Молекулярно-генетические и клинико-генотипические особенности муковисцидоза в российских популяциях 03. 00. 15 генетика

Вид материала

Автореферат

Содержание Актуальность исследования. Цель исследования Научная новизна Научно-практическая значимость работы CFTR генотипом позволяет выявить ассоциации между CFTR Положения, выносимые на защиту Личное участие автора в получении научных результатов. Апробация работы. Структура и объем работы. Содержание работы Анализ сцепления с полиморфными маркерами гена CFTR Экспериментальные методы. Общеклинические методы. Статистическая обработка результатов исследований. Результаты и обсуждение. Анализ относительных частот CFTR мутаций у больных МВ. F508del CFTRdele2,3(21kb) Поиск мутаций в 5’ -дистальной и промоторной области гена CFTR. CFTR в ряде популяций России. Для определения популяционных частот CFTR Расчет частоты муковисцидоза в популяциях русских европейской части России. ... Полное содержание

Подобный материал:

• Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным, 3372.01kb.
• Л. И. Параллелизмы в молекулярной организации генома и проблемы эволюции. В кн.: Молекулярные, 251.18kb.
• Молекулярно-генетические маркеры физических качеств человека 03. 02. 07 Генетика 14., 1366.15kb.
• Клинико-морфологические факторы прогноза (на примере рака молочной железы), 79.85kb.
• Анкета участника, 37.12kb.
• Ов курса «Патологическая физиология» для самостоятельного изучения, 13.37kb.
• М. В. Ломоносова биологический факультет кафедра антропологии Реферат, 448.61kb.
• Модели эволюции. Генетические алгоритмы, 361.44kb.
• Молекулярно-генетический анализ тапеторетинальной абиотрофии в республике башкортостан, 292.82kb.
• Молекулярно-генетические методы и компьютерные технологии в системе эпидемиологического, 615.43kb.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР


На правах рукописи


Петрова Ника Валентиновна


МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И КЛИНИКО-ГЕНОТИПИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МУКОВИСЦИДОЗА В РОССИЙСКИХ ПОПУЛЯЦИЯХ


03.00.15 – генетика


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук


Москва – 2009

Работа выполнена в лаборатории генетической эпидемиологии Государственного учреждения Медико-генетического научного центра РАМН, Москва

Научный консультант:	академик РАМН, доктор биологических наук, профессор Евгений Константинович Гинтер
Официальные оппоненты:	доктор биологических наук, Наталья Николаевна Вейко
	доктор биологических наук, профессор Светлана Андреевна Лимборская
	доктор биологических наук, профессор Валерий Вячеславович Носиков
Ведущее научное учреждение:	Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита диссертации состоится «_02_»_февраля_____2009 г. в _____часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при ГУ Медико-генетическом научном центре РАМН (ГУ МГНЦ РАМН) по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Медико-генетического научного центра РАМН.


Автореферат разослан «___»____________2008 г.


Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 001.016.01,

доктор медицинских наук Р.А. Зинченко

Актуальность исследования.

Муковисцидоз (МВ, CF; OMIM #219700) наиболее частое наследственное аутосомно-рецессивное заболевание среди европеоидов. Муковисцидоз обусловлен мутациями в гене CFTR, муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости. Белок CFTR, функционируя как цАМФ-зависимый хлорный канал, регулирует работу других хлорных и натриевых каналов и выполняет ряд иных важных функций (Riordan J.M. et al., 1989). При муковисцидозе в патологический процесс вовлекаются экзокринные железы разных систем организма: органов дыхания, системы пищеварения (поджелудочная железа, печень, желчные пути, пищеварительный тракт), а также потовые железы и урогенитальный тракт (Капранов Н.И. и др., 2004; Witt H., 2003).

