Тема: Микробиологическик и молекулярно-биологические основы химиотерапии инфекционных заболеваний. Антибиотики. Принцип рациональной антибиотикотерапии

Вид материала

Содержание

Задания для самостоятельной работы студентов
А Рис. Г. Флори Рис. З.Ермольева нтибиотики –
Вещества, чтобы быть антибиотиками должны обладать следующими свойствами
2. Не инактивироваться под действием как макро- так и микроорганизма. 3
По происхождению
10. Полиеновые антибиотики
Антагонистическое взаимодействие
По механизму биологического действия
2. Нарушающие функции ЦПМ
3. Ингибирующие синтез белка на рибосомах
4. Ингибирующие синтез нуклеиновых кислот (РНК и ДНК)
Лекарственная устойчивость микроорганизмов
Приобретенная устойчивость
1. Модификация (изменение структуры) мишени действия
3. Активное выведение антибиотика из клетки
5. Формирование метаболического «шунта»
Возбудители внебольничных инфекций и лекарственная устойчивость
Возбудители нозокомиальных инфекций
Механизмы резистентности к противогрибковым препаратам
Оценка чувствительности к противогрибковым препаратам
...
Полное содержание

Подобный материал:

ЗАНЯТИЕ № 15

Тема: Микробиологическик и молекулярно-биологические основы химиотерапии инфекционных заболеваний. Антибиотики. Принцип рациональной антибиотикотерапии

Цель занятия: Ознакомиться с химио- и антибиотикотерапией инфекционных заболеваний. Изучить методы определения чувствительности микробов к антибиотикам: метод дисков и метод серийных разведений. Определить чувствительность золотистого стафилококка к антибиотикам методом дисков.

План занятия

Общая характеристика химиопрепаратов.
Понятие «антибиотик», основные источники получения антибиотиков. Природные, полусинтетические и синтетические антибиотики.
Требования, предъявляемые к антибиотикам, классификация антибиотиков по происхождению, химическому строению, спектру действия.
Механизмы действия антибиотиков на микроорганизмы.
Лекарственная устойчивость бактерий, механизмы и пути распростронения.
Рациональные пути профилактики формирования резистентных штаммов и преодоления сформировавшейся микробной устойчивости.
Побочное действие антибиотиков.
Методы определения чувствительности микробов к антибиотикам (диско-диффузионный метод, метод серийных разведений, молекулярно-генетическая диагностика).

Задания для самостоятельной работы студентов

Задание №1

Изучить демонстрационный набор препаратов антибиотиков и распределить их в зависимости от механизма действия.

Задание №2

Провести определение чувствительности к антибиотикам методом дисков. Определить по демонстрационным посевам чувствительность микробов к антибиотикам диско-диффузионным методом.

Рис. Определение чувст-виительности к антибио-тикам на агар Мюллер-Хинтон
Для этого на плотных питательных средах сплошным газоном произведен посев изучаемой культуры, на поверхность которой наложены диски с антибиотиками. Результаты оцениваются после суточной инкубации в термостате. Точное измерение диаметра зон торможения роста является чрезвычайно важным при определении чувствительности к антибиотикам с помощью метода дисков. Возможно использование прибора для бесконтактного измерения ( нет необходимости открывать чашку Петри) зоны торможения роста с точностью до 0,1мм за 10сек (рис.)

П

ри наличии антибиотикочувствительности вокруг диска есть зона задержки роста не менее 15 мм в диаметре.

Полученные данные занести в таблицу.

Задание №4

Определить чувствительность эпидермального стафилококка к ампициллину методом серийных разведений.

Б
Прибор для автоматичес-кого измерения зон задержки роста бактерий
ыли приготовлены серийные разведения антибиотика в пробирках с МПБ. В каждую пробирку внесено определенное количество стафилококка. После суточной инкубации в термостате определить наличие или отсутствие роста бактерий по степени прозрачности бульона. Определить минимально подавляющую концентрацию (МПК) и рассчитать терапевтическую дозу. Данные внести в таблицу:

Таблица. Схема метода серийных разведений.

№ п/п	Разведение антибиотика	Концентрация антибиотика ЕД/мл	Исследуемая культура, мл	Рост бактерий (помутнение среды)
1	1:100	100	0,1	-
2	1:200	50	0,1	-
3	1:400	25	0,1	-
4	1:800	12,5	0,1	-
5	1:1600	6,25	0,1	+
6	1:3200	3,12	0,1	+
7	1мл бульона без антибиотика (контроль)	-	0,1	+

«+» - рост бактерий, «--« - отсутствие роста

МПК – наименьшая концентрация антибиотика, в присутствии которого угнетается видимый рост микробов. Терапевтическая доза в 2-4 раза выше МПК.

Задание №5

Определение содержания антибиотика в сыворотке крови больного.

