Взаимодействие ассоциативных бактерий и растений в зависимости от биотических и абиотических факторов 03. 00. 07 Микробиология

Вид материала

Автореферат

Содержание Общая характеристика диссертации Azospirillum lipoferum Содержание диссертации 2. Объекты и методы исследований 3. Значение взаимодействия ассоциативных бактерий в ризосфере для эффективности инокуляции растений Az. lipoferum 4. Роль ризобактерий, содержащих фермент АЦК деаминазу, в устойчивости растений к абиотическим стрессам Achromobacter xylosoxidans Pseudomonas marginalis Pseudomonas putida Variovorax paradoxus P. brassicacearum P. brassicacearum Вариант опыта V. paradoxus R. leguminosarum 5. Взаимодействие производственных штаммов ассоциативных бактерий с растениями в зависимости от агроклиматических факторов Az. lipoferum Az. lipoferum Ag. radiobacter ... Полное содержание

Подобный материал:

• Концепция уровней организации живой природы > Понятие об экологических факторах,, 19.35kb.
• Ирина Ивановна Сидорова. Объем курса 28 часов. Форма отчет, 24.09kb.
• Тесты по микробиологии, 156.97kb.
• Программа вступительного экзамена в аспирантуру по специальной дисциплине 06. 02., 270.79kb.
• В. Г. Гомберг " " 1999, 54.43kb.
• Методические рекомендации по выполнению лабораторной работы по курсу «Биология с основами, 402.75kb.
• Лекция 8 Эдафические факторы Греческое слово «эдафос» означает «земля» или «почва»., 162.42kb.
• Лекция Вторичные метаболиты (конспект), 36.18kb.
• Каталазная активность углеводородокисляющих бактерий 03. 02. 03 «Микробиология», 250.08kb.
• На прошлой лекции, обсуждая эдафические факторы, я сказал, что они являются логичным, 132.62kb.

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ


На правах рукописи


Белимов Андрей Алексеевич


взаимодействие ассоциативных бактерий и растений в зависимости от биотических и абиотических факторов


03.00.07 - Микробиология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук


Санкт-Петербург – 2008

Работа выполнена в Государственном научном учреждении

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии


Научный консультант:


доктор биологических наук, профессор,

академик Россельхозакадемии Тихонович Игорь Анатольевич


Официальные оппоненты:


доктор биологических наук,

профессор, чл.-корр. РАН Боронин Александр Михайлович


доктор биологических наук Кравченко Лев Витальевич


доктор биологических наук,

профессор Умаров Марат Мутагарович


Ведущая организация:


Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

(г. Саратов)


Защита состоится «…….» ………………….. 2009 г. .. в …….…час

на заседании совета ДМ 212.232.07

по защите докторских и кандидатских диссертаций

при Санкт-Петербургском государственном университете

по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9,

Биолого-почвенный факультет, ауд. ……


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета


Автореферат разослан «……»…………………………2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Шарова Е.И.


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ


Актуальность темы

Увеличение продуктивности сельскохозяйственных культур, эффективное и ограниченное использование удобрений и средств защиты растений, а также повышение устойчивости и адаптации растений к неблагоприятным агроклиматическим условиям и антропогенным воздействиям являются актуальными для сельского хозяйства, а также для решения экологических проблем и охраны окружающей среды. Данные вопросы привлекают внимание многих ученых, работающих в различных областях науки: растениеводстве, почвоведении, агрономии, агрохимии, экологии, микробиологии и других. Особенно важными для решения этих задач являются микробиологические подходы и приемы, которые основаны на использовании потенциала растений и почвенных микроорганизмов, и биологических механизмов взаимодействия компонентов растительно-микробных систем. Известно, что почвенные микроорганизмы активно взаимодействуют с растениями и могут оказывать как положительные, так и отрицательные эффекты на их рост и питание. В настоящее время накоплен большой материал о механизмах положительных воздействий ассоциативных ризосферных бактерий на растения. К таким механизмам относятся фиксация атмосферного азота, продуцирование биологически активных веществ, активизация потребления корнями питательных элементов, биоконтроль фитопатогенов и индуцирование системной устойчивости растений.

