Использование методов биотехнологии для получения здорового посадочного материала осины ( populus tremula L.) В условиях республики татарстан 06. 03. 01 Лесные культуры, селекция, семеноводство
| Вид материала | Лекция |
- Выращивание селекционного посадочного материала яблони в ботаническом саду им. Вс., 681.03kb.
- Отбор дуба для использования его древесины в виноделии 06. 03. 01 Лесные культуры,, 510.4kb.
- Рекреационная ценность лесопарковых ландшафтов и возможности ее повышения (на примере, 363.65kb.
- Создание исходного материала для селекции барбариса ( berberis L.) В условиях юго-запада, 480.16kb.
- Конкурс проводится Центральной избирательной комиссией Республики Татарстан совместно с Министерством культуры Республики Татарстан и, 78.63kb.
- Селекция баклажана для аридной зоны нижнего поволжья 06. 01. 05 Селекция и семеноводство, 336.5kb.
- Создание сортов и совершенствование технологии возделывания луковых культур в условиях, 767.7kb.
- Чайковского Управления Культуры города Казани; диплом, 36.78kb.
- Кабинет Министров Республики Татарстан проект закон, 1470.26kb.
- Республики Татарстан «Осоциальной политике в Республике Татарстан», 248.31kb.
4. ИЗУЧЕНИЕ СОМАКЛОНАЛЬНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ
ПРИ РАЗМНОЖЕНИИ ОСИНЫ В УСЛОВИЯХ «IN VITRO»
4.1. Индукция и пролиферация каллусной ткани
Каллусная культура – это неорганизованно пролиферирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. В дальнейшем они специализируются как каллусные, т.е. становятся особым образом дифференцированными. Каллус, что означает «мозоль», может образовываться как на изолированных кусочках ткани (эксплантах) in vitro, так и на растении при поранении.
Обязательным условием дедифференцировки растительной клетки и превращения ее в каллусную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, подготавливающий ее к делению, а цитокинины — пролиферацию (деление) дедифференцированных клеток. Каллусную ткань можно получить на искусственных питательных средах из различных частей растений: стеблей, корней, тканей клубня, листа, зародыша и др.
Нами экспериментально установлено, что состояние и размер первичного экспланта играет существенную роль в процессах каллусо- и морфогенеза. Так, в наших исследованиях лучшие результаты по способности к каллусообразованию были получены от черенков с более крупными почками (рис. 1).
Рисунок 1 - Зависимость процесса каллусогенеза от размера
первичного экспланта
В культуру были введены черенки, содержащие по 2-3 почки. Визуально появление каллуса отмечали на 20-й день с начала культивирования. Прирост каллусной массы наблюдали в течение 45 дней. Наиболее удачной средой для каллусообразования оказалась питательная среда MS в сочетании со стимуляторами каллусогенеза НУК (0,5 мг/л) и БАП (0,5 мг/л). Питательная среда МS, содержащая в качестве стимуляторов каллусогенеза 2,5 мг/л 2,4-Д и 2,0 мг/л цитодеф оказалась менее эффективной. Полученные результаты приведены в таблице 1.
Таблица 1 - Влияние состава питательной среды на
каллуссообразование у осины
| Состав питательной среды | Количество эксплантов, образовавших каллус, % |
| MS + НУК 0,5 мг/л + БАП 0,5 мг/л | 80,0 ± 0,3 |
| MS + 2,4-Д 2,5 мг/л + цитодеф 2,0 мг/л | 76,4 ± 0,2 |
Полученную каллусную ткань субкультивировали каждые 1,5 месяца. В процессе пересадки учитывали интенсивность роста каллусной ткани. Опыты проводили в 3-х повторностях.
Интенсивность роста (ИР) (%) каллусной ткани рассчитывали по формуле:
сырая масса 2 – сырая масса 1
ИР = -------------------------------------------- * 100,
сырая масса 1
где сырая масса 1 – вес каллусной ткани (мг) в начале пассажа; сырая масса 2 – вес каллусной ткани (мг) в конце пассажа.