В настоящий момент описаны более 1500 мутаций и 250 полиморфизмов в гене CFTR (CFTR mutation database, ссылка скрыта), частоты которых широко варьируют в разных этнических группах. Спектры различных мутаций и полиморфизмов гена CFTR обладают выраженной популяционной специфичностью, являясь отражением генетических процессов, формирующих популяции. Частота МВ варьирует в разных популяциях мира в весьма широких пределах (например, в Европе от 1:1800 новорожденных в Ирландии до 1:26000 новорожденных в Финляндии) (WHO, 2004). Оценки частоты MB в разных популяциях Российской Федерации (РФ) также весьма различны (от 1:4900 до 1:12000 живорождённых) (Петрова Н.В., Гинтер Е.К., 1997; Капранов Н.И., 2001; Капранов Н.И., 2006; Радионович А.М. и др., 2005; Воронин С.В. и др., 2007; Матулевич С.А., 2007; Михальчук В.В. и др., 2007; Одинокова О.Н. и др., 2007). Значительное различие спектров CFTR мутаций и частоты заболевания вносит объективные сложности в разработку протоколов проведения ДНК-диагностики МВ и проведения генетического консультирования среди населения, относящегося к разным этническим группам и проживающего в разных регионах.

Клиническая картина при МВ весьма разнообразна: продолжительность жизни, спектр и тяжесть клинических проявлений значительно варьируют среди больных МВ. И хотя вариабельность клинического течения МВ несомненно обусловлена многочисленностью CFTR мутаций, а следовательно, и CFTR генотипов, но различие в течении МВ, наблюдающееся у больных, имеющих одинаковые мутации в гене CFTR, в частности, у сибсов, позволяет предполагать влияние на клиническую картину МВ других генетических факторов, отличных от гена CFTR (Ferrari M., Cremonesi L., 1996; Parad R.B. et al., 1999; McKone E.F. et al., 2006; Mekus F. et al., 2000; Vanscoy L.L. et al., 2007). В настоящее время во всем мире ведется активный поиск генов, оказывающих влияние на клинические проявления МВ. Изучается ряд генов, белковые продукты которых могут быть вовлечены в патогенетические механизмы МВ. Особое внимание уделяется генам, продукты которых вовлечены в иммунную защиту организма (Drumm M.L. et al., 2005; Salvatore F. et al., 2002; Witt H., 2003; Yarden J. et al., 2005; Garred P.et al., 2003; Thio C.L. et al., 2005; Wiertsema S.P. et al., 2006; Иващенко Т.Э., Баранов В.С., 2000; Келембет Н.А. и др., 2005; Корытина Г.Ф.и др., 2004)..

Несмотря на то, что муковисцидоз интенсивно изучается на протяжении нескольких десятков лет специалистами разных направлений, в том числе и в России, интерес к проблемам этого заболевания не ослабевает. Вопросы распространенности МВ в разных популяциях и этнических группах, выявления гено-фенотипических корреляций, определения факторов, лежащих в основе вариабельности клинических проявлений, особенностей консультирования в связи с введением пресимптоматической диагностики в России не решены до конца.


Цель исследования:

Получение оценки частоты муковисцидоза, изучение молекулярно-генетического разнообразия гена CFTR в российских популяциях, выявление гено-фенотипических корреляций у российских больных и разработка на основе полученных результатов принципов медико-генетического консультирования.


Задачи исследования:

1. Оценить частоту МВ в популяциях европейской части России;
   
2. Изучить спектр и относительные частоты диагностически значимых мутаций в гене CFTR в обширной выборке российских больных МВ;
   
3. Оценить распространенность некоторых мутаций гена CFTR в разных этнических группах коренного населения России;
   
4. Изучить генетическую изменчивость локуса гена CFTR по внутригенным и внегенным полиморфизмам в семьях с МВ; оценить возможность использования этих полиморфизмов для косвенной ДНК-диагностики в семьях с частичной информативностью;
   
5. Изучить клинические особенности МВ у больных в зависимости от CFTR генотипа;
   
6. Изучить возможное модифицирующее влияние ряда генов на клинические проявления муковисцидоза у больных, гомозиготных по мутации F508del;
   
7. Разработать принципы медико-генетического консультирования для российских семей, отягощенных МВ. Провести расчеты генетического риска МВ при наличии двух независимых факторов риска (положительный тест на ИРТ и ДНК-тестирование; гиперэхогенный кишечник и ДНК-тестирование).
   

Научная новизна:

1. Впервые на основе определенных прямыми методами популяционной и относительной частот мутации F508del дана оценка частоты муковисцидоза в популяциях русских европейской части России.
   
2. Впервые определен спектр частых мутаций в гене CFTR, составляющих до 75,7% мутантных аллелей у российских больных МВ, на основе которого разработаны наборы для ДНК-диагностики.
   