Основываясь на знаниях о взаимодействии растительно-бактериальных ассоциаций и примерах улучшения роста и питания растений посредством инокуляции полезными формами микроорганизмов, нами была изучена роль некоторых биотических и абиотических факторов в растительно-бактериальных взаимодействиях и оценена возможность применения ассоциативных бактерий для повышения устойчивости растений к различным стрессовым факторам. Основными предпосылками проведенных исследований были следующие рассуждения. Во-первых, растения, находясь в неблагоприятных условиях среды или атакуемые патогенными микроорганизмами, нуждаются в дополнительных ресурсах питания и энергии, оптимизации гормонального статуса, и снижения интенсивности воздействия стрессоров. Во-вторых, перечисленные выше положительные эффекты ассоциативных бактерий затрагивают именно те процессы метаболизма растений и их взаимодействия с окружающей средой, которые нарушаются при стрессе. Поэтому логично предположить, что бактериальные эффекты потенциально ориентированы против негативных воздействий стрессоров и могут быть особенно важны для растений именно в неблагоприятных условиях. В-третьих, растительно-микробные ассоциации являются надорганизменными системами, обладающими новыми и уникальными качествами, и это может существенно влиять на адаптацию партнеров к стрессовым факторам и повышать уровень гомеостаза самой ассоциации.


Цели и задачи исследований

Основной целью проведенных исследований являлось получение новых знаний о механизмах взаимодействия растений с полезными формами почвенных микроорганизмов в зависимости от биотических факторов, обусловленных активностью и взаимодействием ризосферных бактерий, и условий внешней среды, которые проявляются как абиотические стрессы. С одной стороны, представлялось важным оценить влияние внешних биотических и биотических факторов на взаимодействие растительно-бактериальных ассоциаций, а с другой стороны, изучить роль ассоциативных бактерий в адаптации растений к стрессам. Особое внимание уделялось изучению преимуществ, которые растения получают при образовании эффективных ассоциаций с полезными микроорганизмами для противостояния негативным воздействиям окружающей среды, и механизмов интеграции растений с микроорганизмами в ризосфере в зависимости от внешних условий. Получение таких знаний направлено на раскрытие значения микробных ассоциаций и взаимодействий бактерий в ризосфере для роста и питания растений, а также на обоснование и эффективное использование потенциала микроорганизмов в их способности повышать устойчивость растений к стрессовым факторам.

Конкретные задачи исследований состояли в следующем:

1. Изучить взаимодействие производственных штаммов ассоциативных бактерий в питательных средах и ризосфере, а также оценить их влияние на рост и питание растений при совместной интродукции на семена. Описать аддитивные эффекты и механизмы взаимодействия ассоциаций азотфиксирующих и фосфатмобилизующих штаммов с растениями.
   
2. Выделить и охарактеризовать группу бактерий, доминирующих в ризосфере проростков растений, по их влиянию на рост растений и коллекционных штаммов ростстимулирующих бактерий. Оценить значение фактора взаимодействия производственных штаммов ассоциативных бактерий с аборигенной бактериальной микрофлорой ризосферы ячменя.
   
3. На основе принципа популяционного доминирования бактерий в ризосфере проростков провести селекцию эффективных ростстимулирующих штаммов. Рассмотреть колонизирующую активность интродуцируемых штаммов как фактор, влияющий на эффективности инокуляции.
   
4. Выделить и изучить штаммы бактерий, активно колонизирующие ризосферу гороха и горчицы сарептской и обладающих АЦК-деаминазной активностью, которая рассматривается как важный механизм стимуляции роста растений в стрессовых условиях.
   
5. Изучить влияние производственных штаммов и вновь выделенных АЦК-утилизирующих штаммов на устойчивость растений к стрессу, вызванному тяжелыми металлами. Оценить воздействие бактерий на аккумуляцию токсичных и питательных элементов.
   
6. Показать зависимость эффективности инокуляции бактериями, содержащими АЦК деаминазу, от обеспеченности растений питательными элементами. Изучить влияние уровня минерального питания растений на гомеостаз растительно-бактериальных ассоциаций.
   
7. Оценить эффективность инокуляции ячменя производственными штаммами ассоциативных бактерий при стрессах, вызванных неблагоприятными почвенно-климатическими факторами, а именно экстремальными температурами, повышенной кислотностью почвы и засухой.
   
8. Изучить роль фермента АЦК деаминазы в реакции растений гороха и томатов на инокуляцию АЦК-утилизирующими бактериями в условиях дефицита почвенной влаги.
   