Методика: берется два ряда пробирок. В первом ряду разводится исследуемая сыворотка, к которой добавляют среду с глюкозой и индикатором феноловым красным и стандартизованную взвесь стафилококка в концентрации 1000 м.к./ мл для определения наибольшего разведения сыворотки, задерживающее рост тест-микроба. Во втором ряду готовят разведения стандарта антибиотика (ампициллина), к которому добавляют те же ингредиенты, что и в первый ряд с целью определения наименьшей концентрации антибиотика, дающего отсутствие роста стафилококка.

Для установления концентрации антибиотика в сыворотке больного необходимо умножить полученную МПК ампициллина на наибольшее разведение сыворотки, задерживающее рост тест-микроба.

Дополнительный материал

Антибиотики.

А
Рис. А. Флеминг

Рис. Э. Чейн
лександром Флемингом в 1929 году было доказано, что плесневые грибы рода Penicillium обладают бактерицидными свойствами. И по праву А.Флеминг считается основателем учения об антибиотиках. В 1940 году Эрнест Чейн и Говард Вальтер Флори получили стабильную форму пенициллина в Оксфорде (1940 год, Э.Чейн – пенициллин имеет форму В-лактама. 1943 год - Г.Флори и фирма «Мерк» в США запустили производство пенициллина.

Отечественный ученый З.В. Ермольева получила пенициллин в 1942 году. Начиная с 1940 года по 1960 год были открыты стрептомицин, эритромицин, нистатин, леворин, канамицин и многие другие антибиотики.

А
Рис. Г. Флори

Рис. З.Ермольева
нтибиотики – это химиотерапевтические препараты из химических соединений биологического происхождения (природные), а также их полусинтетические производные и синтетические аналоги, которые в низких концентрациях оказывают повреждающие или губительное действие на микроорганизмы и опухоли.

Вещества, чтобы быть антибиотиками должны обладать следующими свойствами:

1. Убивать или подавлять рост и размножение возбудителя как можно в более низких концентрациях (10-30 мкг/мл) и как можно в меньшие сроки, микроорганизмы не должны приобрести устойчивость быстрее, чем антибиотик подавит их размножение.

2. Не инактивироваться под действием как макро- так и микроорганизма.

3. Не приносить вред макроорганизму.

4. Не обладать имммунодепрессивным действием.

Классификации антибиотиков

По происхождению:

1. Природные (нативные антибиотики – получаемые из естественных продуцентов):

а) производные бактерий – полимиксины, грамицидин;

б) производные актиномицетов – стрептомицин, тетрациклины, циклосерин, нистатин, леворин и т.д.;

в) производные грибов – пенициллины, цефалоспорины;

г) животного происхождения – лизоцим, интерферон, эктерицид – из рыбьего жира;

д) растительного происхождения – фитонциды лука, чеснока, хвойных деревьев.

2. Полусинтетические антибиотики – получаемые путем присоединения к природному антибиотику каких-либо химических радикалов.

3. Синтетические антибиотики – получаемые путем чисто химического синтеза.

По химическому составу:

1. -лактамные антибиотики (азотсодержащие соединения с -лактамным кольцом):

группа пенициллина;
группа цефалоспоринов.
карбапенемы
Монобактамы

Рис. Структура лактамного кольца

2. Гликопептиды

3. Тетрациклины (состоят из четырех конденсированных бензольных колец с разными радикалами).

4.Аминогликозиды (вещества олигосахаридной или псевдоолигосахаридной природы):

группа стрептомицина;
аминогликозидные антибиотики, содержащие дезоксистрептамин.

5. Макролиды (соединения, содержащие макроциклическое лактонное кольцо).

6. Левомицетины (идентичные природному хлорамфениколу, в состав которого входят нитрофенил, дихлорацетамин, пропандиол).

7. Линкозамиды

8. Рифамицины (соединения с макроциклическим кольцом).

9. Полипептиды

10. Полиеновые антибиотики (имеющие несколько сопряженных двойных связей СНСН).

11. Разные антибиотики.

Химически синтезированные: сульфаниламиды, хинолоны, нитромидазолы, имидазолы, нитрофураны.

По спектру действия:

Спектр антимикробного действия – это диапазон микроорганизмов, которые чувствительны к антибиотику.

действующие на клеточные формы микроорганизмов

Таблица.Сравнительная характеристика спектра действия цефалоспоринов

Поколение	Грам (+)	Грам (-)	Анаэробы
I поколение	+++	+	-
II поколение	++	++	-
III поколение	+	+++	-
IV поколение	+++	++++	+

противогрибковые

противопротозоидные

противовирусные препараты
обладающие противоопухолевой активностью

По типу действия:

1. Микробицидные (бактериоцидные, фунгицидные и т.д.) – вызывают гибель микроорганизма, за счет необратимых повреждений.

2. Микробостатические (бактериостатические) – это антибиотики, которые подавляют рост и размножение микроорганизмов.

