История вирусологии. Принципы классификации вирусов

Вид материалаДокументы
Лабораторная диагностика вирусных гепатитов
Сравнительная характеристика
I. Гепатит А (гА).
II. Гепатит В (гВ).
Серологические маркёры при гепатите в
III. Гепатит С (гС).
IV. Возбудитель гепатита дельта (гепатит D).
Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции
1. Вирусологическая диагностика.
2. Серологическая диагностика.
3. Исследования иммунного статуса.
Развитие опухолей, оппортунистических инфекций и инвазий при вич-инфекции
Подобный материал:
1   2   3   4

Принципы терапии и профилактики вирусных инфекций


Химиотерапия и химиопрофилактика вирусных инфекций кардинально отличается от химиотерапии бактериальных инфекций. Вирусы - внутрикле­точные паразиты и не имеют тех мишеней, на которые действуют антибиотики у бактерий. Поэтому антибиотики для лечения вирусных инфекций, как прави­ло, не эффективны. Общая стратегия поиска противовирусных препаратов ос­нована на знании цикла репродукции вируса. Мишенью действия антивирус­ных веществ могут быть процессы адсорбции, проникновения вируса в клетку, процессы депротеинизации вируса, а также синтетическая фаза вирусной ре­продукции (транскрипция, трансляция и репликация), сборка, созревание и вы­ход вируса из клетки. Основываясь на этих принципах, в настояшее время по­лучены и успешно используются следующие группы противовирусных препара­тов:

1 группа - Аномальные нуклеозиды - аналоги предшественников нуклеи­нового обмена, ингибируют функции вирусных полимераз или включаются в цепочку нуклеиновой кислоты, делают её нефункциональной.

Аналог пиримидина - йоддезоксиуридин применяется для лечения гер­петических кератитов, кожного герпеса и цитомегалии. Пуриновые аналоги - видорабид применяют для лечения герпетических энцефалитов, ветряной оспы и опоясывающего герпеса. Ацикловир (зовиракс) - используют также для лече­ния разных видов герпетической инфекции. Рибовирин (виразол) - эффективен против РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Для лечения ВИЧ-инфекции получе­ны нуклеозидные аналоги, ингибирующие обратную транскриптазу ВИЧ, ази-дотимидин (зидовудин), тимазид (фосфатид), хивид (зальцитабин).

2 группа производные адамантанамина гидрохлорида. Препараты: амантадин и ремантадин ингибиругот репродукцию вирусов гриппа, кори, крас-

нухн. Наиболее эффективны в отношении гриппа А. Механизм действия на­рушение депротеинизации вируса.

3 группа - тиосемикарбазоиы. Препарат метисазои (марборап) активен против вирусов натуральной оспы. Механизм действия препарата заключается в подавлении синтеза вирусных белков и сборки вирусных частиц.

4 группа ингибиторы протеолитической активности вирусов. Сущность этого феномена заключается в том, что многие белки пикориа-, орто-, адено-, тога-, ретровирусов приобретают вирусную активность лишь после разрезания этих белков на фрагменты ферментами протеазами. Используют ингибиторы протеаз, такие как горлокс, контрикал, s-аминокапроновую кислоту, при лече­нии инфекций, вызванных этими вирусами. В нашей республике для лечения ВИЧ-инфекции используют препарат этой группы - инвиразу (саквннавир).

5 группа. Одно из новых и перспективных направлений химиотерапия создание препаратов типа «нуклеаз», способных повреждать вирусные гены, что даст возможность лечить интеграционные вирусные болезни.

6 группа интерфероны. В настоящее время используется -ннтерферон (лейкоцитарный ИФ) как для лечения, так и для профилактики, особенно рес­пираторных вирусных инфекций. Механизм действия - нарушение синтеза ви­русных белков. Широкое применение получил -интерферон или иммунный интерферон. -интерферон усиливает функцию Т-киллеров и естественных кил­леров, Т-эффекторов ГЗТ. Используется для лечения злокачественных опухолей и вирусных инфекций.

7 группа - вирусспецифические иммуноглобулины. которые получают из крови реконвалесцентов или специально вакцинированных доноров. Использу­ются для профилактики кори, гепатитов А, В, гриппа, парагриппа и других ви­русных инфекций (для профилактики бешенства используется антирабический иммуноглобудин, полученный из крови иммунизированных животных). Ig ин­терферируют с вирионами, предотвращают адсорбцию вируса на чувствитель­ных клетках.

