Клиническое наблюдение за результатами трансплантации ксеногенных островковых клеток поджелудочной железы плодов кролика при лечении сахарного диабета у трех животных

Вид материала

Содержание

Ключевые слова
Цель исследования
Материалы и методы
1. Суточные дозы , IU, вводимого инсулина до и после трансплантации
2. Концентрация глюкозы, ммоль/л, в крови до и после трансплантации
После трансплантации

Подобный материал:

Клиническое наблюдение за результатами трансплантации ксеногенных островковых клеток поджелудочной железы плодов кролика при лечении сахарного диабета у трех животных

Журнал «Российский ветеринарный журнал», Москва, ноябрь 2005 года.

Л.А.Сережина ¹, Н.М.Туржанская¹, Л.П. Дьяконов², И.К Абдрахманов², М.А. Селюгин³, Ю.А. Кузнецов³

¹Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина ( Москва ),

²ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко ( Москва) ,

³«Аверс-Вет» - неотложная ветеринарная помощь ( Москва )

Ключевые слова: клетки островков Лангерганса, лечение, трансплантация, эндокринолология

Сокращения: ИЗСД – инсулинзависимый сахарный диабет, ОПЖ - островки поджелудочной железы, ПЖ – поджелудочная железа, СД– сахарный диабет

Summary

Diabetes exacts its toll on many animals, young and old. For years, researchers have been painstakingly dissecting this complicated disease caused by the destruction of insulin producing islet cells of the pancreas. Despite progress in understanding the underlying disease mechanism for diabetes, there is still a paucity of effective therapies. For years, investigators have been making slow, but steady progress on experimental strategies for pancreatic transplantation and islet cell replacement.

This article is about the trial of transplantation of fetal cells of pancreas of rabbit, 2 dogs and 1cat. Cells were infused into liver in the dose of 3x10⁶ into 5 places. As a result: 1 dog and 1 cat absolutely refused from insulin. One dog’s dose was noticeably reduced.

Введение

ИЗСД обусловлен аутоиммунной деструкцией островков ПЖ, что влечет за собой развитие абсолютной инсулиновой недостаточности, сопровождающейся выраженной гипергликемией. Несмотря на внедрение современных технологий в практику терапии СД (генноинженерный инсулин и его аналоги, шприц-ручки и инсулиновые помпы, глюкометры, в т. ч. неинвазивные и др.) стойкая компенсация нарушений углеводного обмена и предупреждение развития осложнений СД остаются актуальными проблемами.

Трансплантация в организм больного животного культуры островковых клеток ПЖ, - перспективный метод коррекции ИЗСД : с его помощью удается поддерживать содержание глюкозы в крови на физиологическом уровне за счет поступления эндогенного инсулина, предотвращать тяжелую гипогликемию и осложнения СД ( например, ангио-, нефро-, ретонопатии) []. Для свободной трансплантации островковых клеток ПЖ можно использовать:

– изолированные ОПЖ;

- выделенные ß-клетки;

- чистую культуру ß-клеток, полученную при культивировании in vitro изолированных островковых клеток.

Иточником островковых клеток ПЖ может служить как аллогенный материал (например, собака→собака), так и ксеногенный (кролик→собака). Наиболее подходящим ксеногенным донорским материалом на сегодняшний день считают ПЖ плодов [] или новорожденных кроликов []. Достоинства данного материала – биодоступность и возможность получения в количествах, достаточных для трансплантации []. Разработаны методы получения различных культур - органотипических, цитотипических однослойных, вторичных очищенных и, так называемых, «кластеров» из ПЖ животных.

При культивировании in vitro удается избавиться от клеток – носителей антигенов 2- го класса, В дальнейшем очищенную культуру используют для ксенотрансплантации животным с СД. Все это повышает антидиабетический эффект трансплантации и устраняет необходимость в стандартной химической иммуносупрессии. Это очень важное преимущество, поскольку у животных, больных СД, иммунитет снижен и существует риск развития гнойных осложнений. Стероиды характеризуются выраженной диабетогенностью [2], циклоспорин А ( препарат для химиотерапии) токсичен для изолированных островковых клеток и индуцирует инсулинорезистентность [3].

Поставив задачу добиться того, чтобы островковые клетки длительно функционировали в организме реципиента без введения иммунодепрессантов, ряд исследователей после большой серии опытов по трансплантации алло- и ксеногенных тканей обнаружили , что в организме существуют определенные зоны ( головной, костный мозг, тимус, семенники), в которых иммунокомпетентные клетки длительно не распознают чужеродные антигены. Указанные зоны были названы иммунологически привилегированными [, , , ] .