3. Впервые изучена распространенность семи CFTR мутаций в популяциях европейской части России в пяти этнических группах (русские Ростовской, Тверской, Псковской, Кировской областей, марийцы, чуваши, удмурты, башкиры). Выявлены различия в частоте встречаемости мутации F508del среди изученных этносов.
   
4. Впервые изучена молекулярно-генетическая изменчивость промоторной и 5’ регуляторной областей гена CFTR у российских больных МВ, у которых при предварительном тестировании не идентифицированы одна или обе мутации.
   
5. Выявлены мутации 3944delTG, 3667delTCAA и L138insA, ранее не обнаруженные у российских больных МВ. Впервые идентифицированы мутации 604insA и K598ins. Мутации L138ins и 604insA можно отнести к относительно частым у российских пациентов с МВ.
   
6. Впервые в семьях российских больных МВ проанализированы частоты аллелей внутригенного полиморфизма IVS1CA и частоты гаплотипов четырех внутригенных полиморфизмов IVS1CA-IVS6aGATT-IVS8CA-IVS17bCA. Показаны различия в частотах и наборах гаплотипов изученных полиморфизмов, ассоциированных с нормальными и мутантными аллелями гена CFTR.
   
7. Выявлены три группы мутаций, ассоциированные с определенными гаплотипами четырех внутригенных полиморфизмов IVS1CA-IVS6aGATT-IVS8CA-IVS17bCA: мутации F508del, N1303K, G542X, 2143del и 394delTT – с гаплотипом 21-6-23-13; мутации CFTRdele2,3(21kb), 1677delTA, L138ins – с гаплотипом 22-7-16-13; мутации W1282X, R334W – с гаплотипом 26-7-17-17.
   
8. Впервые у российских больных МВ изучена взаимосвязь клинической картины и CFTR генотипа (с учетом классификации мутаций в зависимости от степени дефекта хлорного канала).
   
9. Впервые на выборке российских больных МВ, гомозиготных по мутации F508del, изучено модифицирующее влияние шести генов на клинические проявления заболевания и показано, что гены eNOS, MBL2 и HFE можно рассматривать в качестве модификаторов клинической картины заболевания.
   
10. Впервые для российских семей проведены расчеты генетического риска при наличии двух независимых факторов риска МВ: положительного результата первого теста на ИРТ у новорожденного или обнаружения гиперэхогенности кишечника у плода при ультразвуковом исследовании и положительного или отрицательного результата ДНК-диагностики.
    
11. Впервые для российских семей показан высокий риск МВ (приближающийся к 0,25) у плода, имеющего гиперэхогенный кишечник во 2-м триместре, при выявлении носительства CFTR мутации одним из родителей.
    

Научно-практическая значимость работы:

1. Определение спектра и долей частых CFTR мутаций и изучение генетической изменчивости локуса гена CFTR по внутригенным и внегенным полиморфизмам позволило разработать алгоритм молекулярно-генетической диагностики МВ, в том числе пренатальной, в российских семьях, отягощенных муковисцидозом.
   
2. Обнаружение новых для российских больных МВ CFTR мутаций расширило спектр мутаций, которые можно рекомендовать для рутинного анализа в диагностических лабораториях.
   
3. Введение полиморфизма IVS1CA в протокол анализа повышает эффективность косвенной диагностики в семьях с неполной информативностью. Использование методов прямой (анализ частых CFTR мутаций) и косвенной (анализ четырех внутригенных и пяти внегенных полиморфизмов) ДНК-диагностики позволяет обеспечить проведение пренатальной диагностики для 99,5% семей, отягощенных муковисцидозом.
   
4. Изучение взаимосвязи между фенотипом и CFTR генотипом позволяет выявить ассоциации между CFTR мутациями и тяжестью поражения как органов пищеварительной, так и бронхолегочной системы и дать более точный прогноз течения заболевания у больных МВ.
   
5. Изучение полиморфизмов некоторых генов позволяет выявить возможные механизмы, лежащие в основе клинического разнообразия у пациентов с одинаковым CFTR генотипом.
   