Научная новизна

В работе использованы оригинальные подходы для изучения взаимодействия штаммов ассоциативных бактерий друг с другом и с аборигенной ризосферной микрофлорой. С одной стороны это позволило экспериментально продемонстрировать важность популяционных отношений интродуцируемых бактерий для проявления их ростстимурирующих эффектов на растение, а с другой стороны дало новую информацию о причинах нестабильности эффектов интродуцентов или искажения ожидаемой реакции растения на инокуляцию. Впервые проведены детальные исследования поведения ассоциативных бактерий в ризосфере в стрессовых условиях, вызванных различными почвенно-климатическими факторами, что внесло вклад в понимание динамики интродуцируемых бактериальных популяций и роли партнеров в формировании растительно-бактериальных ассоциаций в зависимости от условий среды. Новизной обладают методические приемы селекции и результаты исследований ассоциативных бактерий, содержащих АЦК деаминазу. Изучение функционирования ассоциаций ризосферных бактерий с растениями в стрессовых условиях позволило получить уникальную информацию об устойчивости и механизмах интеграции компонентов таких растительно-микробных систем.

Ниже перечислены наблюдения, закономерности или методические приемы, которые были установлены или разработаны в ходе исследований:

1. Выявлена бинарная ассоциация производственных штаммов Azospirillum lipoferum 137 и Agrobacterium radiobacter 10, в которой азоспириллы активнее фиксируют азот и лучше приживаются на корнях растений. Впервые показано, что проявление симбиотических свойств партнеров ассоциации азотфиксирующих и фосфатмобилизирующих бактерий в ризосфере может быть важным механизмом усиления положительного эффекта интродуцентов на рост растений.
   
2. Впервые, с использованием метода изотопной индикации, установлено, что фосфатмобилизующие бактерии способны улучшать фосфорное питание растений за счет активизации поглощения фосфорного удобрения. Получены оригинальные результаты показавшие, что проявление аддитивного эффекта совместной инокуляции растений бактериями Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10 связано с индивидуальными особенностями механизмов воздействия этих штаммов на азотное и фосфорное питание растения. Образование данной растительно-бактериальной системы приводит к повышению коэффициента использования растениями азотного и фосфорного удобрения.
   
3. Впервые изучена динамика численности производственных штаммов ростстимулирующих бактерий в ризосфере различных сельскохозяйственных культур и почве. Показано, что штаммы активно колонизируют корни в различных почвенно-климатических условиях, в том числе при выращивании растений на загрязненных и кислых почвах, а также в условиях засухи. Обнаружены индивидуальные особенности штаммов, обусловленные генетическим контролем способности интродуцентов поддерживать численность популяции в ризосфере на определенном уровне.
   
4. Получены оригинальные данные о важности взаимодействия интродуцируемых штаммов с аборигенной бактериальной микрофлорой ризосферы растений. Впервые выделена и охарактеризована ассоциация ростстимулирующего интродуцента с фитопатогенным видом бактерий и описана способность биоконтрольных интродуцентов ингибировать активность полезных форм аборигенных бактерий.
   
5. Предложен метод селекции эффективных штаммов ростстимулирующих бактерий, обладающих высокой степенью ассоциативности, которая проявляется в их способности активно колонизировать корни проростков растений в нестерильной почве. Были изучены свойства и влияние на растения представителей сообществ культурабельных бактерий, доминирующих на корнях проростков ячменя, гороха и горчицы сатептской при выращивании растений на различных почвах, в том числе на загрязненных металлами почвах, на осадках сточных вод и горных отвалах. В результате исследований отселектированы штаммы с высоким потенциалом колонизации ризосферы, которые не уступают производственным штаммам по ростстимулирующей активности.
   
6. Впервые выделены и детально охарактеризованы устойчивые к тяжелым металлам ростстимулирующие бактерии, содержащие фермент АЦК деаминазу и колонизирующие ризосферу проростков растений, выращенных на загрязненных почвах. У большинства видов выделенных нами бактерий присутствие АЦК деаминазы ранее не было описано.
   
7. Впервые показано, что производственные штаммы ризобактерий и выделенные в ходе работы АЦК-утилизирующие бактерии повышают устойчивость инокулированных растений к токсичности кадмия и свинца. Важным механизмом ростстимулирующего эффекта бактерий на растения в присутствие тяжелых металлов является их способность поддерживать нормальное минеральное питание растений, и этим противодействовать негативному действию токсикантов.
   