Антагонистическое взаимодействие антибиотиков объясняется их механизмом действия на микробную клетку. Беталактамы, ванкомицин и фосфомицин действуют на микроорганизмы только во время митоза и поэтому одновременное назначение бактериостатиков, которые нарушают деление микробных клеток, может лишить бактерицидные антибиотики субстрата, на который направлено их действие. Оптимальной является комбинация двух бактерицидных антибактериальных средств. При сочетании различных антибиотиков бактерицидного типа случаев антагонизма, как правило, не наблюдается. Комбинация бактериостатических и бактерицидных препаратов иногда приводит к их антагонизму.

По механизму биологического действия:

Под механизмом биологического действия антибиотиков понимают те изменения биохимической деятельности клетки или те нарушения путей обмена веществ микроорганизмов, которые приводят в конечном итоге к остановке развития или к полной гибели микроба.

Антибактериальные препараты влияют на бактерии в фазе активного роста и размножения. Они изменяют метаболические процессы бактериальных клеток, но не повреждают готовые структуры покоящихся клеток (исключение с мембранотропным эффектом). Как следствие, опережающее действие на патогенные бактерии при относительно слабом влиянии на нормальную микрофлору. Начало инфекционного процесса сопровождается эффективной колонизацией, что требует от возбудителей быстрого размножения и усиленной метаболической активности. Это повышает уязвимость их перед антимикробными агентами. Лишь длительное применение антибиотиков, поддерживающее их действенную концентрацию в организме, создает угрозу умеренно и малоактивным бактериям.

Отсюда следует важный практический вывод: антибиотики менее эффективны при хронических, чем при острых инфекциях и едва ли полезны при бессимптомном или малосимптомном носительстве болезнетворных бактерий, репликативная активность которых в подобных случаях не отличается от нормофлоры.

Рис. Классификация антибиотиков по механизму биологического действия.

1. Подавляющие синтез клеточной стенки за счет блокирования реакции транспептидирования в синтезе пептидогликана.

А) β-лактамные антибиотики - препятствуют образованию пептидных связей при синтезе клеточной стенки микроорганизмов (последняя стадия синтеза пептидогликана), за счет ингибирования ферментов (транспептидазы и D-пептидазы). Не надо проникать через ЦПМ, так как мишени находятся на наружной поверхности ЦПМ. Эти ферментативные мишени называются PBPs (penicillin-binding protein) – пенициллинсвязывающие протеины.

а) Пенициллины – действуют только на делящиеся формы микробов, не действуют на покоящиеся формы:

Радикал R	Пенициллин	Радикал R	Пенициллин
Природные:		Полусинтетические:
	Бензилпенициллин Феноксиметилпенициллин		Метициллин Ампициллин Оксациллн

1 поколение: природные пенициллины – бензилпенициллин;

2 поколение: пенициллиназоустойчивые полусинтетические пенициллины – метициллин, оксациллин, клоксациллин, нафциллин;
3 поколение: аминопенициллины с расширенным спектром – ампициллин, амоксициллин, циклациллин, ампиокс, амоксиклав, уназин (сульбактам+ампициллин);
4 поколение: карбоксипенициллины – карбенициллин, карфециллин, тикарциллин;
5 поколение: уреидо- и пиперазинопенициллины – азлоциллин, мезоциллин, пиперациллин;
6 поколение: амидинопенициллины – амдиноциллин, темоциллин.

2-6 поколение пенициллинов являются поусинтетическими антибиотиками. 4-6 поколение активны в отношении синегнойной палочки.

Таблица. Химическая структура пенициллинов

б) Цефалоспорины – так же угнетают активность транспептидазы, участвующей в биосинтезе клеточной стенки:

1 поколение: цефалоридин (цепорин), цефалоксин, цефалотин (кефлин), цефазолин (кефзол);
2 поколение: цефкроксим-натрий (кетоцеф), цефамандол, цефаклор (цеклор);
3 поколение: цефтазидим-фортум, цефазидим (модивид), цефотаксим-натрий (клафоран);
4 поколение: цефазафлур, цефотетан, цефокситин.

На поколения делятся в зависимости от широты спектра действия.

в) Карбопенемы (полусинтетические антибиотики): имипенем-циластин (тиенам).

г) Монобактамы: азтреонам.

Б) Циклосерин обладает химическим сходством с D-аланином и по конкурентному принципу угнетает активность ферментов D-аланин-рацемазы и D-аланин-синтетазы, в результате нарушается образование дипептида D-аланин- D-аланин, необходимого для построения пептидогликана.

В) Гликопептиды: ванкомицин, тейкопланин – блокирует полимеризацию пептидогликана.

Г) Фосфомицин – действует на первую стадию полимеризации пептидогликанов, ингибируя пирувилтрансферазу – цитоплазматический фермент, который вовлечен в синтез УДФ-N-ацетилмурамил пентапептидного предшественника (NAMP). Нуждается в проникновении в клетку.

Д) Батитрацин - действует на ранней стадии синтеза пептидогликана.

2. Нарушающие функции ЦПМ:

а) Полимиксины нарушают проницаемость ЦМП, способствуют выделению многих компонентов цитоплазмы в окружающую среду и вызывают последующий лизис микробной клетки: полимиксин М, полимиксин В.