674 - 378
ИР = ------------------- * 100 = 78,3
378
Данные о каллусогенезе и органогенезе эксплантов приведены в таблице 2.
Таблица 2 - Каллусогенез и органогенез эксплантов,
изолированных из почек осины
| Первичный эксплант | Количество эксплантов, шт. | Число каллусов, образующих, % | Способность каллусной ткани к | |||
| высажено | образовали каллус | корни | зачатки стебля | ризоге- незу +/- | образованию адвентивных почек +/- | |
| Черенок с почкой | 110 | 86 | 0 | 68,1 | - | + |
Экспериментально установлено, что большинство высаженных эксплантов были способны формировать каллусную ткань (78,2%). Характеристика каллусной ткани осины приведена в таблице 3.
Таблица 3 - Характеристика каллусной ткани осины
| Эксплант, образовавший каллус | Морфологическая характеристика каллусной ткани | Сырой вес, мг | ||||
| интенсивность каллусообразования* | цвет каллусной ткани | наличие меристематических очагов + \ - | консистенция | в начале пассажа | в конце пассажа | |
| Почка | +++ | зеленый | + | плотная | 378 | 674 |
*Интенсивность каллусообразования (++++ максимальная)
Как следует из таблицы 3, интенсивность каллусообразования высокая. Каллусная ткань имеет зеленый цвет и плотную консистенцию. Она характеризовалась наличием меристематических очагов, из которых в дальнейшем формировались растения-регенеранты.
4.2. Получение растений-регенерантов осины из каллусной ткани
В условиях in vitro проблема регуляции дифференциации и морфогенеза носит определенный специфический характер, так как клетки в этих условиях лишаются тканевого и организменного контроля, который определяет их судьбу и дифференциацию в целом растении. Хотя каллусные растительные клетки потенциально тотипотентны, однако частота экспрессии тотипотентности, перепрограммирование клетки и образование эмбриоидов или зачатков апексов стебля или корня происходят с частотой, не превышающей 1-3% от общего числа клеток. Успех морфогенеза определяется генотипом исходного растения, эпигенетической характеристикой клеток экспланта и условиями выращивания (Катаева Н.В., Бутенко Р.Г., 1983), которые подчиняются контролю со стороны исследователя.
В наших исследованиях мы культивировали морфогенные каллусы осины. В вариантах с БАП способность каллусной ткани к морфогенезу в среднем на 23,6% меньше, чем в вариантах с 2iр (рис. 2). Пересадку осуществляли 1 раз в 1,5 месяца. Формирование первичных микропобегов в каллусной ткани происходило в течение 30-35 дней.
Р
исунок 2 - Зависимость морфогенеза из каллусной ткани и
пазушных почек от состава питательной среды
Результаты по количеству растений, полученных из каллусной ткани, в зависимости от состава питательной среды представлены в таблице 4.
Таблица 4 - Влияние факторов гормональной и негормональной
природы на регенерацию зелёных побегов из каллусной ткани осины
| Гормональный состав питательной среды | Регенерация зелёных побегов, % | Среднее число побегов, полученных из одного каллуса, шт. |
| WPM + 2iр 2 мг/л + ИУК 0,5 мг/л | 65 | 6,0 ± 0,2 |
| WPM + БАП 2 мг/л + ИУК 0,5 мг/л | 63 | 5,0 ± 0,3 |
В результате проведенных нами экспериментов установлено, что наиболее оптимальной питательной средой для регенерации из каллусной ткани растений осины является питательная среда WPM, содержащая 2iр 2 мг/л и ИУК 0,5 мг/л. Критерий Стьюдента (t) показывает на наличие достоверной разницы между количеством побегов, выращенных на разных питательных средах (t=5,5>3). Нами были получены растения-регенеранты как из каллусной ткани, так и путем прямого морфогенеза – индукция образования побегов из пазушных почек (меристем). Для этого мы использовали два варианта питательных сред: WPM + 2iр 1 мг/л + ИУК 0,5 мг/л и WPM + БАП 1 мг/л + ИУК 0,5 мг/л. В вариантах с БАП интенсивность роста побегов, также как и при получении растений-регенерантов из каллусной ткани, оказалась в среднем на 23,6% меньше, чем в вариантах с 2iр (рис. 2).