8. Проведены оригинальные исследования о зависимости взаимодействия АЦК-утилизирующих бактерий с растениями от уровня минерального питания. Показано, что ростстимулирующий эффект бактерий может нивелироваться при дефиците фосфора и избытке азота в среде.
   
9. Экспериментально обоснована способность производственных штаммов ассоциативных бактерий повышать устойчивость инокулированных растений к негативному действию стрессов, вызванных неблагоприятными почвенно-климатическими факторами, такими как экстремальные температуры, повышенная кислотность почвы и засуха.
   
10. Впервые с помощью бактериального мутанта с пониженной активностью АЦК деаминазы и химических ингибиторов фитогормона этилена показана важная роль этого фермента в повышении устойчивости инокулированных растений к дефициту почвенной влаги.
    
11. Впервые описано положительное действие бактерий, содержащих АЦК деаминазу, на образование симбиоза бобового растения с клубеньковыми бактериями при дефиците влаги. Совместная инокуляция гороха этими бактериями существенно повышала количество клубеньков на корнях, как в оптимальных, так и в стрессовых условиях, вызванных недостаточным увлажнением.
    
12. Впервые изучен эффект бактериальной АЦК деаминазы на транспорт сигнальных молекул АЦК и абсцизовой кислоты (АБК) из корня в побег. Снижение концентрации АЦК и повышение концентрации АБК в ксилемном соке при инокуляции в условиях засухи указывает на индукцию бактериями системной устойчивости у растений.
    
13. Впервые обнаружено стимулирующее воздействие АЦК-утилизирующих бактерий на развитие корневых волосков у инокулированных растений.
    

Практическая ценность

Исследования имеют важное практическое значение для развития экологически безопасного и ресурсосберегающего сельскохозяйственного производства и поиска путей решения ряда экологических проблем:

1. Выделенные штаммы ростстимулирующих ассоциативных бактерий, которые являются активными колонизаторами корней и оказывают положительное действие на рост и минеральное питание растений, представляют собой ценный биологический ресурс для проведения прикладных исследований в земледелии. Штаммы АЦК-утилизирующих бактерий служат перспективными объектами для создания биопрепаратов нового типа, обладающих специализированным антистрессовым эффектом на растения и эффективных в неблагоприятных условиях, вызванных почвенно-климатическими и антропогенными факторами.
   
2. Экспериментальные данные о воздействиях производственных штаммов на растения и колонизации ризосферы интродуцентами обосновывают возможности эффективного применения биопрепаратов в широком диапазоне варьирования почвенно-климатических факторов, а том числе при стрессах, вызванных экстремальными температурами, повышенной кислотностью почвы, засухой и токсичностью тяжелых металлов.
   
3. Ряд наблюдений и выявленных закономерностей могут быть использованы в качестве практических рекомендаций для разработки и эффективному применению микробных биопрепаратов в сельском хозяйстве. Например, целесообразность использования комбинаций нескольких штаммов интродуцентов и селекции штаммов с высокой «буферностью» и эврибионтностью популяции, зависимость эффективности инокуляции АЦК-утилизирующими ризобактериями от уровня минерального питания растений, а также необходимость учета микробных взаимодействий в ризосфере при интерпретации данных о реакции растений на инокуляцию.
   
4. Результаты исследований важны для создания устойчивых к стрессам и высокопродуктивных растительно-микробных ассоциаций и ризосферных микробных сообществ, используемых в технологиях фиторемедиации загрязненных почв и восстановления нарушенных экосистем.
   

