Микозы. Этиология, патогенез и клиническая картина микозов чрезвычайно разнообразны, однако практически во всех случаях этих заболеваний в патологический процесс вовлекается кожа

Вид материала

Документы

Содержание Методы лабораторной диагностики Организация работы микологической лаборатории Взятие патологического материала Микроскопическое исследование Культуральное исследование

Подобный материал:

• Тематический план лекций по внутренним болезням для студентов IV курса педиатрического, 34.59kb.
• Темы рефератов по курсу «Медицинская энтомология» (весенний семестр 2011 года), 30.27kb.
• Тематический план лекций по внутренним болезням для студентов Vкурса медико биологического, 32.86kb.
• «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им акад. И. П. Павлова», 252.91kb.
• Клиническая ординатура по смп вопросы для заключительного экзамена, 198.95kb.
• Расписание занятий на элективе для студентов 6 курса «Клиническая аллергология», 41.99kb.
• Методические рекомендации для практического занятия №10, 101.99kb.
• Атеросклероз: эпидемиология, факторы риска, этиология, патогенез, клиника и диагностика, 225.03kb.
• Микозы стоп. Кандидоз, 20.32kb.
• Острая дыхательная недостаточность. Классификация. Этиология и патогенез, 365.13kb.

^

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

Клиническая картина грибковых заболеваний кожи весь­ма полиморфна, поэтому во всех случаях диагноз должен быть подтвержден лабораторными методами исследования. Для лабораторной диагностики микозов используют микроскопический, люминесцентный, культуральный, иммунологический (аллергологический и серологический) методы иссле­дования, а также эксперименты на животных.

Лабораторная диагностика микозов складывается из не­скольких этапов. В обычной клинической практике обычно ограничиваются микроскопическим и культуральным иссле­дованием зараженного материала. При необходимости эти методы дополняются иммунологическими, гистологическими исследованиями, заражением экспериментальных животных. При некоторых микозах кожи важную вспомогательную роль в диагностике играет люминесцентный метод.

^ ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ МИКОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Устройство и режим работы микологической лаборатории должны обеспечивать предупреждение рассеивания патологического материала в окружающей среде, чтобы избежать заражения, аллергизации и распространения инфекции сре­ди сотрудников и больных.

Лаборатория должна иметь определенный набор поме­щений, включая комнату (или специально оборудованное место) для приема и регистрации анализов, бокс-посевную для посева и работы с культурами, комнату с автоклавами для стерилизации и уничтожения патологического материа­ла и культур, моечную, препараторскую, кладовую, гардероб для одежды, туалет. Пол и стены помещений, где проводится лабораторная диагностика микозов, должен выдерживать мытье дезинфицирующими растворами. Лаборатория уком­плектовывается легко подвергающейся дезинфекции мебе­лью, включая шкафы для чистой лабораторной посуды, реак­тивов, питательных сред; соответствующим оборудованием и инструментами.

Для работы необходимы спиртовка или газовая горелка, микробиологические петли, микологические лопаточки, шпатели, эпиляционные ланцеты, маникюрные кусачки, скальпе­ли, ножницы, ложечки Фолькмана, пипетки разные, пастеров­ские пипетки, иглы препаровальные, стеклянные палочки, шприцы, низкоскоростная центрифуга, аппарат для встря­хивания, чашки Петри, пробирки, стеклянная посуда, ультра­фиолетовая лампа Вуда с фильтром, микроскопы, осветители, термостаты, автоклавы, холодильники, сухожаровые шкафы, бактерицидные лампы.

Для работы с патологическим материалом и культурами грибов лабораторные столы следует покрывать стеклами с частично окрашенной в черный цвет обратной стороной: на черном фоне лучше видны обычно светлые культуры грибов, а также мелкие частицы исследуемого материала. Часть стекла окрашивается в белый цвет, так как на белом фоне хорошо видны оттенки пигмента у исследуемых колоний. Иногда для этих целей под стекла подкладывают листы чер­ной и белой бумаги.