При субкультивировании каллуса учитывали следующие показатели: процент морфогенных каллусов и процент регенерации растений.
Физиологический возраст первичного экспланта, из которого была получена каллусная ткань, имеет несомненное значение в проявлении способности каллусных клеток к морфогенезу (Бутенко Р.Г., 1984). Способность к морфогенезу не одинакова у разных органов одного и того же растения. Чем моложе орган, тем быстрее идет развитие экспланта (Дмитриева Н.Н., 1980, Высоцкий В.А., 1986). Установлена прямая корреляция между возрастом первичного экспланта и морфогенезом: чем моложе эксплант, тем большей морфогенетической активностью обладают каллусные клетки. С увеличением возраста исходного материала, как правило, снижается способность каллусной ткани к морфогенезу.
В наших исследованиях использовали молодые побеги, изолированные с устойчивых к сердцевинной гнили клонов осины. Нами получен большой процент морфогенных каллусов (72%). Результаты свидетельствуют о высоком морфогенетическом потенциале каллусной ткани, который составил 64%. В связи с этим можно заключить, что способ выращивания регенерантов осины из каллуса имеет определенные преимущества и может быть применен для получения высококачественного посадочного материала осины, устойчивой к сердцевинной гнили.
4.3. Морфофизиологические характеристики растений-регенерантов
осины, полученные из каллусной ткани
В результате проведенных исследований нами было установлено, что регенеранты, полученные путем прямого морфогенеза – индукция образования побегов из пазушных почек (меристем) – характеризовались быстрым ростом и формированием однородных побегов (по морфологии). В то время как растения, полученные из каллусной ткани отличались различной скоростью роста. Были получены растения двух типов: 1) растения, характеризующиеся быстрым ростом, 2) растения, характеризующиеся медленным ростом. По морфологическим характеристикам данные растения не отличались друг от друга, однако проведенные биохимические исследования позволили выявить некоторые отличия по содержанию растворимых фенольных соединений. Так у растений, обладающих быстрым ростом на протяжении 5 пассажей, суммарное содержание растворимых фенольных соединений было на уровне 30 – 33 мг/г сырой массы, а у растений с медленным ростом данный учитываемый показатель существенно возрос и составил 52-58 мг/г сырой массы (рис. 3).
Можно сделать предположение, что медленный рост обусловлен повышенным содержанием фенольных соединений в тканях растений, которые в свою очередь, могут вызывать ингибирование ростовых процессов. Получен-
Рисунок 3 - Суммарное содержание растворимых фенольных
соединений в растениях-регенерантах осины
(контроль – растения, полученные из пазушных почек; растения первого типа – растения, полученные из каллусной ткани, характеризующиеся быстрым ростом; растения второго типа – растения, полученные из каллусной ткани, характеризующиеся медленным ростом)
ные данные согласуются с результатами многих исследователей, свидетельствующие об ингибировании ростовых процессов фенольными соединениями, которые синтезируются в тканях растений, как в условиях in vitro, так и в условиях in vivo (Кефели, 1974; Крамер, Козловский, 1983).
Таким образом, растения-регенеранты, полученные из каллусной ткани, отличались между собой по скорости роста, что, возможно, обусловлено изменением биохимических процессов, в частности фенольного метаболизма. Кроме того, нами были обнаружены изменения и на уровне числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц (рис. 4).
