Иссам Йосеф исследования развития и выделение экстрактов и эфирных масел аира болотного и верблюжьей колючки, произрастающих в астраханской области

Вид материала

Содержание

Егоров Михаил Алексеевич
Брыкалов Анатолий Валерьевич
Автореферат разослан « » апреля 2011 года.
Общая характеристика работы
Acorus calamus
Alhagi pseudalhagi
Цель и задачи исследования.
Научная новизна.
Практическая значимость работы.
Апробация работы.
Объём и структура диссертации
Материалы и методы
Staphylococcus aureus
Результаты исследования и их обсуждение
Acorus calamus
Оценка остатков тяжелых металлов и хлорорганических пестицидов в экстрактах аира болотного и верблюжьей колючки
Антибактериальная активность эфирного масла и спиртовых экстрактов аира болотного и верблюжьей колючки
A. calamus
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
...
Полное содержание

Подобный материал:

1 2 3

На правах рукописи

Абдул Хафиз Абделати Иссам Йосеф

ИССЛЕДОВАНИЯ РАЗВИТИЯ И ВЫДЕЛЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ И ЭФИРНЫХ МАСЕЛ АИРА БОЛОТНОГО И ВЕРБЛЮЖЬЕЙ КОЛЮЧКИ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ

Специальности:

03.02.01 – Ботаника,

03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Астрахань – 2011

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и биоэкологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханский государственный университет»

Научный руководитель:		доктор биологических наук, профессор Егоров Михаил Алексеевич
Официальные оппоненты:		доктор биологических наук Шахмедова Галина Сафяровна доктор химических наук, профессор Брыкалов Анатолий Валерьевич
Ведущая организация:	ГНУ «Астраханская опытная станция» ГНЦ РФ ВНИИР им. Н.И. Вавилова РАСХН РФ

Защита состоится «12» мая 2011 года в «10:00» часов на заседании диссертационного совета Д 212.009.10 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1. Естественный институт АГУ.

Тел. /факс: (8512) 51-82-64

Е-mail: sovetei@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20а, ссылка скрыта

Автореферат разослан « » апреля 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Федотова А.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Использование лекарственных растений растет во всем мире. По данным Всемирной Организация здравоохранения (ВОЗ), приблизительно 80% мирового населения в настоящее время использует травяные лекарственные средства непосредственно в чаи или с водой, молоком и алкоголем. Хотя современные синтетические медицинские препараты в основном используются в развитых странах, использование растительных препаратов значительно возросло. Отмечается постоянно высокий спрос на растительный материал. Следует отметить, что большинство растений представляют лишь частично интерес для биотехнологии и генетики и их лечебный потенциал не раскрыт (Oliver и Wim, 2007). Травянистые цветковые растения представлены во флоре Астраханской области 1105 видами (88,1 %). Раздельно рассматриваются группы наземных (1013 вида), земноводных (42 видов и 2 гибрида) и водных трав (48 видов) (Лактионов, 2009).

Аир болотный ( Acorus calamus L., Araceae) является многолетним растением содержаним аромакомпоненты, распространенным в Центральной Азии, Индии и Гималаях. Хотя ареалы его распространения в Европе сильно сократились, он и сейчас является привычным растением для северных болотистых регионов с умеренным климатом. Аир произрастает в дикой природе по краям болот, по берегам рек и прудов. Растение имеет корневище, и листья с приятным, слегка сладковатым запахом, что обусловлено содержанием эфирного масла. Сушеные корни аира болотного давно используются в лекарственных препаратах как спазмолитическое, противоязвенное средство, при приготовлении вкусовых горьких настоек и закуски (Rost,1979; Hanelt, 2001). Корень аира имеет давнюю историю медицинского применения. Он известен как народное средство лечения артрита, невралгии, диареи, диспепсии, выпадения волос и других заболеваний (Махлаюк, 1992). Препараты аира применяют в качестве ароматической горечи для улучшения аппетита и пищеварения, при болезнях почек, печени и желчного пузыря и как тонизирующее средство при угнетении центральной нервной системы. Эфирное масло корневищ аира используют для отдушки в парфюмерной и пищевой промышленности (Полуденный и др., 1979).