Первая в нашей стране аллотрансплантация культур плодных островковых клеток была проведена В.И. Шумаковым в 1979 г. За период с 1981 по 1984 гг. в Научно-исследовательском институте трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО) было выполнено 65 аллотрансплантаций больным СД. 42 пациента наблюдались в течение 1 года []. При этом у 18 из них доза вводимого инсулина снизилась на 18-67% и только у 7 потребность в инсулине вернулась к уровню, отмеченному до трансплантации.

В НИИТиИО Скалецкий Н.Н. и соавт. [] разработали способ получения культур из неонатальной ПЖ кролика без ферментной обработки, фильтрации, центрифугирования и других технических приемов выделения островков. По мнению В.И. Шумакова и соавт. [], благодаря использованию в качестве донорского материала островковых клеток ПЖ кроликов, удалось значительно увеличить число клинических трансплантаций. К 1994 г. было выполнено более 800 алло- и ксенотрансплантаций культур островковых клеток (в том числе полученных от плодов человека, крупного рогатого скота, свиньи и новорожденных кроликов). Кроме того, за пределами НИИТиИО сотрудники этого учреждения пересадили еще около 200 культур островковых клеток ПЖ новорожденных кроликов (ксенотрансплантации).

В 2004 году С.И.Леонович с соавт. показали положительный эффект трансплантации культуры островковых клеток, полученных из ПЖ эмбрионов кроликов, в организм собак с экспериментально вызванным СД []. Чтобы предотвратить реакцию отторжения, клеточную культуру трансплантировали в костный мозг, особенности строения и функции которого (отсутствие лимфатических сосудов, наличие ретикулярной ткани и стволовых клеток) делают его иммунологически привилегированной зоной.

В 1977 году Najarian et al. опубликовал первое сообщение о внутрипеченочной трансплантации аллогенных островковых клеток ПЖ. При этом после введения материала через воротную вену, потребность в экзогенном инсулине снизилась у 3-х больных из 4-х на срок до 18 мес [].

В дальнейшем, многие авторы признали трансплантацию ß-клеток в печень наиболее эффективной [, , , , ]. Например, в 2002 году R. Alejandro et al. [, ] внутрипортально трансплантировали культуру островков Лангерганса, полученную от человека, 7 больным. Результатом операции явилось полное отсутствие инсулиновой зависимости в течение 1 года.

Поскольку многие экспериментаторы в качестве наиболее эффективного способа введения островковых клеток рекомендуют интрапортальную пересадку, возникает вопрос о влиянии самой трансплантации на морфофункциональное состояние печени. По данным Bretzel et al., после внутрипеченочной трансплантации примерно 70% введенного донорского материала локализуется в венулах портальной системы, в перипортальных зонах, а около 30% - в мелких портальных венулах [] По данным Richardt et al. после успешной трансплантации островков Лангерганса частично восстановливаются ß-клетки собственной ПЖ реципиента []. Предполагают, что причина этого - стимулирующее действие неидентифицированного фактора, содержащегося в трансплантируемых клетках, на собственную железу реципиента. Возможно, новые ß-клетки образуются за счёт плюрипотентных эпителиальных клеток выводных протоков экзокринного отдела реципиента. В пользу данной гипотезы свидетельствуют результаты исследований [, , ], показывающие дифференцировку ацинарных клеток в инсулинпродуцирующие островки как in vitro, так и in vivo.

Цель исследования

Целью исследования было изучить влияние к трансплантации культивированных фетальных

ß-клеток ПЖ кролика на течение ИЗСД у собак и кошек.

Материалы и методы

Материал для выделения фетальных ПЖ получали в питомнике по выращиванию кроликов ООО «Алькона» пос.Дубровицы, Московской области.

К поиску методов выделения чистой культуры фетальных островковых клеток ПЖ кролика, предназначенных для ксеногенной трансплантации, приступили в начале 2004 года. Исследования проводили на базе Отдела клеточной биотехнологии ВНИИ экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко ( ВИЭВ). В них приняли участие врачи неотложной ветеринарной помощи «Аверс-вет». Были отработаны условия получения и культивирования ß-клеток, изучены их морфо-функциональные характеристики и влияние на течение экспериментально вызванного СД у лабораторных животных. Кроме того, ряд экспериментов был посвящен изучению особенностей культуры - ее онкогенности, гистосовместимости in vitro и аллергогенности для животных, бактериальной, вирусной и микоплазменной загрязненности.

Клинические исследования были начаты в марте 2005 года на базе Российского онкологического научного центра им.Н.Н.Блохина (РОНЦ РАМН) при участии врачей ветеринарной клиники «Биоконтроль». Отобрали животных с выраженными симптомами СД: полидипсией, полиурией, полифагией , нарастающей кахексией и установленной лабораторными методами глюкозурией, гипергликемией. На исследование было получено согласие владельцев животных.