8 группа - Вакцины. Для профилактики ряда вирусных инфекций в на­стоящее время используют убитые вакцины, содержащие ипактивировашше формалином или -цропнолактоном вирусы (вакцина против гриппа, кори, по­лиомиелита, японского и клещевого энцефалитов, бешенства), живые (аттенуированные) вирусные вакцины, содержащие вирусы с ослабленной вирулент­ностью (вакцина против гриппа, кори, эпидемического паротита, краснухи, по­лиомиелита, бешенства, жёлтой лихорадки и др.); субъедипичные вакцины, со­держащие вирусные протективные антигены (субъединицы) (вакцине против гриппа); рекомбипантные (генно-инженерные) вакцины (вакцина против гепа­тита В, для получения которой ген, кодирующий HBs-антиген, внедрен в геном дрожжевой клетки). В стадии разработки находятся синтетические вакцины.


Лабораторная диагностика вирусных гепатитов


В настоящее время в категории вирусных гепатитов рассматривается 7 амостоятельных нозологических форм: гепатиты А, В, С, D, E, F, G. По путям передачи вирусные гепатиты делят на:

1. Энтеральные, передающиеся фекально-оральным путём. К ним отно­сятся гепатиты А, Е и, очевидно, F.

2. Парентеральные, передающиеся через парентеральные манипуляции, включая, в естественных условиях, трансплацентарный и половой пути переда­чи. К ним относятся гепатиты В, С, D, G.

Наибольшее распространение получили гепатиты А, В, С, сравнительная характеристика которых представлена в табл. 3.


Таблица 3


СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ А, В, С


Признак


Гепатит А


Гепатит В


Гепатит С


Вирус (семейство)


Picomaviridae


Hepadnaviridae


Flaviviridae


Тип нуклеиновой кислоты


однонитчатая +РНК


двунитчатая ДНК с однонитчатым участком


однонитчатая +РНК


Размер вириона


27-32 нм


42-45 нм


30-60 нм


Суперкапсид


отсутствует


имеется


имеется


Путь заражения


фекально-оральный


парентеральный


парентеральный


Инкубационный период


в среднем 25-30 дней


в среднем 60-90 дней, может быть до 6 месяцев


в среднем 35-70 дней


Возрастные группы


преимущественно дети до 1 5 лет


дети и взрослые


дети и взрослые


Сезонность


чаше август-сентябрь


в течение всего года


в течение всего гоги


Переход в хрониче­скую форму


отсутствует


имеет место


имеет место в

50 % случаев


Носительство


отсутствует


длительное


длительное


Онкогенность


отсутствует


имеет место


имеет место



I. Гепатит А (гА). Лабораторная диагностика гА основывается либо на выявлении самого возбудителя (метод иммунной электронной микроскопии - ИЭМ), его антигенов (радиоиммунный, иммуноферментный, иммунофлюорес-центный метод - РИА, ИФА, ИФ) или антител к вирусу гА (РИА, ИФА).

Для ранней диагностики заболевания, а также выявления источников ин­фекции используется определение антигена вируса гА в фекалиях больных, где он появляется за 7-10 дней до клинических симптомов и в первые дни заболе­вания.

Из определяемых в настоящее время специфических маркёров гА важ­нейшими являются антитела класса Ig M к вирусу гА, которые появляются в сыворотке крови и слюне уже в начале заболевания и сохраняются в течение 3-6 месяцев. Обнаружение антител класса Ig M к вирусу гА однозначно свидетельствует о гепатите А и используется для диагностики заболевания, в том числе и бессимптомных случаев инфекции,и выявления источников инфекции в очагах.

Антитела к вирусу гА класса Ig G выявляются с 3-4-й недели заболевания и сохраняются длительно, что позволяет оценить состояние иммунитета насе­ления, динамику специфического гуморального иммунитета.

Вирус гепатита А в материале от больного можно выявить методом им­мунной электронной микроскопии. В основе метода лежит смешивание суспен­зии вируса с антисывороткой, отделение иммунных комплексов и исследование их в электронном микроскопе.

II. Гепатит В (гВ). В организме людей, заражённых вирусом гВ, с разной частотой и на разных этапах могут выявляться серологические маркёры: по­верхностный HBs Ag и сердцевинный НВе Ag, а также антитела к ним (anti-НВс, anti-HBe, anti-HBs). Динамика их появления и интерпретация результатов представлены в табл. 4 и 5.


Таблица 4

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЁРЫ ПРИ ГЕПАТИТЕ В





Таблица 5

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЁРОВ ПРИ ГЕПАТИТЕ В


Антигены


Антитела к HBs-Ar


Антитела кНВс-Аг


Интерпретация


BHs


НВе


fgG


IgM





+


+







+


Острая фаза гепатита


+


±




+





Хронический гепатит В


+











Носительство








+






Гепатит В в прошлом















В прошлом не было гепатита В



Все антигены и соответствующие им антитела могут служить индикато­рами инфекционного процесса.