Воздух в лаборатории стерилизуют дезинфицирующими аэрозолями или ультрафиолетовыми лучами. Водопровод и система подачи газа должны быть всегда исправны. Необхо­димо достаточное количество дезинфицирующих средств. Пол, рабочие столы в помещениях, где производится работа с патологическим материалом, ежедневно убираются влажным способом с применением дезинфицирующих средств (5% раствор хлорамина, 5% осветленная хлорная известь). Тер­мостаты еженедельно протирают 0,5% хлорамина; стены об­рабатывают дезрастворами 1 раз в месяц. Стерилизацию по­суды и инструментов горячим воздухом в сухожаровых шка­фах производят при 180 °С в течение 60 мин. Необходимо помнить, что любой изучаемый материал потенциально опа­сен. Поэтому взятие патологического материала следует про­изводить в специальной комнате с помощью инструментария, в халатах и масках. Одежду больного при взятии материа­ла защищают клеенчатой пелериной и салфеткой. Взятие ма­териала с ног производят на специальной скамейке, покры­той клеенкой. Пелерины, салфетки после каждого исполь­зования обеззараживают кипячением в течение 15 мин или погружением в дезинфицирующий раствор (5% раствор хлорамина на 3 ч или 5% осветленную хлорную известь на 2 ч). Патологический материал или культуру переносят в специальной таре (металлические или пластмассовые ящики с крышками, биксы), которую внутри и снаружи ежедневно обрабатывают дезинфицирующими растворами.

Все посевы производят вблизи огня спиртовки или газо­вой горелки с обжиганием инструмента и краев пробирки. Засеянные пробирки и другие емкости должны иметь четкие надписи с указанием даты посева, номера анализа, вида и штамма возбудителя.

Загрязненные пипетки, шпатели, предметные и покровные стекла обеззараживают погружением в 5% раствор фенола, 5% раствор лизола на 30 мин или в 5% раствор хлорами­на, 5% раствор осветленной хлорной извести на 2 - 3 ч, затем моют. Патологический материал (кусочки тканей, чешуйки кожи, ногтей) и отработанные культуры грибов автоклавируют при 2 атм / 132 / 20 мин, при 1,5 атм / 126 / 30 мин; либо кипятят 1 ч в воде или 30 мин в 1% мыльно-содовом растворе.

^ ВЗЯТИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от правильного взятия патологического материала. Поскольку грибы способны поражать различные органы че­ловека, при подозрении на микоз необходимо исследовать различный патологический материл. В дерматологической практике чаще всего приходится иметь дело с микозами, при которых исследованию на грибы подлежат кожные чешуйки, волосы, ногти. При подозрении на глубокие и системные микозы может возникнуть необходимость лабораторной диа­гностики на грибы мокроты, промывных вод, мочи, фекалий, гноя, отделяемого слизистых оболочек, крови, кусочков орга­нов и биопсированной ткани.

В очагах поражения на коже, из которых предполагается брать патологический материал, за несколько дней или не­дель необходимо прекратить всякое лечение. Следует иметь в виду, что использование слабых дезинфицирующих раство­ров или даже индифферентных средств может помешать ис­следованию. Непосредственно перед забором патологическо­го материала очаг поражения необходимо обработать 96% спиртом или раствором ксилола. Материал лучше всего брать со свежих, но уже полностью развившихся очагов по­ражения. Кожные чешуйки необходимо соскабливать с пе­риферии очагов, грибы здесь встречаются чаще всего как в виде мицелия, так и спор. Кожные чешуйки снимаются скальпелем, корочки - эпиляционным пинцетом. Наряду с чешуйками желательно забирать небольшую часть прилега­ющей к очагу поражения здоровой кожи, так как в этих на внешний вид нормальных участках можно обнаружить боль­шое количество элементов гриба. При дисгидротических вы­сыпаниях для анализа следует использовать покрышки пу­зырьков и крупные, с трудом отделяющиеся чешуйки на гра­нице очагов поражения и здоровой кожи. Поверхностные корочки и чешуйки в центре кольцевидных высыпаний мало пригодны для исследования, так как элементы грибов здесь имеются непостоянно и их бывает трудно отличить от фраг­ментов жирового распада тканей. Скутулы при фавусе удоб­нее брать эпиляционным пинцетом, они очень богаты гриба­ми во всех своих частях. В случаях подозрения на грибко­вое поражение пушковых волос, их необходимо извлекать эпиляционным пинцетом по возможности вместе с чешуй­кой. Грубые роговые массы с подошв срезают скальпелем или лезвием безопасной бритвы.