Двум собакам и одному коту в паренхиму печени под эхографическим контролем трансплантировали культивированные фетальные островковые клетки ПЖ кролика в количестве 3х10⁶.

Животным, которым была назначена инсулинотерапия, дозы гормона постепенно снижали, регулярно контролируя уровень глюкозы в крови. 1 собака была стерилизована (по показаниям). В случае необходимости прибегали к симптоматическому лечению сопутствующих патологий (1 кот с хронической почечной недостаточностью). Содержание глюкозы в крови определяли 1 раз в один-два дня после трансплантации. Кровь (биохимический, клинический анализ ) и мочу ( общий анализ ) исследовали за 2-3 дня до трансплантации и на 5-й и 21- и 60-й день после нее. Клинический эффект оценивали по нормализации показателей уровня глюкозы в крови и моче, исчезновению полидипсии и полиурии. Критериями оценки эффективности считали отказ от инсулинотерапии, снижение дозы инсулина, длительность ремиссии.

Животное №1. Американский стаффордшир-терьер, собака, сука, 9 лет, массой 24 кг поступила на прием в апреле 2005 г. с жалобами владельца на полидипсию, полиурию. При физикальном исследовании установлено: общее состояние удовлетворительное, слизистая ротовой полости отечна, дыхание затруднено на вдохе. Появление этих признаков, по наблюдению хозяев, связано с периодами течки. Исследовали кровь (клинический и биохимический анализы) и мочу. Выявили: гипергликемию (19,3 моль/л), глюкозурию (55 ммоль /л) и кетонурию (1,5 ммоль/л). Животное стерилизовали , а затем трансплантировали островковые клетки в паренхиму печени. Спустя 3 мес после операции концентрация глюкозы в крови составляет 4,2 моль/л. Доза вводимого инсулина снижена до нуля ( 0 IU).

Животное №2. Английский сеттер, собака, 10 лет, кастрированный, массой 29 кг поступил на прием в феврале в тяжелом состоянии: были отмечены кахексия, дегидратация (5…7%), полидипсия, анорексия, рвота. При лабораторном исследовании выявлена гипергликемия (32,6 моль /л), глюкозурия (55 ммоль/л). Животному проведена инфузионная терапия, назначен инсулин в дозе 29 IU 2 раза в день. В апреле трансплантированы стволовые клетки в паренхиму печени. Спустя 3 мес после операции животное получает 12 IU инсулина 1 раз в день.

Животное №3. Кот, метис , 11 лет, массой 6 кг поступил в клинику с признаками полиурии, анорексии. При физикальном исследовании определили, что состояние животного удовлетворительное, при эхографии выявили увеличение эхогенности почечной коры, расплывчатость границы между кортикальным и медуллярным слоями , нечеткую внутреннюю архитектуру органа . Биохимический анализ крови показал глюкозурию (28, 9 моль/л), содержание мочевины 10 моль /л , креатинина 168 моль /л. Животному провели инфузионную терапию и назначили канинсулин в дозе 5 IU 2 раза в день. В апреле трансплантировали стволовые клетки в паренхиму печени. Спустя 3 мес после операции полностью отказались от инсулинотерапии, животному назначено симптоматическое лечение в связи с нарастающей почечной недостаточностью ( содержание мочевины в крови 21, 7 моль /л, креатинина - 304 моль /л).

Результаты

В ходе исследований у 2 животных (№1 и 3) исчезли клинические проявления СД, в их случае полностью отказались от инсулинотерапии, 1 животному (№2) значительно снижена доза гормона (в 4,8 раза), что отражено в таблице 1. Ретроспективный анализ результатов лабораторных исследований крови показал, что в большинстве случаев показатели нормализовались ( табл.2).

1. Суточные дозы , IU, вводимого инсулина до и после трансплантации

Животное	До трансплантации	После трансплантации
Животное	До трансплантации	1 сут	7 сут	14 сут	30 сут	60 сут
№1	20	0	0	0	0	0
№2	44	44	20	18	16	12
№3	10	0	3	0	0	0

2. Концентрация глюкозы, ммоль/л, в крови до и после трансплантации

Животное	До трансплантации		После трансплантации
Животное	Начало лечения	Перед трансплантацией	1 сут	7 сут	14 сут	30 сут	60 сут
№1	19,3	19,3	5,2	4,4	4,2	-	3,9
№2	32,6	32,6	19,5	7,2	-	8,0	21,7
№3	44,3	7,8	6,4	4,2	3,7	6,6	4,4

Выводы

Анализ отечественных и зарубежных источников, а также проведенные клинические исследования позволяют предположить, что при ксеногенной трансплантации культивированных кроличьих фетальных ß-клеток ПЖ собакам и кошкам, больным СД , начинает вырабатываться эндогенный инсулин. При этом в крови повышается содержание гормона и нормализуется уровень сахара, изменяются другие клинические показатели, определяющие СД. Кроме того, у животных снижается интенсивность проявления сопутствующих СД осложнений – ангиопатии, нефропатии, ретинопатии или они полностью исчезают, что значительно улучшает качество жизни животного и устраняет риск появления новых осложнений.