Наличие вирусной ДНК, HBs Ag, НВе Ag и anti-HBc класса Ig M свиде­тельствует об остром периоде инфекции. В период реконвалесценции - это anti-НВс-антитела класса Ig G и выявляются они совместно с anti-Hbs-антителами. Длительное присутствие в крови HBs-Ag, HBe-Ag и anti-HBc (IgG) - неблаго­приятный признак, свидетельствующий о формировании хронического процес­са.

При формировании длительного носительства постоянно определяется HBs Ag. Для обнаружения антигенов и антител используют РПГА, РИА и ИФА. Для обнаружения HBs Ag используется РОПГА - реакция обратной пассивной гемагглютинации с обязательным положительным контролем на HBs Ag.

III. Гепатит С (гС). Вызывается РНК-содержащим вирусом, который от­носится к семейству Flaviviridae. Диаметр вирионов 30-60 нм, чувствительны к обработке хлороформом. Позитивная одноцепочечная РНК кодирует синтез трёх структурных и пяти неструктурных белков. Гепатит С по клияико-биохимическим признакам сходен с гепатитом В. У 60% инфицированных лиц заболевание переходит в хроническую форму, а у 20% хронических больных развивается цирроз печени. Механизм передачи вируса гепатита С в основном парентеральный. Лабораторная диагностика гС основана на определении анти­тел к вирусу гС методами ИФА или РИА.

IV. Возбудитель гепатита дельта (гепатит D). РНК-содержащий, де­фектный вирус, способный решшцироваться в организме хозяина лишь при обязательном участии вируса-помощника, роль которого выполняет вирус гВ. Оболочку вируса-дельта формирует HBs Ag. Присоединение дельта-инфекции к гВ ведет к развитию тяжёлых злокачественных форм болезни, хронических форм заболевания с ранним формированием цирроза печени.

Лабораторная диагностика гепатита D проводится путём обнаружения маркёров вируса гВ и дельта-вирусной инфекции, HBs Ag, anti-HBc (Ig M) и дельта Ag. Последние тестируются при помощи ИФА и РИА. Наибольшее диаг­ностическое значение имеют антидельта Ig M, которые обнаруживаются в те­чение всего заболевания.

V. Гепатит Е. Широко распространён в тропических и субтропических странах, распространение заболевания происходит водным путём. Вирион диаметром 27-32 им содержит однонитчатую РНК, по физико-химическим свойствам схож с вирусами семейства Calicivmdae. Лабораторная диагностика основана на определении AT в сыворотке крови ИФА.

VI. Гепатит G. Вирус гепатита G открыт в 1995 г., отнесён в семейству Flaviviridae, передаётся парентеральным путём Размеры вириона - 20-30 нм Геном вируса представлен однонитчатой +РНК. Белок капсида дефектный или совсем не синтезируется. Поэтому предполагают, что вирус гепатита G для своего капсида использует или белки ещё не открытых вирусов, или же кле­точные белки. Имеются указания на наличие липидной оболочки у вируса. Маркёр репликации вируса - его РНК. Антитела против Е 2 белка вируса гепа­тита G выявляются только при отсутствии РНК вируса. Это свидетельствует, что, в отличие от гепатита С, выявление антител при гепатите G не может быть использовано для поиска вирусоносителей, а пригодно для регистрации уже прошедшей инфекции.

VII. Гепатит F. Вирус гепатита F открыт французскими учёными и фак­тически не изучен.


Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции


При диагностике ВИЧ-инфекции используется 4 группы методов:

1. Определение наличия вируса, его антигенов или копий РНК в мате­риалах от больного или ВИЧ-инфицированного

2. Серологическая диагностика, основанная на выявлении специфических антител к поверхностным (gp 120 и gp 41) и внутренним (р 18 и р 24) белкам ВИЧ.

3. Выявление патогномоничнъгх (специфических) для ВИЧ-инфекции изменений в иммунной системе.

4. Лабораторная диагностика оппортунистических инфекций (СПИД-ассоциированных заболеваний).

1. Вирусологическая диагностика. Материалом для выделения ВИЧ являются Т-лимфоциты крови, лейкоциты костного мозга, лимфатические узлы, ткани мозга, слюна, сперма, спинномозговая жидкость, плазма крови. Полу­ченным материалом заражают перевиваемую культуру Т-лимфоцитов (Н9). Индикацию ВИЧ в культуре клеток проводят по ЦПД (образование симпла-стов), а также методами иммунофлюоресценции, электронной микроскопии, по выраженной активности обратной транскриптазы. Современные методы ис­следования позволяют обнаружить один инфицированный лимфоцит на 1000 клеток.