У больных микозами волосистой части головы поражен­ные волосы извлекают эпиляционным пинцетом. Для исследования необходимо брать короткие, перекрученные, изогну­тые в виде дуги или запятой, а также длинные, но покрытые чехлом в основании, волосы. При подозрении на фавус необ­ходимо помнить о том, что волосы не обламываются, но ста­новятся тусклыми, безжизненными, седоватыми. Там, где обломанные волосы плохо видны невооруженным глазом, нужно пользоваться лупой и собирать с очагов поражения чешуйки, поскольку коротко обломанные волосы могут иметь вид едва заметной черной точки, заложенной в толще роговой чешуйки. Если пораженные волосы имеют вид черных точек, то их извлекают на поверхность кожи или острым концом скальпеля, или препаровальной иглой.

Пораженные волосы, взятые для микроскопического ис­следования, желательно разложить на предметном стекле на фоне черной бумаги. В этом случае они резко отличаются от здоровых волос серым и тусклым цветом.

При взятии материала необходимо исследовать каждый, даже маленький очаг облысения, особенно у взрослых, так как грибковое поражение на голове у них нередко сочетает­ся с мелкими участками рубцовой алопеции.

У больных с инфильтративно-нагноительной формой ми­коза волосистой части головы и области роста бороды и усов (kerion, паразитный сикоз) очаги поражения часто покрыты массивными корками. В этих случаях отдельные поражен­ные волосы выявить трудно, они чаще встречаются в свежих высыпаниях, по краю очагов поражения, в более глубоких от­делах кожи. Нередко они выталкиваются из волосяных фолликулов вместе с гноем при надавливании на очаг пора­жения. Волосы желательно брать вместе с гноем, затем по­местить на чашку Петри, часовое или предметное стекло, и отделить волос от гноя.

Соскобы с поверхностных очагов пораженных ногтевых пластинок делают скальпелем, утолщенные ногтевые пластинки срезают скальпелем или маникюрными кусачками;

подногтевой гиперкератоз можно получить с помощью пре­паровальной иглы. Для взятия материала из глубоких сло­ев через «окошечко» в ногтевой пластинке иногда пользуются бормашиной. При паронихиях необходимо брать гной из-под ногтевых валиков; при отсутствии гноя — соскабливать материал с соприкасающихся поверхностей ногтевой плас­тинки и валиков.

Жидкий патологический материал собирают асептично в стерильную посуду, чешуйки кожи, ногтя и волосы – на листочки простой или мягкой пергаментной бумаги.

Отделяемое со слизистых оболочек для посева берут тампоном из гигроскопической ваты, который затем помеща­ют в сухую стерильную пробирку или пробирку с 2 мл пи­тательной среды (сусло Сабуро). Материал со слизистых оболочек рта и зева берут вначале с внутренней поверхнос­ти щек, неба, затем языка, тщательно протирая тампоном спинку и корень, а в заключение – круговым движением из зева. Для микроскопии соскобы налетов беловато-серовато­го цвета со слизистых оболочек берут ложечкой Фолькмана или предметным стеклом. Материал из влагалища получают из заднего свода; с головки полового члена – из области ве­нечной борозды.

Материал из наружного слухового прохода берут петлей или тампоном, который помещают в пробирку.

При необходимости полученный патологический мате­риал доставляют в лабораторию в специальной таре или металлических биксах. Поступивший в лабораторию материал исследуют в течение 1 ч после взятия при хранении в условиях комнатной температуры или не более чем через 3 ч при хранении в холодильнике при температуре 4 °С.

В запаянных пробирках или пипетках жидкий патологи­ческий материал сохраняется до высыхания довольно долго, грибы в волосах и чешуйках, завернутые в бумажные пакеты (типа аптечных порошков), могут сохраняться месяцы и да­же годы.