Верблюжья колючка ( Alhagi pseudalhagi Bieb., Fabaceae) распространена на всей территории Индии, где она используется в традиционной травяной медицине (Kirtikar и Basu, 1984; Singh и др., 1999; Viramani и др., 1992). Верблюжья колючка встречается на юге ссылка скрыта и в ссылка скрыта, в ссылка скрыта и ссылка скрыта, на ссылка скрыта. Растёт в сухих ссылка скрыта, ссылка скрыта и ссылка скрыта ссылка скрыта и пустынях, по берегам рек и ссылка скрыта, на ссылка скрыта и ссылка скрыта (Махлаюк, 1992). Верблюжью колючку используют для профилактики дизентерии, при воспалениях толстой и двенадцатиперстной кишки и желчного пузыря, ссылка скрыта и ссылка скрыта болезни желудка, иногда назначают при простудных заболеваниях, ссылка скрыта и кашле. Верблюжью колючку наружно используют для лечения гнойных ран, при ссылка скрыта, при гнойных ссылка скрыта и других заболеваниях (Кьосев, 2005).

Остаются не раскрытыми вопросы возможности использования этих видов растений для получения ценных биологических компонентов в Астраханской области.

Климатические особенности Астраханской области, инсоляция, низкая влажность, почвы, растительный покров, особенности сезонных изменений гидрологического режима определяют уникальные условия, но в тоже время сложные для развития растений. Однако комплекс этих исторически сложившихся в регионе фактров позволяет растениям интенсивнее накапливать ценные биологически активные компоненты определения их возможность использование с учетом запасов сырья и необходимостью их культивирования в различных отраслях (Сухенко, 2010). Актуальность работы заключается, в исследовании популяций аира болотного и верблюжьей колючки произрастающих на территории Астраханской области и содержащихся в этих растенях биологических активных веществ в зависимости от химического состава почв, на которых они произрастают.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы – исследовать развитие растений и разработать методы выделения биологически активных веществ из аира болотного и верблюжьей колючки, произрастающих в Астраханской области. Определить лучшие условия для развития растений. Выявить основные биологически активные вещества эфирных масел и экстрактов растений, осуществить исследования анти-бактериальных свойств. Разработать технологию изготовления водно-спиртовых экстрактов аира болотного и верблюжьей колючки для их использования в различных производствах. Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

Исследовать особенности морфологического развития аира болотного и верблюжьей колючки, произрастающих в различных местах в Астраханской области.
Определить основные физические и химические свойства почв из мест произрастания растений.
Осуществить дистилляцию эфирных масел, а также оценить количество эфирного масла в каждой пробе экстрактов.
Исследовать химический состав и определить основные биологически активные вещества, содержащиеся в эфирных маслах.
Сделать анализ растительных экстрактов на определение чистоты от тяжелых металлов и остатков пестицидов.
Изучить антибактериальную активность эфирных масел и экстрактов аира болотного и верблюжьей колючки.
Выявить пути получения использования эфирных масел и растительных экстрактов содержащих биоактивные вещества.

Научная новизна. Впервые изучены оптимальные условия роста аира болотного (A. calamus L.) и верблюжьей колючки (A. pseudalhagi Bieb.) в Астраханской области. Показаны оптимальные условия для развития аира болотного и верблюжьей колючки с целью выявления лучших показателей роста и высокого содержания эфирных масел.

Впервые, выяснен химический состав летучих масел, извлеченных из корневищ аира болотного, произрастающего в Астраханской области. Определено наличие азарона и других перспективных биологически активных веществ (БАВ) в эфирном масле корневищ аира.

Проведено определение чистоты спиртовых экстрактов из верблюжьей колючки и аира болотного на содержание тяжелых металлов и остатков пестицидов.

Предложено использование летучих растительных масел аира болотного, произрастающего на территории Астраханской области в парфюмерии и косметике.

Практическая значимость работы. На основе изучения биологических особенностей A. calаmus L. экспериментально показана возможность его использования в условиях Астраханской области для получения ценного сырья. Результаты исследования могут быть использованы в сельском хозяйстве для определения оптимальных условий для выращивания растений аира болотного и верблюжьей колючки и получение растений с высоким качеством и содержанием эфирных масел. Результаты химического и хроматографического анализов эфирных масел аира болотного (A. calаmus L.), которые могут быть использованы для получения экстрактов и биологических активных веществ, необходимых в качестве антимикробных компонентов. Возможно использование полученного эфирного масла из аира болотного, произрастающего на территории Астраханской области в парфюмерии и косметике.Прослушать

Апробация работы. Полученные экспериментальные исследования по данной работе представлены на научных конференциях: V Всероссийской конференции студентов и молодых ученых с элементами научной школы «Актуальные проблемы инновационного развития агропромышленного комплекса», Астраханский государственный университет, г. Астрахань, 29 октября – 1 ноября 2009 г.; Международной научно-практической конференции «Приоритеты и интересы современного общества», Астраханский государственный университет, г. Астрахань, 12-13 апреля 2010 г.; Международной конференции с элементами научной школы для молодежи «Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии», Министерства образования и науки РФ, Астраханский государственный университет, г. Астрахань, 7 – 10 декабря 2010 г.