Выявление вирусных антигенов в инфицированных Т-лимфоцитах осу­ществляют с помощью моноклональнъгх антител

В последние годы решающее значение для определения прогноза и тя­жести ВИЧ-инфекции имеет определение количества копий РНК ВИЧ в плазме крови методом полимеразной цепной реакции (ТТЦР) - так называемая вирусная нагрузка. Если у пациентов, не получающих терапии, вирусная нагрузка находится ниже предела определения (это менее 5000 копий РНК ВИЧ в I мл плазмы), это свидетельствует об отсутствии прогрессирования или о медленном прогресси-ровании. Степень заразности при этом минимальная. Высокая вирусная нагруз­ка (более 10000 копий РНК в 1 мл плазмы) у пациентов с числом СО4-лимфоцитов менее 300 в 1 мкл всегда свидетельствует о прогрессировании болезни.

2. Серологическая диагностика. В настоящее время получила наиболь­шее распространение.

Материал для исследовать: 5 мл. гепаринизированной крови, которую до доставки в лабораторию можно хранить 6-8 часов в охлажденном, но не в замороженном состоянии.

С целью серологической диагностики СПИДа используют прежде всего методы иммуноферментного анализа со стандартными иммуноферментными системами (ИФА). Это скрининговый метод. Принцип работы основан на клас­сическом принципе прямого ИФА. Иммуносорбентом являются полистироло­вые планшеты с иммобилизированным инактивированным вирусспецифиче-ским антигеном, полученным из ВИЧ, либо синтетическим путем. Затем вносят испытуемую сыворотку в разведении. Проводят инкубацию в лунках с антиге­ном. После связывания АГ с AT следует трехкратное отмывание несвязавшихся белков, а после этого в лунки вносят коньюгат антител к иммуноглобулинам человека с ферментной меткой. Образование специфического комплекса АГ+АТ выявляют внесением субстрата для фермента (раствор ортофенилендиамина и перекиси водорода). В результате окраска среды меняется пропорционально ко­личеству антител. Результаты исследования учитывают на спектрофотометре. Сыворотки крови, имеющие вирусспецифические антитела по данным ИФА, в дальнейшем необходимо исследовать методом иммунного блотинга.

Иммунный блотипг является подтверждающим тестом, так как позволяет выявить антитела к различным белкам ВИЧ. Он основан на предварительном фракционировании по молекулярной массе (разделении) белков ВИЧ электро­форезом в полиакриламидном геле с последующим перенесением антигенов на мембрану из нитроцеллюлозы. Затем на мембрану наносится испытуемая сыво­ротка. При этом специфические антитела образуют комплекс с конкретным АГ (gp.120, gp.41, p.24, p.18). Заключительный этап исследования - выявление ан­тител к различным белкам ВИЧ. Для этого в систему добавляют антитела про­тив белков человека, меченые ферментом или радиоизотопной меткой. Таким образом, в сыворотке пациента выявляют (либо не выявляют) вирусспецифиче­ские антитела ко всем или большинству антигенов ВИЧ.

3. Исследования иммунного статуса. Направлены на выявление:

1) уменьшения соотношения CD4/CD8 клеток (в N 2 и >, при СПИДе - 0,5 и <);

2) снижения содержания CD4 клеток (<200 клеток/мл.);

3) наличия одного из лабораторных признаков, включающих анемию, лейкопе­нию, тромбошггопению, лимфопению;

4) повышения концентрации Ig А и Ig G в сыворотке крови;

5) снижения реакции бластгрансформации лимфоцитов на митогены;

6) отсутствие кожной реакции ГТЗ на несколько антигенов;

7) повышение уровня циркулирующих иммунных комплексов.


РАЗВИТИЕ ОПУХОЛЕЙ, ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЙ И ИНВАЗИЙ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ


Клетки ЦНС

ВИЧ

Т-хелперы

Энцефалопатия деменция

Нарушение ГИО и КИО

Нарушение функции Т-киллеров

онтогенез

Саркома Капоши, лимфома мозга

оппортунистические инфекции, инвазии, вызванные

вирусами

простейшими

бактериями

грибами

гельминтами
  • Герпес симплекс I и II типа;
  • Герпес зостер;
  • Цитомегаловирус;
  • Вирус Эпштейна-Барр;
  • Паповирусы.
  • Пневмоцисты;
  • Токсоплазмы;
  • Криптоспоридии;
  • Изоспоры.



  • Микобактерии;
  • Камполибактерии;
  • Сальмонеллы;
  • Шигеллы;
  • Легионеллы;
  • Микоплазмы;
  • Актиномицеты;
  • Листерии.
  • Кандиды;
  • Криптококки;
  • Аспергиллы;
  • Мукоровая плесень;
  • Гистоплазма.