Апробация работы

Результаты работы были представлены на Республиканской научной конференции «Симбиотрофные азотфиксаторы и их использование в сельском хозяйстве» (Чернигов, 1987), на VIII Всесоюзном Баховском Коллоквиуме (Кобулети, 1988), на Всесоюзном совещании «Проблема азота в интенсивном земледелии» (Краснообск, 1990), на V Международном симпозиуме по несимбиотической азотфиксации (Florence, 1990), на Всесоюзных конференциях "Проблема азота в интенсивном земледелии" (Новосибирск, 1990) и "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992), на 9-м Баховском коллоквиуме (Москва, 1995), на Международных конференциях «Nitrogen fixation with Non-Legumes» (Giza, 1994), «The 1-st European Nitrogen Fixation Confference» (Szeget, 1994), "BIOTECHNOLOGY St.Petersburg' 94" (С.-Петербург, 1994), «BNF Associated with Rice» (Dhaka, 1994), «The 6-th International Symposium AABNF» (Herare, 1994), «Workshop on Associative Interactions of NF Bacteria with Plants» (Саратов, 1995), The 10-th International Congress «Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications» (С.-Петербург, 1995), «BNF with Non-Legumes» (Faisalabad, 1996), «Роль России и Сибири в развитии экологии на пороге XXI века» (Омск, 1997), «The 3-rd European Nitrogen Fixation Conference» (Lunteren, 1998), «New Approaches and Techniques in Breeding Sustainable Fodder Crops and Amenity Grasses» (С.-Петербург, 2000), «Tagungsband of the German Botanical Society» (Jena, 2000), «Trace Elements in Medicine» (С.-Петербург, 2002), «The 11-th International MPMI Congress» (С.-Петербург, 2003), «The 4-th International Crop Science Congress» (Brisbane, 2004), «Irrigation of Horticultural Crops» (Mildura, 2006), «Annual Main Meeting of the Society for Experimental Biology» (Glasgow, 2007), «Abiotic stress in legumes» (Tunis, 2007), и на Всероссийской конференции "Научные основы ведения агропромышленного производства в условиях крупных радиационных аварий" (Обнинск, 1996).

Исследования проводились в лаборатории экологии симбиотических и ассоциативных ризобактерий ГНУ ВНИИСХМ. Автор представлял результаты на семинарах в Санкт-Петербургском Аграрном Университете, ИБФРМ РАН (Саратов), университетах городов Вюрцбурга и Белефельда (Германия), Ватерлоо (Канада), Тегерана (Иран), Хитоцубаши, Мацуяма, Кобе и Киото (Япония), Сассари (Италия) и Ланкастера (Великобритания). Часть исследований выполнена в сотрудничестве с вышеперечисленными организациями, а также с Сибирским НИИСХ (г. Омск), Краснодарским ВНИИСХ, НИИОЗМСХ и ВНИИ овощеводства (г. Тирасполь), ВНИИМЗ (г. Тверь) и Агрофизическим НИИ (г. Санкт-Петербург).


Публикации

По материалам диссертации опубликовано 58 печатных работ, из которых 11 статей в международных рецензируемых журналах, 9 статей в отечественных рецензируемых журналах, 12 статей в сборниках и трудах конференций, и 26 тезисов докладов на конференциях.


Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, благодарностей, списка использованной литературы и списка публикаций по теме диссертации. Работа изложена на 356 страницах и включает 42 таблицы и 43 рисунка. Список литературы включает 543 наименования, в том числе 455 зарубежных.


СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ


1. Обзор литературы

В аналитическом обзоре литературы излагаются современные представления о научных достижениях и проблемах относящихся к теме проведенных исследований, а именно: (1) ризосфере как зоне взаимодействия растений и микроорганизмов; (2) механизмах положительных эффектов ассоциативных бактерий на растения; (3) взаимодействию растений с бактериями, содержащими фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу (4) эффективности инокуляции растений смешанными культурами бактерий; (5) взаимодействию интродуцируемых бактерий с ризосферной микрофлорой; (6) колонизации корней ассоциативными бактериями; (7) устойчивости почвенных бактерий к неблагоприятным факторам среды; (8) взаимодействию ассоциативных бактерий и растений в стрессовых условиях.

2. Объекты и методы исследований

Основными объектами исследований являлись: (1) производственные штаммы ассоциативных ростстимулирующих бактерий Azospirillum lipoferum 137, Arthrobacter mysorens 7, Agrobacterium radiobacter 10 и Flavobacterium sp. Л30, на основе которых во ВНИИСХМ разработаны биопрепараты комплексного действия (Хотянович, 1991); (2) выделенные из ризосферы ячменя штаммы Arthrobacter sp. ДР12 и Sinorhizobium sp. ДР65 (Белимов и др., 1999); (3) выделенные из ризосферы гороха и горчицы сарептской штаммы, содержащие фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу (Табл. 4). Растительными объектами служили важные сельскохозяйственные культуры: ячмень, горох, рапс, томаты и горчица сарептская.