Публикации. По результатам полученных исследований опубликовано 9 работ, отражающее основное содержание диссертации, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка литературы. Общий объём работы составляет 171 страницу, содержит 10 таблиц, 26 рисунков и 2 приложений. Список литературы включает 187 источников, из них 101 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы аира болотного были собраны в трех разных участках Приволжского района Астраханской области: I участок - около села Килинчи, и участки II и III - около села Три Протока. Были собраны растения, произрастающие на берегах рек, которые протекают через эти села. Экземпляры верблюжьей колючки были собраны в трех разных местах (I, II и III) от поселка Начало (Приволжский район Астраханской области).

Образцы растений были доставлены в лабораторию биотехнологий АГУ (Технопарк, поселок Начало, Приволжский район Астраханской области), где были проведен анализ морфологических признаков с последующей сушкой. Растения сохранялись в хорошо проветриваемом месте. Почвенные образцы также были собраны с данных участков, высушены и подготовлены к физическому и химическому анализу. Анализ был проведен в агрохимической лаборатории Астраханского государственного университета.

Собранные данные включают различные вегетативные параметры роста:

аира болотного

Количество листьев (шт).
Среднюю высоту растений (см).
Масса корневища (г).
Вес зеленых листъев (г).
Общий вес (вес стеблей, листьев и корневища) (г).

верблюжьей колючки

Количество боковых ветвей (шт).
Высота растений (см).
Общий вес (вес стеблей, листьев и корней) (г).

Методы получения эфирных масел:

Образцы растений (100 г. высушенных растений) были подвергнуты гидродистилляции в течение 2 часов с использованием аппарата Clevenger для получения эфирного масла (Clevenger, 1928). В настоящее время наиболее популярным методом извлечения является перегонка с водяным паром, при котором вода нагревается до получения пара, который несет в себе самые летучие химические вещества и ароматический материал. Затем пар, собранный в результате перегонки, охлаждается в конденсаторе. Извлеченные эфирные масла хранили в чистых стеклянных флаконах, в темном месте при температуре 4°С. Процент выхода изолированного эфирного масла, был рассчитан относительно их сухого веса.

Хроматографический анализ:

Хроматографический анализ проводили с использованием Shimadzu GC-MS (модели QP-5000, Shimadzu Ко, Киото, Япония) в режиме электронного удара. Ионизации 70 eV напряжения и температуры источника ионов и инжектор были 250^o C и 300° соответственно. Капиллярной колонкой использовали DB-WAX (60 × 0,2 мм, идентификатор, и 0,25 мкм толщина пленки; J и W, США). Температура печи, запланированная на 40^o C (изотермический на 1 минут) возросла до 180^o C в 20^o C/min и 220^oC в 1^oC/min затем 300° С в 20^оC/min и держали 10 мин. Гелий использовали в качестве газа-носителя при скорости потока 1ml/min, с инжектором объема 1ml 1:20 использованием коэффициента распределения.

Методы экстракции БАВ из растений:

Растения были собраны нами в Приволжском районе Астраханской области. Части растений, мыли, высушивали и извлекали отдельно спиртом 40% в течение 48 часов при периодическом встряхивании. Экстракты фильтровали, стерилизовали и хранили в холодильнике.

Анализ тяжелых металлов и пестицидов:

Образцы экстрактов аира болотного и верблюжьей колючки, подвергли на анализ тяжелых металов и пестицидов в «Испытательной лаборатории» ФГУ «Астраханский центр стандартизации, метрологии и сертификации» (аттестат аккредитации РОСС.RU. 0001.21 ПФ17 от 28.03. 2008г.). Тяжелые металлы согласно методикам (МУ Но. 5178-90; ГОСТ Р 51301-99; ГОСТ 26930-86). и пестициды согласно методикам (МУ Но. 4120-86; ГОСТ Р 51395-99).

Микробиологические методы исследования:

Испытания антимикробной активности были проведены в отношении Staphylococcus aureus (ВКПМ В-1899), Bacillus subtilis (ВКПМ В-1919) и Escherichia coli (ВКПМ В-1911). Штаммы были использованы из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУПГосНИИ Генетика, Москва, Россия.