Рисунок 4 - Содержание хлоропластов в замыкающих клетках устьиц
у быстрорастущих и медленнорастущих растений
Как видно на схеме, растения из каллуса отличаются количеством хлоропластов в клетках замыкающих устьиц (листовая пластинка). Наибольшее их количество было обнаружено у быстрорастущих растений, и наоборот – наименьшее – у медленнорастущих.
Таким образом, по всем этим показателям можно говорить о сомаклональной изменчивости. Являясь источником расширения генетического разнообразия исходного материала, сомаклональная изменчивость может быть использована в селекции для получения новых хозяйственно ценных генотипов. Растения-регенеранты осины, характеризующиеся быстрым ростом, могут успешно использоваться в лесном хозяйстве для получения необходимого количества высококачественного посадочного материала данной культуры.
5. РАЗМНОЖЕНИЕ ОСИНЫ МЕТОДОМ «IN VITRO»
В УСЛОВИЯХ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН
5.1. Введение в культуру in vitro
Интерес к работе с осиной (Populus tremula L.) вызван главным образом необходимостью оздоровления осинников республики, быстрыми сроками поспевания и трудностью размножения черенками. Для осины применение клонального микроразмножения является наиболее перспективным способом, так как семена данной породы быстро теряют всхожесть. Также к недостаткам семенного размножения относятся генетическая пестрота семенного материала и длительность ювенильного периода. Введение в культуру in vitro осины и ее последующее размножение необходимо с целью получения необходимого количества посадочного материала, который может использоваться для производства плит OSB, в многочисленных хозяйственных отраслях, в том числе и как источника энергии, а также для оздоровления лесов Республики Татарстан, т.е. иметь большое экологическое значение.
В культуру было введено 60 почечных меристем осины (30 – от диплоидной и 30 – от триплоидной осины). Рост меристематических тканей диплоидной осины стал наблюдаться на 7 день, а триплоидной осины – на 5 день. Формирование микропобегов на первичном экспланте происходило в течение 1 месяца. Результаты культивирования почечных меристем осины приведены в таблице 5.
Таблица 5 - Результат культивирования апикальных меристем почек осины
| Объект | Количество меристем, шт. | Регенерация побегов, шт. | Регенерация, % | |
| высажено | выжило | |||
| Изолированная почка (диплоидная осина) | 30 | 24 | 21 | 70 |
| Изолированная почка (триплоидная осина) | 30 | 28 | 27 | 90 |
Как видно из таблицы, количество выживших меристем триплоидной осины оказалось больше, чем диплоидных. Критерий Стьюдента (t) показывает на наличие достоверной разницы между формами осины и выживаемостью высаженных почек и регенерацией побегов (t=5,1>3). Использован метод χ2 для непараметрических показателей связи. В результате исследований было установлено, что триплоидные формы осины обладают большим морфогенетическим потенциалом (90%), по сравнению с диплоидными (70%). Это проявлялось в способности меристем формировать микропобеги уже на первом этапе культивирования. Так во всех исследуемых вариантах из изолированных почек диплоидных форм развивались микропобеги, которые в течение одного месяца культивирования достигали высоты 1 см, в то время как триплоидные формы формировали микропобеги высотой 3 см. Полученные пробирочные растения из всех вариантов в дальнейшем использовали в исследованиях по микроразмножению.
Таким образом, полученные результаты говорят о влиянии генотипа осины на рост и развитие микропобегов.
5.2. Собственно микроразмножение
Одним из преимуществ метода клонального микроразмножения является высокий коэффициент размножения, который возможно достичь путем микрочеренкования пробирочных растений. Сформировавшиеся на первичном экспланте микропобеги с 5-6 листочками, микрочеренковали и рассаживали в большее количество колб. Из одного микропобега получали 5-8 черенков. Микропобеги, выращенные из меристемы триплоидной осины характеризовались более интенсивным ростом по сравнению с растениями диплоидных форм, поэтому из них получали больше черенков. Каждый черенок содержал одну или две пазушные почки. Особую ценность представляет черенок с верхушечной почкой, т.к. она содержит больше меристемы (образовательная ткань), чем пазушная почка.