6. Расчеты риска МВ в случаях положительного результата первого теста на ИРТ у новорожденного или обнаружения гиперэхогенности кишечника у плода при ультразвуковом исследовании с учетом результата ДНК-диагностики могут дать более точный прогноз для потомства при медико-генетическом консультировании.
   
7. Результаты по выявлению частых, диагностически значимых для российских больных МВ мутаций в гене CFTR и контрольные образцы ДНК с известными мутациями использованы при разработке наборов для ДНК-диагностики МВ (в лаборатории ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН).
   

Положения, выносимые на защиту:

1. Изучение спектра и относительных частот мутаций в гене CFTR в обширной выборке российских больных МВ (776 индивидов) из разных регионов РФ выявило, что к диагностически значимым можно отнести мутации F508del (54,2%), CFTRdele2,3(21kb) (7,2%), 2143delT (2,1%), W1282X (2,0%), N1303K (1,9%), 3849+10kbC>T (1,9%), 2184insA (1,7%), G542X (1,3%), 1677delTA (0,8%), 3821delT (0,8%), R334W (0,7%), L138ins (0,6%) и 394delTT (0,5%). Доля не охарактеризованных мутантных аллелей составила 23%.
   
2. В результате изучения частоты семи CFTR мутаций (CFTRdele2,3(21kb), F508del, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT и 3821delT) в выборках здоровых индивидов, относящихся к 5 этническим группам РФ: русских из европейской части России, марийцев, удмуртов, чувашей и башкир, показано, что частота мутации F508del среди русских европейской части России значимо выше (0,00518), чем у изученного коренного населения Волго-Уральского региона (<0,002).
   
3. Частота муковисцидоза, рассчитанная из популяционной и относительной частот мутации F508del для популяций русских европейской части России, составляет 1:10935.
   
4. Анализ четырех внутригенных маркеров гена CFTR (IVS1CA, IVS6aGATT, IVS8CA и IVS17BCA) выявляет неравновесие по сцеплению аллелей и гаплотипов в выборках мутантных и нормальных хромосом. Мутация F508del сцеплена с гаплотипами 21-6-17-13 и 21-6-23-17 в 91,8% случаев. Мутации G542X, N1303K, 394delTT и 2143delT ассоциированы с гаплотипом 21-6-23-13. С гаплотипом 22-7-16-13 сцеплены мутации CFTRdele2,3(21kb), 1677delTA и L138insA; с гаплотипом 26-7-17-17 - мутации W1282X и R334W. Самым частым в выборке нормальных хромосом родителей больных МВ (23,5%) является гаплотип 22-7-16-13. Анализ четырех внутригенных маркеров (IVS1CA, IVS6aGATT, IVS8CA и IVS17BCA) и пяти внегенных маркеров (XV-2c; KM19; CS7; J3.11; W30) позволяет проводить пренатальную диагностику МВ практически во всех семьях (99,5%).
   
5. У российских больных МВ выявлена ассоциация между CFTR генотипом и тяжестью поражения как органов пищеварительной, так и бронхолегочной системы. У больных с двумя мутациями I и/или II классов дебютом заболевания чаще является кишечный синдром, манифестирующий в более раннем возрасте; колонизация легких P.aeruginosa начинается в более раннем возрасте, что приводит к более быстрому прогрессированию заболевания по сравнению с больными, имеющими, по крайней мере, одну мутацию IV или V класса.
   
6. Гены eNOS, MBL2 и HFE можно рассматривать как модификаторы клинических проявлений МВ у российских больных. Установлена ассоциация полиморфного аллеля A VNTR eNOS4 со снижением показателей функции внешнего дыхания (ФЖЕЛ и ОФВ₁; p<0,05) и со снижением частоты цирроза печени (p<0,05). Выявлена ассоциация аллелей G54D, G57E, R52C и –221G>С гена MBL2 со снижением показателей ОФВ₁ у детей дошкольного возраста (p<0,05), более ранним поражением P.aeruginosa (p=0,017) и ассоциация мутации G54D с более частым поражением Al. xylosoxidans (p=0,037) и St. maltophilia (p=0,049). Обнаружена ассоциация мутации Н63D гена HFE с более тяжелым поражением пищеварительной системы и ранней манифестацией кишечного синдрома (p<0,05).
   