Кровь для исследования на грибы берут из локтевой вены в количестве 5 – 10 мл и вносят сразу с колбочку с жидкой питательной средой или равным количеством цитрата натрия.

При необходимости исследования на грибы биопсийного материала его помещают в стерильную чашечку Петри и используют для микроскопии, посевов на питательные среды и приготовления гистологических препаратов.

^ МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Микроскопическое исследование патологического мате­риала на грибы производят в нативных и окрашенных препаратах. Для приготовления неокрашенных препаратов по­лученный материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерацию) материала. С этой целью прибегают к помощи различных веществ, чаще всего едкой щелочи (КОН, NaOH), которые растворяют эпидермальные чешуйки, слизь, гной, просветляют пигмент волоса и тем са­мым делают грибы доступными для исследования.

На размягченные чешуйки кожи или ногтя, которые по­мещают на середину предметного стекла, наносят 1-3 капли 20 - 30% раствора КОН (NaOH). Исследуемый материал в каплях щелочи осторожно подогревают над пламенем спир­товки до появления нежного белого ободка из кристаллов щелочи по периферии капли. Подогревать до кипячения не следует. После подогревания каплю накрывают покровным стеклом, избегая попадания пузырьков воздуха. Подогрева­ние препаратов после наложения покровного стекла не реко­мендуется. Приготовленные препараты длительному хране­нию не подлежат. Их лучше всего исследовать в течение 2 ч с момента приготовления, так как после этого наступает глу­бокое разрушение тканей или выпадают кристаллы щелочи. Р. А. Аравийский и Г. И. Горшкова (1995) рекомендуют про­светленные и накрытые покровным стеклом препараты кож­ных чешуек и волос оставлять на 5 - 10 мин, а ногтевых пластинок – на 30 - 40 мин до микроскопирования.

Просветление препаратов можно проводить без подогре­вания, для этого их оставляют в 20% растворе КОН на 30 - 60 мин или используют другие методы просветления патоло­гического материала: хлораллактофенолом по Аману; лактофенолом; раствором, содержащим по 15% диметилсульфоксида и КОН в воде. Хорошие результаты получают пос­ле просветления ногтевых пластинок, помещенных в 5% рас­твор КОН на 24 ч, подогревания в этом случае не требуется.

Микроскопическое исследование производят на обычном лабораторном микроскопе без иммерсии. Конденсор микроскопа должен быть опущен, диафрагма сужена. В начале препарат находят на стекле при малом увеличении (40х), последующее исследование производят при большем увели­чении (100х); детально препарат изучают при увеличении 400х. Необходимо исследовать несколько препаратов с тем, чтобы увеличить надежность анализа и избежать ложноположительных результатов.

Ошибки в микроскопической диагностике грибов могут возникнуть в связи как с дефектами приготовления препара­та, так и с недостаточной опытностью лаборанта.

Дефекты изготовления прежде всего бывают связаны с перегреванием препарата, что может привести к выпадению кристаллов щелочи, разрушению волоса и появлению мелко­зернистого распада в патологическом материале. Линейное расположение удлиненных ровных кристаллов щелочи весь­ма напоминает нити септированного мицелия даже на чис­том стекле без патологического материала. Кроме того, оби­лие кристаллов щелочи препятствует выявлению гриба в глубоко лежащих слоях патологического материала. Диф­ференциально-диагностическими признаками являются ис­ключительное однообразие кристаллов, их стекловидная про­зрачность, многогранность краев и отсутствие неразрывной связи одного элемента с другим. В сомнительных случаях рекомендуется добавить к препарату капельки слегка подо­гретой дистиллированной воды, которые быстро растворяют кристаллы щелочи.

За элементы гриба ошибочно могут быть приняты капель­ки жира, пузырьки воздуха, хлопчатобумажные нити одежды и так называемый «мозаичный грибок».

Липиды кожных покровов, жировой распад клеток и зер­на кератогиалина, особенно имеющие правильную форму, могут напоминать отдельные споры гриба. Но разнообразие формы и, главное, размеров, отсутствие внутренней структуры образований (вакуоли, оболочки) говорят против грибковой природы данных элементов. Липиды также могут попасть в препарат при взятии патологического материала с недоста­точно очищенного очага поражения.