В заключение остается добавить, что мы продолжаем исследования в этом направлении, накапливаем и систематизируем данные, о чём постараемся доложить в ближайшее время.

Библиография

Дедов И.И., Балаболкин М.И., Клебанова Е.М. Современные аспекты трансплантации островков поджелудочной железы при сахарном диабете. 3-й Всероссийский диабетологический конгресс.
Леонович С.И., Слука Б.А., Игнатович И.Н., Горанов В.А. Трансплантация культуры островковых клеток поджелудочной железы в красный костный мозг. Белорусский медицинский журнал. Минск, - 2004. -№1.- с.44.
Скалецкий H. H., Кирсанова Л. А., Блюмкин В. Н. Проблемы трансплантологии и искусственных органов, М. - 1994. - стр.73-80
Шумаков В. И., Блюмкин В. Н., Игнатенко С. Н. и др. Проблемы эндокринологиию М., - 1985. - №5. - стр.67-70
Шумаков В. И., Блюмкин В. Н., Скалецкий Н. Н. и др., Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы. М. -Канон.- 1995.-384с
Alejandro R., Caulfield A., Fround Т. et al., Cell Transplant. - 2001. - Vol. 10.-P. 520
Alejandro R., Ferreira J. V., Caulfield A. et al., Am J Transplant. - 2002. -Vol. 2. - Suppl. 3. - P. 227
Berney T., Bühler L., Caulfield A., Oberholzer J., Toso Ch., Alejandro R. Transplantation of islets of Langerhans: new developments. Swiss. Med. Wkly 2002; 132:671-680
Bretzel R.G., Manus E., Schomber C. The liver as a site for implantation of islets of Langerhans in experimental diabetes. Morphologic and metabolic observation. “Acta Endocrinol.”, 1978, 87, Suppl.215, 69.
Federlin K., Pozza G. Indications for clinical islet transplantation today and in the foreseeable future – the diabetologist`s point of view. J Mol Med 1999;77:148-152
Henryk Zulewski, Elizabeth J. Abraham, Melissa J. Gerlach, et al. Multipotential Nestin-Positive Stem Cells Isolated From Adult Pancreatic Islets Differentiate Ex Vivo Into Pancreatic Endocrine, Exocrine, and Hepatic Phenotypes. Diabetes, Vol. 50, March 2001
Kolb E., Largiader F. Clinical islet transplantation. “Transpl. Proc.”, 1980, 12, №4, 205-207
Lechner A. Habener J. Stem/progenitor cells derived from adult tissues: potential for the treatment of diabetes mellitus. AJP-Endocrinol Metab • VOL 284 • FEBRUARY 2003.
Najarian J.S., Sutherland D.E.R. et al. Human islet autotransplantation. A preliminary report. “Transplant. Proc.”, 1977, 9, №1, 233-236.
Nielsen J., Svensson C., Galsgaard E. Beta cell proliferation and growth factors. J Mol Med (1999) 77:62–66
Oberholzer et al. ß Cell Replacement for the Treatment of Diabetes. Annals of the New York Academy of Sciences 944:373-387 (2001)
Richardt M., Menden A., Bretzel R. Islet transplantation in experimental diabetes of the rat. Hormone and metab. Res., 1984, 16, №10, 551-552.
Shapiro A. M., Lakey J. R., Ryan E. A. et al., N. Engl. J. Med. - 2000. -Vol. 27. - P. 230-238
Song K, et al. In vitro transdifferentiation of adult pancreatic acinar cells into insulin-expressing cells. Biochem Biophys Res Commun 2004; 316: 1094–1100
Valente U. Ferro M. Barocci S. Report of clinical cases of human fetal transplantation. “Transplant. Proc.”, 1980, 12, №4, 213-214
Vijayakumar K. RamiyA, Michael Maraist et al., Reversal of insulin-dependent diabetes using islets generated in vitro from pancreatic stem cells. Nature Medicine • Vol. 6 • Number 3 • March 2000.
Berney T., Bühler L., Caulfield A., Oberholzer J., Toso Ch., Alejandro R. Transplantation of islets of Langerhans: new developments. Swiss. Med. Wkly 2002; 132:671-680

Blog

Содержание

Сокращения: ИЗСД – инсулинзависимый сахарный диабет, ОПЖ - островки поджелудочной железы, ПЖ – поджелудочная железа, СД– сахарный диабет

Введение