б) Полиеновые антибиотики нарушают проницаемость клеточной мембраны грибов: нистатин, леворин, амфотерицин В.

в) Градимицидин – продуцируемый бактериями рода Bacillus. (применяется тольк местно. Токсичен!).

г) Имидазолы

3. Ингибирующие синтез белка на рибосомах:

а) Аминогликозиды (влияют непосредственно на субъединицу 30S, нарушают считывание генетического кода):

1 поколение: канамицин, стрептомицин, мономицин, неомицин;
2 поколение: гентамицин;
3 поколение: тобрамицин, сизомицин, нетилмицин.

б) Тетрациклины (нарушают связывание тРНК с рибосомально-матричным комплексом и угнетают внутриклеточный синтех белка рибосомами):

тетрациклин, окситетрацтклин, хлортетрациклин;

производные тетрациклина – метациклин (рондомицин), доксициклин (вибромицин).

в) Макролиды (взаимодействуют с субъединицей 50S, угнетают активность фермента пептидтранслоказы и угнетают синтез белка): эритромицин, олеандомицин, рокситромицин (рулид), макропен.

г) Линкозамины линкомицин, продуцируемый некоторыми видами актиномицетов, 4-алкилзамещенное соединение гиграновой кислоты, взаимодействующей с субъединицей 50S и подавляет синтез белка.

д) Левомицетин (хлорамфеникол) подавляет пептидилтрансферазную реакцию с субъединицей 50 S за счет ингибирования фермента пептидил-трансферазы.

4. Ингибирующие синтез нуклеиновых кислот (РНК и ДНК):

А) ингибиторы синтеза предшественников НК

- сульфаниламиды

- триметоприм

В) ингибиторы репликации ДНК

фторхинолоны - ингибируют фермент ДНК-гиразу, что нарушает функцию ДНК и соответственно синтез РНК – ципрофлоксацин (ципробай) , норфлоксацин, офлоксацин.
нитроимидазолы
нитрофураны

С) ингибиторы РНК – полимеразы

группа анзамицинов – ингибируют фермент ДНК-зависимую РНК-полимеразу в результате чего происходит угнетение синтеза РНК – рифамицин и его полусинтетический аналог – рифампицин;

5. Нарушающие синтез азотистых оснований и аминокислот: противоопухолевые (актиномицин D, оливомицин и др.) и противовирусные препараты (ремантадин, амантадин и др.).

Антибиотики являются непревзойденными этиотропными средствами, однако бесконтрольное не грамотное применение приводит к бесполезности их эффектов, более того к формированию негативных побочных проявлений. Поэтому применяя антибиотики, необходимо соблюдать следующие принципы рациональной антибиотикотерапии:

1. Микробиологический (применение антибиотиков только по строгим показаниям и после определения чувствительности).

2. Фармакологический (применение антибиотиков в строго определенных дозировках, через строго определенный интервал времени (через 4-6-12-24 часа), в течение определенного времени (3-5-7-10 дней), использование определенного метода введения (per os, внутримышечно, внутривенно), комбинирование антибактериальных средств (бактериостатики и бактерицидные препараты).

3. Клинический (обязательно учитывается общее состояние больного, пол, возраст, состояние иммунной системы, сопутствующие заболевания).

4. Эпидемиологический (учитывается эпидемиологический фон данного лечебного учреждения, города, т.е. наличие устойчивых штаммов микроорганизмов).5. Фармацевтический (учитывается срок годности препарата, обязательные условия хранения).

Лекарственная устойчивость микроорганизмов

Истинная (природная врожденная первичная) устойчивость характеризуется отсутствием у микроорганизмов мишени действия антибиотика или недоступности мишени вследствии первично низкой проницаемости или ферментативной инактивации. Природная резистентность является постоянным видовым признаком микроорганизмов и легко прогнозируется. Примером является отсутствие у микоплазм клеточной стенки. Такое нормальное поведение бактерии в присутствии антибиотика называется «диким фенотипом». Природная устойчивость поддерживается бактериальной хромосомой.

Приобретенная устойчивость – свойство отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при тех концентрациях антибиотиков, которые подавляют основную часть микробной популяции, приобретаемое в результате мутации генов, рекомбинаций и т.д.

Формирование резистентности во всех случаях обусловлено генетически – приобретением новой генетической информации или изменением уровня экспрессии собственных генов.

Рис. Механизмы формирования резистентности микробов к антибактериальным препаратам.

Основным механизмом вторичной резистентности является приобретение генов резистентности (r-генов), переносимых транспозонами и плазмидами.

Важно помнить, что АБ не способствуют образования этих плазмид, а лишь помогают эволюции (селекционирующий фактор)

Известны следующие биохимические механизмы антибиотикоустойчивости бактерий:

Рис. Механизмы антибиотикорезистентности бактерий

1. Модификация (изменение структуры) мишени действия – мишенями действия -лактамных антибиотиков являются ферменты, участвующие в синтезе пептидогликана. Изменение структуры этих ферментов в результате мутаций в соответствующих генах приводит к тому, что антибиотики не узнают и не воздействуют непосредственно на ферменты, являющиеся мишенями.