Пузырьки воздуха могут напоминать споры дрожжеподобных клеток, но в отличие от последних они окружены плотной темной оболочкой, и даже самые маленькие пузырь­ки воздуха всегда больше клеток гриба.

Нити от ткани носков, одежды и т. п. обычно лежат от­дельно от патологического материала, они всегда больше гифов, грубее и не септированы.

«Мозаичный грибок» представляет собой артефакт, кото­рый возникает в процессе кристаллизации (возможно, за счет распада холестерина). Он имеет вид сеточки или петель, очертания которых соответствуют границам роговых чешуек, в отличие от нитей мицелия он никогда не пересекает стен­ки клеток эпидермиса.

В некоторых лабораториях просветление препаратов для микроскопического исследования проводят 15 - 30% раство­ром КОН, в который добавляют 5 - 10% коммерческих тем­но-синих чернил фирмы Паркер (Parker's Superchrome Blue-Black Ink). При этой окраске гифы и споры окрашива­ются в голубой цвет.

^ КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Культуральное исследование является высокочувстви­тельным и специфическим методом лабораторной диагности­ки микозов. Его необходимо производить независимо от ре­зультатов микроскопии, так как культуральный метод позво­ляет иногда выявлять возбудителя при отрицательных данных микроскопии; он дает возможность определять род и вид возбудителя и, следовательно, проводить адекватную те­рапию и профилактику заболевания. Особенно полезен культуральный метод для диагностики латентных форм ми­козов, носительства дерматофитов здоровыми людьми.

Перед посевом патологического материала его расщепля­ют на предметном стекле на мелкие кусочки, 5 - 6 из них переносят на поверхность косого агара и располагают на расстоянии 1 - 2 см один от другого. Материалом одной про­бы засевают не менее 2 - 3 пробирок (волосы) или 4 - 5 про­бирок (кожные и ногтевые чешуйки). Для первичной изоля­ции дерматофитов лучше всего пригодны стандартная агари-зированная среда Сабуро с 2 - 4% глюкозы или сусло-агар, содержащие антибиотики (пенициллин 50 мкг/мл + стреп­томицин или биомицин (50 мкг/мл и 200 мкг/мл соответст­венно) и антидрожжевой антибиотик актидон (циклогексамид) 0,1 - 0,5 мг/мл. Актидон не влияет на рост дермато­фитов и подавляет многие плесневые грибы, а также виды Candida и Cryptococcus [Аравийский Р. А., Горшкова Г. И., 1995].

Посев производят в боксе над пламенем газовой или спиртовой горелки платиновой петлей, микологическим крючком или лопаточкой из нихрома. Держа пробирку в ле­вой руке, охватывают ее над пламенем горелки, захватывая пробку мизинцем правой руки, которой одновременно дер­жат петлю. Прокаленную докрасна петлю остужают и одно­временно увлажняют прикосновением к поверхности среды в стороне от места предполагаемого посева. Затем берут час­тицу материала и наносят на поверхность агара. Пробирку закрывают пробкой, предварительно обожженной над пламе­нем. Так же производят пересев из пробирки в пробирку.

Аналогичным образом производят посев на чашку Пет­ри. Необходимо, чтобы имеющаяся в ней среда как можно меньше соприкасалась с окружающим воздухом, поэтому крышку следует приподнимать настолько, чтобы в нее сво­бодно могла пройти только петля с патологическим материа­лом.

Посевы инкубируют при 22 - 30 °С (лучше всего 28 °С). Появление роста дерматофитов отмечается с 4-го по 12-й день инкубации в точках посева по краям внесенного мате­риала. При отсутствии роста в течение 30 дней результаты культивирования считаются отрицательными. В оптимальных условиях первичные культуры многих дерматофитов можно идентифицировать на 7 - 10-й день после посева, но следить за посевами нужно в течение 20 - 30 дней. Первич­ные культуры растут сравнительно медленно, при появлении роста в первичным посеве необходимо произвести отсев от края колонии на свежую дифференциальную среду для по­лучения чистой культуры, которая будет служить материа­лом для идентификации выделенного дерматофита.