В работе предложены оригинальные среды для выделения и изучения свойств бактерий: среда РЕ на основе экстрактов растений (Belimov et al., 2001), среда SMC для селекции бактерий утилизирующих АЦК в качестве источника углерода (Belimov et al., 2005) и среда РТМ с пониженным образованием комплексных соединений тяжелых металлов (Белимов и др., 1998). Детально описан предложенный автором метод изоляции ризобактерий из ризосферы проростков растений. Штаммы идентифицировали методами секвенирования гена 16S рРНК (Bulat et al., 1998; Preisfeld et al. 2000) и нумерической таксономии (Hold et al., 1994; Звягинцев, 1991). Активность АЦК деаминазы у бактерий определяли биохимическими методами (Jacobson et al., 1994; Saleh and Glick, 2001). Продуцирование индолов бактериями определяли с помощью реактива Сальковского (Libbert and Risch, 1969). Нитрогеназную активность определяли ацетиленовым методом (Hardy et al., 1973; Умаров, 1986). Продуцирование этилена бактериями определяли методом газовой хроматографии, а продуцирование сидерофоров - колориметрически (Schwyn and Neilands, 1987). Цитокининовую активность определяли по методу Кулаевой (Кулаева, 1973). Содержание белка в бактериях определяли методом Брэдфорда (Bradford, 1976). Устойчивость бактерий к тяжелым металлам и алюминию, а также иммобилизацию кадмия бактериями изучали в периодических культурах по оригинальным методикам (Белимов и др., 1998, 2004). Бактериостатическую активность метаболитов бактерий изучали методом агаровых пластинок (Ковров и др., 1981). Дефектные по активности АЦК деаминазы мутанты V. paradoxus 5C-2M4 и P. brassicacearum Am3Т8-1 получали методом транспозонного мутагенеза с последующей отрицательной селекцией при росте клонов на средах с АЦК (Belimov et al., 2007). Динамику численности бактерий в ризосфере и почве определяли методом интродукции устойчивых к рифампицину и стрептомицину мутантов (Звягинцев 1991) и с помощью вариантов маркированных геном GFP (Suarez et al., 1997). Использовали различные гнотобиотические растительно-бактериальные системы: модифицированные ростовые мешочки по методу Глика (Glick et al., 1997), систему Возняковской с фильтровальной бумагой (Возняковская, 1969) и ее модификацию (Belimov et al., 2001), и оригинальную cистему с агарозной средой (не опубликовано). Влияние бактерий на устойчивость ячменя к Н⁺ и Al⁺³ оценивали в условиях гидропоники (Климашевский 1988).

Были проведены вегетационные опыты, в большинстве которых семена инокулировали суспензиями 3-суточных культур бактерий в количестве 10⁷ кл./семя одновременно с посевом. Семена поверхностно стерилизовали 30% Н₂О₂, этиловым спиртом, конц. H₂SO₄, или 5% Na-гипохлоритом, в зависимости от эксперимента. Как правило, использовали 5-кратную повторность вегетационных сосудов на вариант. В опытах с горохом использовали клубеньковые бактерии R. leguminosarum bv. viciae 1026. Полевые опыты проводили на базе Краснодарского НИИСХ, ВНИИМЗ (г. Тверь) и СибНИИСХ (г. Омск). Растения выращивали по стандартным технологиям, принятым в регионах проведения экспериментов. Использовали бактериальные препараты, которые приготавливали и применяли в соответствии с рекомендациями Хотяновича (1991). Условия проведения, время и дизайн опытов, а также характеристика почв подробно описаны в диссертации. Потребление растениями азотных удобрений изучали методом разведения изотопа ¹⁵N (Rennie and Rennie, 1983; Соколов, 1975). Поступление в растения фосфорных удобрений изучали с помощью изотопа ³³Р (Соколов и Сердобольский, 1954). Содержание ортофосфата (P_i) в растениях определяли методом жидкостной хроматографии. Для изучения элементного состава растений и почв использовали методы Къельдаля, эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой, рентгено-флуоресцентного анализа, атомно-абсорбционной спектрофотометрии и пламенной фотометрии. Ксилемный сок из побегов гороха получали по методу Borel and Simonneau (2002), концентрацию АЦК определяли методом газовой хроматографии-массспектрометрии (Birkemeyer et al., 2003), а содержание АБК определяли методом радио-имуннного анализа (Quarrie et al., 1988).

Математические анализы выполнены с помощью программы STATISTICA V-6 (StatSoft, Inc. [1995], USA) в соответствии с рекомендациями Доспехова (1985), Лакина (1990) и Sokal and Sneath (1963).