2. Инактивация антибиотика – ферментативная. -лактамазы встречаются у подавляющего большинства клинически значимых микроорганизмов. В результате гидролиза одной из связи -лактамного кольца происходит инактивация антибиотика. Основным механизмом устойчивости к аминогликозидам является их ферментативная инактивация путем модификации. R-плазмиды микроорганизмов содержат гены, которые способны вызывать, например, фосфорилирование, ацетилирование антибиотика, в результате чего изменяется его структура и, как правило, происходит инактивация. Измененные молекулы аминогликозидов теряют способность связываться с рибосомами и подавлять биосинтез белка

3. Активное выведение антибиотика из клетки – у микроорганизмов существуют транспортные системы в ЦПМ, кодируемые различными генами, осуществляющие активное избирательное выведение антибактериальных препаратов, антибиотики не успевают достичь своей мишени.

4. Нарушение проницаемости внешних структур – в результате мутаций возможна полная или частичная утрата структур осуществляющих транспорт через внешнюю мембрану.

Именно снижение проницаемости чаще всего становится причиной множественной лекарственной устойчивости - MAR (multiple antibiotic resistance - множественная устойчивость к антибиотикам)

Снижение проницаемости внешних структур бактериальной клетки является наименее специфичным механизмом устойчивости и, обычно, приводит к формированию устойчивости одновременно к нескольким группам антибиотиков.

Чаще всего причиной этого явления становится полная или частичная утрата пориновых белков. На фоне применения тетрациклинов или хлорамфеникола формируется устойчивость не только к этим антибиотикам, но и к β-лактамам и хинолонам. Активация MAR системы приводит к одновременному снижению количества одного из пориновых белков (OmpF) и повышению активности одной из систем активного выведения.

Снижение проницаемости за счет утраты или снижения количества пориновых белков встречается в ассоциации с продукцией β-лактамаз расширенного спектра. Утрата одного из пориновых белков (D2) P.aeruginosa приводит к избирательному снижению чувствительности микроорганизма к имипенему.

Наиболее распространенных механизмах резистентности среди основных клинически значимых микроорганизмов.

5. Формирование метаболического «шунта» - может являться результатом приобретения новых генов, в результате бактерии образуют «обходные» пути метаболизма для биосинтеза ферментов-мишеней нечувствительных к антибиотикам.

Возбудители внебольничных инфекций и лекарственная устойчивость

Staphylococcus spp. - устойчивость к природным и полусинтетическим пенициллинам, связанная с продукцией β-лактамаз.
S.pneumoniae - устойчивость различного уровня к пенициллину (часть штаммов устойчива к цефалоспоринам III поколения), связанная с модификацией ПСБ; высокая частота ассоциированной устойчивости к макролидам, тетрациклинам, ко-тримоксазолу.
H.influenzae, M.catarrhalis - устойчивость к полусинтетическим пенициллинам, связанная с продукцией β-лактамаз.
N.gonorrhoeae - устойчивость к пенициллинам, связанная с продукцией β-лактамаз, устойчивость к тетрациклинам, фторхинолонам.
Shigella spp. - устойчивость к ампициллину, тетрациклинам, ко-тримоксазолу, хлорамфениколу.
Salmonella spp. - устойчивость к ампициллину, ко-тримоксазолу, хлорамфениколу. Появление устойчивости к цефалоспоринам III поколения и фторхинолонам.
E.coli - при внебольничных инфекциях МВП - возможна устойчивость к ампициллину, ко-тримоксазолу, гентамицину.

Возбудители нозокомиальных инфекций

Enterobacteriaceae - продукция БЛРС (чаще всего среди Klebsiella spp.), обуславливающая клиническую неэффективность всех цефалоспоринов; очень высокая частота ассоциированной устойчивости к гентамицину/тобрамицину; в некоторых учреждениях тенденция к росту ассоциированной резистентности к фторхинолонам, амикацину.
Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., S.maltophilia - ассоциированная устойчивость к цефалоспоринам, аминогликозидам, фторхинолонам, иногда карбапенемам.
Enterococcus spp. - ассоциация устойчивости к пенициллинам, высокого уровня устойчивости к аминогликозидам, фторхинолонам и гликопептидам.
Staphylococcus spp. (метициллинорезистентные) - ассоциированная устойчивость к макролидам, аминогликозидам, тетрациклинам, ко-тримоксазолу, фторхинолонам.

Механизмы резистентности к противогрибковым препаратам

Повышение роли грибов в этиологии госпитальных и некоторых внебольничных инфекций привело к внедрению в клиническую практику значительного числа новых препаратов и их широкому применению, это, в свою очередь, неизбежно привело к формированию устойчивости. Поскольку грибы, в отличие от бактерий, являются эукариотическими организмами, то для лечения вызываемых ими инфекций необходимо использовать препараты с принципиально другими мишенями и механизмами действия. Фактором, существенно затрудняющим изучение устойчивости грибов, является недостаточная стандартизация методов оценки их чувствительности к противогрибковым препаратам и трудности в обосновании критериев чувствительности.