Антибактериальную активность экстрактов растений определяли двумя способами: кубок диффузии на питательный среде агар (Anon, 1996). Экстракты выполнены в питательных пластинах агара использованием пробки буром (6 мм) и посевной содержащий 106 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл бактерии распространяли на твердые плиты стерильным тампоном, смоченным в суспензии бактерий. Затем 50 мкл экстракта помещали в чашки, контроль также включены 50 мкл спирта 40%. метод диск диффузии (Lorian, 1996). На дисках были введены в чистую стеклянную бутылку. Стерилизовали при температуре 121°С в течение 15 минут в автоклаве. Разведенный отвар был использован для проверки экстрактов на антибактериальную активность. Стерильные диски (6 мм диаметром) были выдержаны в экстрактах аира болотного и верблюжьей колючки (в течении 24 часов). Все пластины инкубировали в течение 72 ч при 37°C.

Полученные экспериментальные данные обрабатывали с помощью статистических методов анализа (Плохинский, 1972).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование развития аира болотного и верблюжьей колючки произрастающих на различных почвах Астраханской области

Особенности развития аира болотного

Результаты показали, что все измеряемые морфологические характеристики растений, имели самые высокие значения на участке III (с. Три Протока, Приволжского района) по сравнению с участками I и II. В таб. 1 и рисунке 1 представлены значение количества листьев растений, собранных на 3-х участках. Анализируемые показатели на III участке были выше по сравнению с участков I и II в эквиваленте 7,3 и 14,6%, соответственно.

Таблица 1

Влияние типа почвы на вегетативные параметры растений аира болотного в период 2008/2009 г.

Общий вес (г)	Вес зеленых листьев (г)	Масса корневища (г)	Высота растений (см)	Количест-во листьев (шт)	Вегетативные параметры
86,0 ± 7,00	38,5 ± 3,20	47,5 ± 4,02	80,5 ± 7,14	3,8 ± 0,71	I (тяжелый суглинок)
59,0 ± 4,57	17,4 ± 3,14	41,6 ± 5,00	68,4 ± 4,50	3,5 ± 0,50	II (тяжелый суглинок)
136,9 ± 8,67	57,2 ± 4,50	79,7 ± 5,33	102,4 ± 5,12	4,1 ± 0,67	III (глина)

Выявлено увеличение средних значений высоты растений на участке III по сравнению с участками I и II соотношений 21,4 и 33,2% соответственно. Вес корневища был больше на III участке 40,4 и 47,8% по сравнению с участками I и II соответственно. Так же отличился в сторону увеличения вес зеленых листьев на 32,7 и 69,6%, соответственно. Результаты перегонки эфирных масел от общей массы корневищ растений, показали, что корневищи растений, собранные с третьего участка, содержат наибольшее количество эфирного масла по сравнении с I и II участками на 27,5 и 47.5%, соответственно (рис. 2).

Результаты проведенных анализов почвы показали низкие значения рН почвы, собранной с участка III (рН=6,3) по сравнению с участками I и II. Также было обнаружено, что на участке III была глинистая почва, а почва I и II участков – тяжелый суглинок (рис. 3).

Особенности развития Верблюжья колючка

Alhagi pseudalhagi Bieg. (leguminosae) полукустарник с очень длинным корнем и глубоко расположенными подземными горизонтальными побегами, с растопыренно-ветвистым стеблем, многочисленными колючками. Листья простые, овальные. Цветки мотылькового строения, розовые или красные. Растения были собраны с трех разных участков (I, II и III) от п. Начало, Приволжский район Астраханской области.

Результаты исследования показали, что образцы верблюжьей колючки на участке № III (песок) являются наилучшими по морфологическим признакам (количеству боковых ветвей, высоте растений, общий весу) в сравнении с растениями, собранными на участках I и II (глина) (таб. 2 и рис. 4).

аблица 2

Влияние типа почвы на вегетативны параметры растений верблюжьей колючки в период 2008/2009 г.

Общий вес (гм)	Высота растения (см)	Количество боковых ветвей (шт)	Вегетативные параметры Участки
107,9 ± 7,07	81,5 ± 5,14	1,9 ± 0,2	I (глина)
91,0 ± 5,40	75,2 ± 4,67	2,1 ± 0,3	II (глина)
117,8 ± 6,43	82,7 ± 4,62	2,5 ± 0,22	III (песок)

Полученные результаты свидетельствуют также о содержании наибольшего количества эфирных масел в растениях, которые были собраны на участке III (0,3 мл \ кг) по сравнению с растениями, собранными на участках I и II, содержавших эфирные масла без каких-либо значительных различий между отдельными местами (рис. 5).

В результате проведенного анализа почвы (рис. 6), было обнаружено, что на участке III была песчаная почва, а на участках I и II - глинистая. Анализ также показал высокий уровень рН почвы на участке III (рН = 7,55) и низкий процент гигроскопической влажности, а также низкое по сравнению с участками I и II содержание в ней гумуса и минеральных солей.