Хламидиоз
| Вид материала | Документы |
- Лекции по дерматовенерологии к элективному курсу «Инфекции, передающиеся половым путем», 28.12kb.
- Урогенитальный хламидиоз: клинико-иммунологическая характеристика, иммуногенетические, 872.18kb.
- Книга посвящена актуальным вопросам гинекологии, венерологии и урологии. Освещены наиболее, 71.68kb.
- Влияние скэнар-терапии на течение беременности, родов, состояние новорожденного и ребенка, 146.76kb.
- 18 февраля в Республике Беларусь проводится День профилактики инфекций, передающихся, 16.66kb.
^ Диагностика хламидий на культуре клеток МсСоу
Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким является метод диагностики хламидий путем изоляции возбудителя на культуре клеток, обработанных различными антиметаболитами (“золотой стандарт”) Для этой цели обычно используют чувствительную культуру клеток, обработанную циклогексимидом. Чувствительность культурального метода по сравнению с ПЦР составляет 70-80%, но в то же время он превосходит молекулярно-биологические методы диагностики по специфичности. В литературе описаны случаи выявления хламидий трахоматис методом ПЦР при отрицательных результатах культурального теста и наоборот.
^ Показаниями для диагностики хламидийной инфекции этим методом являются:
1 Беременность с отягощенным акушерским анамнезом.
2. Оценка эффективности проведенного антибактериального лечения.
3. Выявление чувствительности и резистентности к антибактериальным
препаратам.
4. Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных или лиц со вторичными иммунодефицитными состояниями (онкологические больные после проведенных курсов лучевой и химиотерапии, трансплантации костного мозга; лица, получающие иммунодепрессанты; больные вирусным гепатитом и туберкулезом).
5. Бесплодие неясного генеза.
6. Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта.
Культуральный посев является референс-методом при оценке эффективности антибактериального лечения. При исследовании биопроб методом ПЦР после курса химиотерапии в некоторых случаях можно получить “ложноположительные с клинической точки зрения” результаты. Это связано с тем, что невозможно однозначно оценить жизнеспособность и патогенность микробной клетки на основании выявления фрагмента ее генома, используя только данные молекулярно-биологических методов. В этом случае при исследовании клинического материала с помощью культурального посева микробные клетки, потерявшие эти важные с клинической точки зрения свойства, не дадут роста в клеточной культуре.
Для транспортировки и хранения клинического материала используют специальную питательную среду (транспортная среда). Она разливается в пенициллиновые флаконы по 1 мл и хранится при температуре + 4 ° С (в общей камере бытового холодильника) в течение 2-х месяцев. Состав транспортной среды: среда MEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотика гентамицина концентрации 50 мкг/мл .
Клинический материал после перенесения в транспортную среду хранится в общей камере холодильника при температуре + 4 ° С и, в течение двух суток должен быть доставлен в лабораторию.
Процедура посева
1. Обработка однодневной клеточной культуры МсСоу 1% раствором ДЕАЕ декстраном в течение 30 минут.
2. Заражение обработанных клеток материалом, полученным от больных.
3. Центрифугирование зараженных клеток при 2500 g в течение 45 минут.
4. Отмывка клеток питательной средой.
5. Добавление к клеткам ростовой среды, содержащей циклогексимид.
6. Инкубирование клеток в течение двух суток при +36 ° С.
7. Обнаружение хламидий в клетках методом прямой иммунофлюоресценции или ПЦР.
Реальный срок получения результатов этим методом - семь дней.
В настоящее время в литературе растет число сообщений о случаях резистентности хламидий к антибактериальным препаратам (эритромицину, тетрациклину, доксициклину, фторхинолонам). Ценность культурального метода состоит в том, что он является пока единственным методом, позволяющим выбрать антибактериальный препарат для лечения хламидийной инфекции и оценить эффективность антибактериальной терапии.
^ Схема метода выявления устойчивости хламидий трахоматис к антибактериальным препаратам
-Хламидийным изолятом, выделенным от больного при посеве, заражают чувствительные клетки.