Азолы

Механизм действия азолов (миконазол, кетоконазол, флуконазол, итраконазол и др.) заключается в ингибиции биосинтеза эргостерола - вещества, участвующего в поддержании структурной целостности мембраны клетки гриба. Основной мишенью действия азолов являются ферменты (14α-деметилазы), осуществляющие деметилирование предшественников эргостерола. Для грибов рода Candida было показано, что устойчивость к азолам может быть связана с точечными мутациями, приводящими к аминокислотным заменам. В результате таких мутаций связывание ферментов с азолами резко снижается, но связывание с естественными субстратами не страдает. Устойчивость может являться результатом гиперпродукции мишеней действия азолов. У грибов рода Candida и др. известно несколько транспортных систем, осуществляющих активное выведение азолов, что также приводит к формированию устойчивости этих грибов. Активация систем выведения часто ассоциируется с изменениями в структуре мембраны, приводящими к снижению поступления азолов внутрь клетки гриба.

Аллиламины

Механизм действия аллиламинов (тербинафин), так же как и азолов, связан с ингибицией биосинтеза эргостерола. Однако, эта ингибиция происходит на существенно более ранних стадиях биосинтеза. В настоящее время зарегистрированы случаи неудач лечения тербинафином и описаны устойчивые штаммы. Генетические и биохимические механизмы устойчивости к аллиламинам изучены недостаточно, однако показано, что препараты могут активно выводиться из клеток грибов посредством известных транспортных систем.

Полиены

Механизм противогрибковой активности полиенов (нистатин, амфотерицин В и др.) заключается в физико-химическом взаимодействии этих препаратов со стеролами цитоплазматической мембраны грибов. В результате такого взаимодействия в мембране образуются поры, через которые происходит потеря цитоплазматического содержимого, приводящая к гибели гриба. Поскольку мишенью действия полиенов являются структурные элементы клетки грибов, а не ферменты, то формирование устойчивости может быть результатом сложных генетических процессов, приводящих к изменению биосинтеза компонентов мембраны. Вероятность таких событий относительно невелика, с чем и связана низкая частота устойчивости к полиенам. Биохимия и генетика устойчивости к полиенам изучена недостаточно, но имеющиеся данные в целом поддерживают гипотезу о снижении содержания эргостерола в цитоплазматической мембране и о повышении содержания его аналогов в устойчивых штаммах.

Оценка чувствительности к противогрибковым препаратам

В связи с появлением случаев неэффективности противогрибковой терапии возникла реальная практическая потребность в определении чувствительности грибов к соответствующим препаратам. В качестве стандартного рассматривают метод серийных разведений на среде RPMI 1640, воспроизводимые результаты обеспечивают ряд других методов и некоторые коммерческие тест-системы.

Принципиальными моментами являются:

фузионного метода для оценки чувствительности грибов;
отсутствие критериев интерпретации результатов исследований для большинства комбинаций гриб - препарат;
клинически обоснованные критерии разработаны только для оценки чувствительности грибов рода Candida к азолам и некоторым другим антимикотикам.

Использование нестандартизованных («домашних» или коммерческих) методов оценки чувствительности грибов может привести к получению заведомо ложных результатов и серьёзным ошибкам при выборе препаратов для лечения.

Механизмы резистентности к противовирусным препаратам

Противовирусная терапия по своей эффективности значительно уступает антибактериальной. В основном это связано с трудностями в разработке специфических препаратов из-за крайне тесной интеграции вирусного генома и генома хозяина (человека). До настоящего времени лишь крайне ограниченное число вирусных инфекций в той или иной степени поддается эффективной этиотропной терапии: герпетические и ЦМВ-инфекции, ВИЧ, некоторые вирусные гепатиты, грипп. Соответственно основное клиническое значение имеет устойчивость к наиболее распространённым противовирусным препаратам - противогерпетическим и антиретровирусным. Основными механизмами устойчивости является формирование и селекция мутаций в генах, кодирующих ферменты, участвующие в метаболизме препаратов, или являющиеся непосредственными мишенями действия препаратов.

Типичным для противовирусных препаратов является формирование резистентности в процессе длительной терапии.

Побочное действие антибиотиков

Не смотря на то, что антибиотики являются прекрасными этиотропными препаратами, многие из них оказывают на макроорганизм не желаемое отрицательное воздействие – побочное действие. Основные побочные эффекты, возникающие на фоне антибиотикотерапии:

1. Токсические реакции – зависят от свойств препарата, его дозы, способа введения, состояния больного.

Гепатотоксическое действие – поражение печени (тетрациклины, аминогликозиды);
Нефротоксическое действие – поражение почек;
Нейротоксическое действие – поражение нервной системы, в частности ототоксическое действие – поражение органа слуха (аминогликозиды);
Гематотоксическое действие – поражение органов кроветворения: лейкопения, анемия, тромбоцитопения;
Кардиотоксическое действие – поражение миокарда, эпикарда и эндокарда.
Эмбриотоксическое действие – действие на плод (левомицетин).