Пересадку (пассирование) микрочеренков осуществляли на безгормональную среду. Однако в зимний и ранне-весенний период, когда рост микропобегов был замедленный в питательную среду добавляли синтетический аналог кинетина БАП. Готовые черенки размещали таким образом, чтобы почка соприкасалась с питательной средой. Культивирование микрочеренков на среде MS с небольшой концентрацией БАП позволило получить большое количество микропобегов осины. Коэффициент размножения практический и рассчитанный приведен в таблице 6. Рост микрочеренков происходил в течение 1 месяца.
Таблица 6 - Коэффициент размножения практический и рассчитанный
| Генотип | Количество микропобегов из одного экспланта, шт. | Коэффициент размножения, шт. | |||||
| рассчитанный | практический | ||||||
| II пассаж | V пассаж | X пассаж | XII пассаж | II пассаж | III пассаж | ||
| Триплоидный | 8 | 64 | 32 768 | 1 073 741 824 | 68 719 476 736 | 58 | 450 |
| Диплоидный | 5 | 25 | 3125 | 9 765 625 | 244 140 625 | 22 | 98 |
Таким образом, как видно из таблицы, при такой технологии размножения из одной введенной в культуру почки можно получать достаточное для производственного масштаба количество здорового посадочного материала.
5.3. Укоренение микропобегов осины
Укоренение микропобегов – трудоемкий и ответственный этап клонального микроразмножения. На этом этапе мы применяли среду Мурасига и Скуга. В качестве стимулятора корнеобразования использовали ИМК (β-индолил-3-масляную кислоту). Посаженные на среду для укоренения микрочеренки через 1-1,5 месяца превратились в окорененные растеньица. Растения считались полностью сформированными и готовыми к адаптации к почвенным условиям, когда на каждом формировалось по 2-3 листа и развивалась мощная корневая система. Сформировавшиеся растения осины в условиях in vitro отличались по биометрическим показателям, несмотря на одинаковый срок их выращивания in vitro (табл. 7).
Таблица 7 - Биометрические показатели пробирочных растений осины
| Регенеранты | Средняя высота пробирочных растений, см | Количество растений с корнями, % |
| Диплоидные, F 2 | 1,5 ± 0,4 | 76,0 ± 0,2 |
| Триплоидные, F 3 | 3,7 ± 0,2 | 95,0 ± 0,3 |
Растения-регенеранты диплоидных форм имели высоту от 0,5 до 2,5 см, большая часть из которых отличалась развитой корневой системой (длина корней от 1,5 до 3,5 см), в то время как триплоидные формы характеризовались более интенсивным ростом (2,0-5,5 см в высоту) и в 95% имели хорошо развитую корневую систему (от 2,5 до 6,0 см). Причем различия по критерию Стьюдента (t) достоверны. По высоте пробирочных растений t=5>3, по количеству растений с корнями t=52,3>3.
5.4. Адаптация пробирочных растений к почвенным условиям
Срок высадки в теплицу, как показал наш опыт, влияет на приживаемость пробирочных растений. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений – весна или начало лета. Данные по количеству высаженных диплоидных и триплоидных регенерантов приводятся в таблице 8.
Таблица 8 - Количество высаженных диплоидных и триплоидных
регенерантов осины
| Регенеранты | В пакетах (с корнями), шт. | В грунте (с корнями), шт. | В грунте (без корней), шт. |
| Диплоидные, F 2 | 170 | 110 | 88 |
| Триплоидные, F 3 | 210 | 129 | 20 |
Растения с 2-3 листьями и хорошо развитой корневой системой способны адаптироваться к условиям in vivo. Приживаемость пробирочных растений осины составила в среднем 47,5%. Отрицательное влияние оказали погодные условия периода после высадки.
Результаты статистического анализа по высоте растений-регенерантов осины и по длине их корней приведены в таблицах 9 и 10.