-К зараженным клеткам добавляют ростовую среду, содержащую антибиотик.
-Зараженные клетки инкубируют 5 дней при температуре + 36 ° С.
-Чувствительность хламидий к антибиотику определяется по подавлению инфекции в зараженных клетках. Процедура длительная, занимает по времени две недели.
^ Приготовление питательных сред:
1). Ростовая среда: среда Игла без глютамина - 400 мл, 3% глютамин -5 мл, эмбриональная сыворотка теленка 4% от общего объема, гентамицин - 40 мкг/мл.
2). Изолирующая среда (среда с антибиотиками для заражения клеток клиническим материалом): среда Игла без глютамина - 400 мл, 3% глютамин -5 мл, эмбриональная сыворотка теленка 8% от общего объема, гентамицин - 40 мкг/мл, 10% глюкоза - 5 мл.
3). Транспортная среда (для забора и хранения клинического материала): фосфатный буфер с сахарозой (сахароза 48,46 г., К2НР04 (б/в) - 2,088 г., КН2Р04 (б/в) - 1,088 г. на 1 л дистиллированной воды, довести рН до 7,0). Разлить по аликвотам и автоклавировать при 115°С15 мин.
Хранить при 4° С до применения 1-2 мес.
Перед использованием к буферному раствору добавляют инактивированную нагреванием сыворотку крупного рогатого скота - 4% от общего объема, стрептомицин - 50 мкг/мл, амфотерицин В - 25 мкг/мл среды.
В качестве транспортной среды можно так же использовать ростовую среду, к 100 мл которой вносят 1 мл 5% глюкозы, и вышеуказанные антибиотики в соответствующей концентрации.
Транспортную среду стерильно разливают по 2 мл в пенициллиновые флаконы с бусинками и хранят при 20°С в течение месяца.
Инокуляция клинического материала:
Готовят раствор циклогексимида на изолирующей среде - 2 мкг/мл. В стерильные плоскодонные пробирки с помещенными в них покровными стеклами добавляют по 2 мл клеточной суспензии (1х105 клеток/мл) и ставят их на 16-24 часа в термостат при 37оС.
В пенициллиновые флаконы с транспортной средой, содержащей клинический материал, при интенсивном встряхивании добавляют 2 мл свежеприготовленной изолирующей среды. В это время из пробирок с монослоем удаляют ростовую среду, не разрушая монослоя. Затем распределить изолирующую среду из пенициллиновых флаконов с инфекционным материалом приблизительно по 2 мл в две плоскодонных пробирки с монослоем и центрифугировать их в течение часа при 3000 об/мин (2400) в центрифуге с горизонтальным ротором. Инкубировать в термостате при 37°С - 2 часа, затем удалить изолирующую среду и добавить по 2 мл новой порции изолирующей среды с циклогексамидом (2 мкг на мл). Материал инкубируется в термостате при 37°С 48-72 часа.
Фиксация и окраска:
Удалить среду из пробирок, не нарушая монослоя, добавить 1-2 мл метанола, осторожно по стенке, фиксировать в течение 10 мин осторожно потряхивая пробирку для ресуспензирования белкового осадка. Промыть фосфатным буфером (рН 6,8).Приготовить краску по Романовскому-Гимза на фосфатном буфере 1:10 (1 часть краски и 9 частей фосфатного буфера). Прилить по 1 мл краски в каждую пробирку, через 30-60 мин удалить ее и дифференцировать препарат 30% метанолом на фосфатном буфере. Стекла высушить. Монтировать на предметное стекло покровные стекла монослоем вниз в канадском бальзаме.
Просматривать в темнопольном микроскопе на присутствие включений при увеличении в 400 или 600 раз. В темном поле включения хламидий дают желто-зеленую флюоресценцию. В сомнительных случаях рекомендуется исследовать в световом микроскопе под иммерсией с объективом х 90.
Элементарные тельца хламидий имеют розовый цвет, а ретикулярные - синий цвет.