2. Дисбиозы и дисбактериозы – нарушение количественного и качественного состава нормальной микрофлоры макроорганизма. Погибают чувствительные к антибиотикам микроорганизмы и размножаются резистентные микроорганизмы и грибы, т.е. изменяется «микробный пейзаж». Нарушается антагонистическая функция микрофлоры по отношению к условно-патогенной микрофлоре и патогенным микробам.

Для предупреждения развития дисбиоза применяют: антибиотики узкого спектра действия; назначают противогрибковые препараты; назначают эубиотики для восстановления нормальной микрофлоры.

3. Аллергические реакции – зуд, гиперемия кожных покровов, крапивница, слезотечение, в том числе токсико-аллергические реакции: отек Квинке, анафилактический шок, синдром Лайела, синдром Стивенса-Джонса.

4. Иммунодепрессивное действие – угнетающее действие на иммунитет:

левомицетины угнетает антителообразование, тетрациклин – фагоцитоз, циклоспорин (противогрибковый препарат) избирательно подавляет Т-систему иммунитета. За счет гибели микроорганизмов и снижения антигенной нагрузки на иммунную систему не формируется длительный эффективный полноценный иммунный ответ. Поэтому возникают рецидивы и реинфекции.

5. Развитие лекарственной устойчивости.

Существуют определенные условия, при которых антибиотик может оказать бактериостатическое или бактерицидное действие на микробную клетку:

Антибиотик должен проникать в клетку;
Антибиотик должен вступить во взаимодействие со структурой-мишенью, которая выполняет жизненно важную для жизнедеятельности бактерий функцию, и подевить эту функцию;
Антибиотик должен сохранять свою структуру.

При нарушении одного из этих условий формируется лекарственная устойчивость микроорганизмов.

6. Эндотоксический шок – при применении бактерицидных препаратов при инфекционном процессе, вызванном грамотрицательной флорой, происходит массовая гибель микроорганизмов и массовый выход эндотоксина, который оказывает выраженное негативное влияние на различные органы и системы макроорганизма.

Методы определения чувствительности к антибиотикам

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам

Диффузионные методы

Методы разведения

диско-диффузионный

Е-тест

Серийное разведение в жидкой питательной среде

Разведение в агаре

Рис. Основные методы определения антибиотикочувствительности бактерий.

Диффузионные методы.

1. При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности (обычно эквивалентную стандарту мутности 0,5 по McFarland) и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 35^о-37^оС в течение ночи учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах (рис. ).

Рисунок . Определение чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом (Решедько Г. К.).

2. Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (рис.). В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).

Рисунок . Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов. Решедько Г. К.).

Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.

Методы разведения основаны на использовании двойных последовательных разведений концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (например от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл). При этом антибиотик в различных концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон) или в агар. Затем бактериальную суспензию определенной плотности, соответствующую стандарту мутности 0,5 по MсFarland, помещают в бульон с антибиотиком или на поверхность агара в чашке. После инкубации в течение ночи при температуре 35^о-37^оС проводят учет полученных результатов. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл (рис. 3).

Минимальная подавляющая концентрация (МПК) - наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий

Рис. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде.

Интерпретация результатов определения чувствительности

На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные (рис. 4). Для разграничения этих трех категорий чувствительности (или резистентности) между собой используют так называемые пограничные концентрации (breakpoint) антибиотика (или пограничные значения диаметра зоны подавления роста микроорганизма).

Рис. Интерпретация результатов определения чувствительности бактерий в соответствии со значениями МПК.

Пограничные концентрации не являются неизменными величинами. Они могут пересматриваться, в зависимости от изменения чувствительности популяции микроорганизмов. Разработкой и пересмотром критериев интерпретации занимаются ведущие специалисты (химиотерапевты и микробиологи), входящие в специальные комитеты. Одним из них является Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам США (National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS). В настоящее время стандарты NCCLS признаны в мире и используются как международные для оценки результатов определения чувствительности бактерий при многоцентровых микробиологических и клинических исследованиях.

Существуют два подхода к интерпретации результатов определения чувствительности: микробиологический и клинический. Микробиологическая интерпретация основана на анализе распределения значений концентраций антибиотика, подавляющих жизнеспособность бактерий. Клиническая интерпретация основана на оценке эффективности антибактериальной терапии.

Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) - наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определенного периода времени.

Значение МБК используют при терапии антибиотиками, обладающими бактериостатическим действием, или при отсутствии эффекта от антибактериальной терапии у особой категории больных.

В настоящее время созданы микробиологические системы, автоматизированной и полуавтоматизированной микробиологические, идентификации и оценки антибиотикоустойчивости, позволяющие существенно ускорить бактериологический анализ, повысить степень его точности.