Таблица 9 - Результаты статистического анализа по высоте
диплоидных и триплоидных растений-регенерантов осины
| Форма | Н, см | ±σ, см | ±mx, см | Р, % | V, % |
| Диплоидные | 1,8 | 0,6 | 0,02 | 1,1 | 31 |
| Триплоидные | 3,9 | 1 | 0,05 | 1,3 | 25,6 |
Таблица 10 - Результаты статистического анализа по длине корней
диплоидных и триплоидных растений-регенерантов осины
| Форма | Н, см | ± σ, см | ±mx, см | Р, % | V, % |
| Диплоидные | 2,7 | 0,6 | 0,03 | 1,1 | 20,1 |
| Триплоидные | 4,2 | 1 | 0,06 | 1,4 | 23,8 |
По высоте растений и по длине их корней точность (P) высокая — в пределах 1%. Это объясняется большим количеством наблюдений. Но коэффициент вариации (V) показывает на большую изменчивость изучаемых признаков. Такую большую изменчивость в высоте изучаемых растений и длине их корней можно объяснить существенными различиями в исходном материале. Различия по критерию Стьюдента (t) достоверны: по высоте диплоидных и триплоидных пробирочных растений t=14>3, по длине их корней t=6,8>3.
При изучении влияния субстрата на рост и приживаемость растений-регенерантов осины эксперимент показал, что все испытываемые субстраты пригодны для выращивания саженцев осины. Однако эффективность субстратов была различной. Самая лучшая приживаемость оказалась на субстрате №2 - почвогрунт + дерновая почва + песок (1:1:1), чуть меньше - № 3 - почвогрунт и № 1 - почвогрунт + песок (1:1).
Немаловажное значение, на наш взгляд, при адаптации пробирочных растений к почвенным условиям имеет высота и физиологическое состояние (например, степень укоренения) растений-регенерантов, а в итоге на приживаемость регенерантов (табл. 11).
Таблица 11 - Приживаемость диплоидных и триплоидных
растений-регенерантов осины
| Генотип | Количество высаженных регенерантов осины, шт. | Количество прижившихся регенерантов осины, шт. | Приживаемость, % |
| Диплоидные | 368 | 110 | 30 |
| Триплоидные | 359 | 233 | 65 |
Установлено, что триплоидные осины характеризовались повышенной адаптационной способностью (65%) по сравнению с диплоидными формами (30%). Вместе с тем, триплоидные формы имели высоту побега в 2 раза больше, чем диплоидные формы.
Полученные результаты свидетельствуют о существовании генотипической зависимости и способностью растений к адаптации к условиям in vivo.
Адаптированные растения, полученные при весеннем сроке пересадки и достигшие высоты 25-30 см, были перенесены на лесокультурную площадь, а мелкие саженцы оставались в теплице на доращивание. Все высаженные саженцы осины прижились. Проведенная инвентаризация маточной плантации в конце сентября показала, что прирост саженцев в высоту в открытом грунте для триплоидных и диплоидных форм осины составил 25,8 и 15,2 см соответственно (табл. 12).
Таблица 12 - Биометрические показатели саженцев осины
| Регенеранты | Высота саженцев, см | Диаметр у шейки корня, мм | Прирост в высоту, см |
| Диплоидные, F 2 | 27,6 ± 0,3 | 1,5 ±0,6 | 15,2 ±0,5 |
| Триплоидные, F 3 | 45,2 ± 0,5 | 1,2 ±0,4 | 25,8 ±0,7 |
Таким образом, метод in vitro позволяет успешно получать большое количество посадочного материала высокопродуктивной осины, устойчивой к сердцевинной гнили. Наиболее перспективным в условиях Республики Татарстан оказался клон №35 триплоидной осины. Для налаживания технологии выращивания в производственных масштабах в Республике Татарстан необходимо организовать производственную лабораторию по выращиванию посадочного материала здоровой осины методом in vitro.