7. Параметрами, которые необходимо учитывать при медико-генетическом консультировании в семьях с МВ и расчетах апостериорного риска, являются частота МВ (1:10965), частота гетерозиготного носительства мутантных аллелей МВ (0,019), доля выявляемых при ДНК-диагностике мутаций (75,5%) и относительные частоты МВ мутаций, если оба родителя происходят из популяций европейской части России. Риск МВ у новорожденного, положительно тестированного на ИРТ, составляет 0,0541 при обнаружении у него одной CFTR мутации и 0,0005, если ни одна из частых CFTR мутаций не обнаружена. Риск МВ у плода с эхогенностью кишечника, диагностированной при УЗИ во втором триместре беременности, при обнаружении CFTR мутации у одного из родителей составляет 0,1733, если ни одна из частых CFTR мутаций не обнаружена – 0,0017.
   

Личное участие автора в получении научных результатов.

Представляемая диссертационная работа является обобщением результатов многолетних комплексных исследований. Работа выполнена на базе лаборатории генетической эпидемиологии ГУ МГНЦ РАМН. Планирование эксперимента, обработка, анализ и обобщение материалов исследования выполнены лично автором. Автор участвовала в сборе популяционных образцов крови совместно с сотрудниками лаборатории генетической эпидемиологии и лаборатории экологической генетики ГУ МГНЦ РАМН, в сборе клинических данных о больных МВ совместно с сотрудником лаборатории генетической эпидемиологии Тимковской Е.Е. и сотрудниками научно-клинического отделения муковисцидоза д.м.н. Н.Ю. Каширской, к.м.н. Радионович А.М., к.м.н. Воронковой А.Ю. Автором создана коллекция ДНК больных МВ и их родственников. Выделение ДНК из образцов крови и ворсин хориона плодов, анализ частых мутаций в гене CFTR у 776 больных МВ, 1082 родителей, в популяционных выборках (3739 индивидов); анализ внутригенных и внегенных полиморфизмов в семьях с МВ (344 больных и 488 родителей); проведение 109 пренатальных диагностик МВ выполнены лично автором. Анализ кодирующей последовательности гена CFTR в выборке 50 пациентов методом денатурирующего гель-электрофореза проведен в Институте биогенетики (Брест, Франция); анализ полиморфизма генов-модификаторов клинической картины МВ (148 больных, гомозиготных по мутации F508del) проведен совместно с сотрудником лаборатории Тимковской Е.Е.; анализ последовательности 5’ регуляторной и промоторной области гена CFTR у 83 больных МВ и 50 здоровых индивидов методом анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК проведен совместно с сотрудниками лаборатории к.б.н. М.Ю. Скобловым и О.Н. Нурутдиновой, что оговорено в соответствующих местах текста. Статистический анализ: расчет относительных частот мутаций, расчет популяционной частоты мутации F508del, оценка частоты МВ в популяциях европейской части России, анализ гено-фенотипических корреляций у российских больных МВ, оценка возможного влияния генов-модификаторов на клиническую картину МВ у больных с одинаковым CFTR генотипом, расчет генетических рисков при наличии двух независимых факторов риска МВ в разных регионах России выполнены лично автором.


Апробация работы.

Результаты исследования были представлены на Европейских конференциях по муковисцидозу (в 1991, 1996, 1999, 2006, 2008 годах); на Европейских международных симпозиумах по муковисцидозу (в 1997, 2000, 2001, 2002, 2003 годах); на Европейской конференции по генетике человека (2008 г.); на 2 (4) Российском съезде медицинских генетиков (Курск, 2000 г.); на 5-ом Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро-2003» (С.-Петербург, 2003 г.); на Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003 г.); на Третьем съезде генетиков и селекционеров России “Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития” (Москва, 2004 г.); на Третьих антропологических чтениях к 75-летию со дня рождения академика В.П.Алексеева «Экология и демография человека в прошлом и настоящем» (Москва, 2004 г.); на V Съезде Медицинских генетиков (Уфа, 2005 г.); на VII национальном конгрессе по муковисцидозу (Воронеж, 2005 г.); на Российском Медицинском Форуме «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006 г.); на VIII Национальном конгрессе «Муковисцидоз у детей и взрослых» (Ярославль, 2007 г.); на межлабораторном семинаре ГУ МГНЦ РАМН (25 июня 2008 г.).