Бактериальные анализаторы - высокочувствительная технология лазерного светорассеяния позволяет фиксировать кинетику роста микроорганизмов в образце в режиме реального времени, что позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью определять наличие жизнеспособных микроорганизмов в исследуемом образце, а также антибиотикочувствительность исследуемых культур всего за несколько часов.

Рис. Определения антибиотикочувствительности с помощью баканализатора.

Осуществляется мониторинг фазы роста бактерий в специальных культуральных бульонах, выстраиваются при этом кривые бактериального роста в режиме реального времени и производя бактериальный подсчет в КОЕ/мл.

Все образцы инкубируются при 37 °С и анализатор осуществляет детекцию только жизнеспособных бактерий, отделяя их от таких образований, как эритроциты, лейкоциты, мертвые клетки и кристаллы солей, присутствующие в образце и элиминируемые при помощи специальных настроек прибора.

Определение антибиотиков в биологических жидкостях.

Концентрация антибиотиков в тканях и жидкостях организма, как и их антимикробная активность, относятся к основным параметрам, определяющим эффективность антибиотикотерапии. При ее изучении наиболее широко применяют микробиологические методы исследования, основанные на способности биологической жидкости, содержащий антибиотик, задерживать рост тест-микроба. Среди микробиологических методов определения концентраций антибиотиков в жидкостях и тканях организма наибольшее распространение получили метод диффузии в агар и метод серийных разведений в жидкой питательной среде.

Для определения антибиотика в биологических жидкостях (плазме крови, моче и др.) с высокой степенью точности необходимо:

1. Разведения изучаемого субстрата в физиологическом растворе 1:2, 1:5, 1:10, 1:20.

2. Чашки Петри со средой и тест-микробом.

3. Рабочие растворы стандарта антибиотика для построения калибровочной кривой.

Приготовленные растворы стандарта антибиотика и испытуемые растворы (нативная плазма крови и ее разведения, супернатант трахеобронхиального аспирата и его разведения) вносят в лунки агара с помощью пипетки в объеме 0,1 мл, чередуя стандартный и испытуемые растворы. Для каждого испытания используют не менее 3 чашек. Чашки инкубируют при 37°С в течение 18 часов.

Расчет активности испытуемого антибиотика в биожидкостях проводят по общепринятой стандартной схеме:

Концентрацию антибиотика в испытуемом субстрате определяют по стандартной калибровочной кривой. Для построения стандартной кривой используют 5 концентраций раствора стандартного препарата: 0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 мкг/мл.

Одна из концентраций, по которой вносят поправки, является контрольной (для каждого препарата существует стандарт). Для каждой концентрации, кроме контрольной, используют 3 чашки (всего 12 чашек). В 3 лунки каждой чашки вносят растворы контрольной концентрации, в 3 другие лунки - одну из взятых концентраций раствора. После измерения зон задержки роста для каждой концентрации выводят среднюю величину зоны на трех чашках, затем находят среднюю величину зоны для контрольной концентрации на всех чашках (12 чашек × 3 зоны=36 зон).

По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации, выведенной на 12 чашках, и средней величиной зоны контрольной концентрации, определенной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны данной концентрации. Поправку прибавляют к средней величине зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если поправка отрицательная.

Стандартную кривую строят на полулогарифмической сетке по исправленным значениям величин зон взятых концентраций и средней величине зоны контрольной концентрации. По оси абсцисс откладывают диаметр зоны задержки роста тест-штамма, а по оси ординат - значения концентраций антибиотика.

При определении концентрации антибиотика в биологических жидкостях в зависимости от количества субстрата используют одну или несколько чашек для этого субстрата и каждого его разведения. Параллельно с испытуемым материалом в лунку каждой чашки вносят контрольную концентрацию стандартного раствора. После инкубации при 37°С в течение 18 часов измеряют зоны задержки роста тест-микроба, образуемые контрольной концентрацией стандарта и испытуемым раствором. Разность между найденными средними величинами зон испытуемого образца и контрольной концентрации прибавляют к величине зоны контрольной концентрации на стандартной кривой. Затем по кривой находят концентрацию, соответствующую найденной величине зоны в мкг/мл. Полученную концентрацию умножают на степень разведения и, таким образом, определяют содержание антибиотика в 1 мл испытуемого материала. Точность метода ±10%.

Возможно применение модифицированного метода серийных разведений:

В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом — исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина — Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024х0,313=320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл.

Определения концентрации антибиотика в биологических позволяет применять индивидуальные схемы антибактериального лечения с учетом фармакокинетики этого препарата и чувствительности возбудителей, а также разработать стандартные схемы его применения у лиц, требующих индивидуальные схемы лечения (новорожденные дети, пожилые лица, пациенты с нарушением функций почек, печени) с различной степенью зрелости организма и тяжестью инфекционного процесса.

Имеются ускоренные физико-химические и химические методы (иммуноферментный, иммунофлюоресцентный и др.) изучения фармакокинетики антибиотиков, помогающие быстро оптимизировать схемы лечения, индивидуализировать их и повысить эффективность этиотропной терапии.

Blog