа “пусто-занято” при заполнении помещений новыми телятами;

-генетическая однородность стад, вызванная использованием одних и тех же производителей при осеменении коров;

Наличие антител к вирусам-возбудителям респираторных инфекций в сыворотках крови крупного рогатого скота различных половозрастных групп и клинического состояния свидетельствует о степени инфицированности стад (у взрослых животных), а также о переболевании молодняка вирусными инфекциями. В процессе работы для диагностики ИРТ использовано 4456 сывороток крови от коров из хозяйств Республики Беларусь; к вирусу диареи - соответственно 4678, ПГ-3 – 1646. Кроме того, от переболевших респираторными инфекциями телят 3-4 месячного возраста для диагностики ИРТ было происследовано 1955, ВД -2357, ПГ-3 - 1031 сывороток крови. Также были происследованы сыворотки крови от клинически здоровых телят 6-месячного возраста соответственно 657, 657, 482 проб.

В табл.1. представлены результаты исследований сывороток крови от крупного рогатого скота на наличие антител к вирусам ИРТ, ВД и ПГ-3.

Таблица 1. Результаты исследования сывороток крови от крупного рогатого скота на наличие антител к вирусам-возбудителям респираторных инфекций

Вирус	Показатели	Клиническое состояние и возраст
Коровы, 3—10 лет, клинически здоровые	Телята, 3-4 мес., переболевшие респираторными болезнями	Телята старше 6 мес., клинически здоровые
Инфекционный ринотрахеит	К-во исслед. проб/процент	4456 / 67,6	1955/65,8	657/68,8
Вирусная диарея	К-во исслед. проб/процент	4678 / 86,6	2357 / 84,1	657 / 88,9
Парагрипп-3	К-во исслед. проб/процент	1646 / 55,9	1031 / 71,5	482 / 59,6

Из представленных данных видно, что в стадах крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Беларусь в этиологической структуре вирусных респираторных инфекций основное место принадлежит вирусам ИРТ, ВД и ПГ-3.

Полученные результаты по распространению вирусов ИРТ, ВД, ПГ-3 среди коров свидетельствуют о широком распространении данных возбудителей среди воспроизводящего поголовья. Тем самым инфицированные животные способствуют перезаражению новорожденных телят еще в раннем пренатальном периоде развития. Это приводит к массовым вспышкам пневмоэнтеритов телят, особенно при возникновении каких-либо нарушений в кормлении, содержании животных, стрессовых ситуациях.

В табл. 2 представлены результаты диагностических исследований биологического материала при диагностике на вирусные энтериты.

Таблица 2. Результаты диагностических исследований телят

на вирусно-бактериальные энтериты

Инфекция	Вид материала	Количество проб	Положительные пробы, %
вирусная диарея	сыворотка крови от переболевших телят	1270	64,8
фекалии	574	35,1
ротавирусная	сыворотка крови от переболевших телят	1165	90,9
фекалии	492	67,4
коронавирусная	сыворотка крови от переболевших телят	1165	80,6
фекалии	492	33,7
колибактериоз	патологический материал	152	42,4
псевдомоноз	патологический материал	152	5,8
сальмонеллез	патологический материал	152	1,9
стафилококкоз	патологический материал	152	7,7

Анализ результатов диагностических лабораторных исследований показал, что при серологическом исследовании антитела к вирусу диареи выявлялись у 64,8% обследованных переболевших энтеритами телят из хозяйств, в которых отмечались массовые заболевания телят энтеритами, к ротавирусу – 90,9%, коронавирусу – 80,6%. У больных энтеритами телят установлено наличие антигенов ротавирусов у 67,4% от обследованных животных, коронавирусов – у 33,7%, вируса диареи - у 35,1%.


^ Состояние иммунной системы и обмена веществ у телят при вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекциях

Переболевание телят вирусными респираторными и желудочно-кишечными инфекциями сопровождалось значительным угнетением клеточного и гуморального звеньев иммунной системы. Наиболее характерным являлось уменьшение количества Т-лимфоцитов (в 1,2 раза меньше, чем у клинически здоровых), В-лимфоцитов ( в 1,28 раза), фагоцитраной активности нейтрофилов периферической крови (в 1,23 фагоцитраное число и 1,56 - фагоцитарный индекс).

Изучение состояния гуморального иммунитета показывает, что в 2,7 раза снижается количество лизоцима, в 1,3 раза бактерицидная активностьт сыворотки крови, 1,6 раза титр интерферона, в 4,3 раза увеличивается количество циркулирующих иммунных комплексов. Кроме того, отмечен повышенный титр противирусных антител. К вирусу ИРТ у больных телят он был в 2,5 раза выше, чем у здоровых, к ПГ-3 в 2,53 раза.

Наряду с изменениями в иммунной системе переболевание телят вирусными респираторными инфекциями сопровождалось значительными изменениями в белковом, азотистом, углевордном, липидном и пигментном обменах организма животных при респираторных инфекциях. Содержание низкомолекулярных азотистых веществ (мочевины, креатинина и мочевой кислоты) в сыворотке крови у больных и переболевших телят превышало уровень здоровых животных в 1,2-2,2 раза. Это взаимосвязано с повышенным содержанием циркулирующих иммунных комплексов (в 4,3 и 5 раз выше чем у здоровых), которые воздействуют на фильтрующую способность почечных канальцев. Концентрация биллирубина в крови у больных и переболевших телят была в 1,3-1,5 раза выше, чем у здоровых, а концентрация глюкозы в 1,23-1,27 раза и липидов в 1,1-1,47 раза ниже. Была повышена активность аспартатаминотрансферразы в 3,14 (у больных) и в 3,2 раза (у переболевших), аланинаминотрансферразы соответсвено 2,7 и 5,09 раза; креатининкиназы в 4,6 и 1,8 раза, понижена активность амилазы в 1,05 и 1,16 раза, щелочной фосфатазы в 1,73 и 1,6 раза, холинэстеразы в 1,28 и 1,05 раза. Значительные изменения отмечены и при изучении минерального обмена - у больных ОРЗ телят отмечено повышение концентрации меди в 1,23, калия в 1,13 раза, снижение концентрации кальция в 1,07 раза, железа в 1,72 раза, цинка в 1,4 раза.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при переболевании респираторными и желудочно-кишечными заболеваниями в патологический процесс вовлекаются не только органы дыхания и пищеварения, но и угнетаются основные звенья иммунитета, обмена веществ, а также поражаются жизненноважные системы организма теленка - сердечно-сосудистая и выделительная.