Влияние природных и синтетических полимеров на биохимические свойства липаз из различных источников 03. 00. 04-биохимия

Вид материала

Автореферат

Содержание Научный руководитель Байматов Валерий Нурмухаметович Общая характеристика работы Научная новизна работы. Теоретическая и практическая значимость. Основные положения, выносимые на защиту Апробация работы. Личный вклад автора. Структура и объем работы. Экспериментальная часть 1. Влияние белкового окружения на активность липаз из различных источников Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens 2. Влияние полиэлектролитного окружения на активность липаз из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucor javanicus Mucor javanicus Mucor javanicus 3. Регуляция активности липаз путем направленного изменения условий среды Mucor javanicus Mucor javanicus 4. Изучение динамического поверхностного натяжения систем липазы из поджелудочной железы свиньи с природными и синтетическими по ... Полное содержание

Подобный материал:

• Программы и задания фен по специальности «Химия» 3-й курс, VI семестр, 194.94kb.
• Получение топлив из угля, 241.18kb.
• Задачи изучения дисциплины, 18.45kb.
• Влияние цитратов металлов на биохимические показатели тканей и органов цыплят-бройлеров, 485.86kb.
• Тема №2: цена и структура капитала, 80.55kb.
• Спецкурс «Физикохимия полимеров структурно-механические свойства полимеров» Цели, 22.61kb.
• Список научных и учебно-методических работ Баронина Геннадия Сергеевича, 490.65kb.
• Лекция Влияние различных факторов на пластичность металла. Влияние омд на структуру, 126.99kb.
• Влияние природы наполнителя и механической активации на свойства композитов на основе, 282.48kb.
• Влияние размеров белковых макромолекул на избирательность их сорбции катионитами различных, 307.15kb.

На правах рукописи


Тульская Екатерина Валерьевна


ВЛИЯНИЕ ПРИРОДНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМЕРОВ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛИПАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ


03.00.04-биохимия


Автореферат


диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук


Москва - 2008

Работа выполнена на кафедре органической и биологической химии
в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»


Научный руководитель:


доктор биологических наук,

доктор химических наук,

профессор Зайцев Сергей Юрьевич


Официальные оппоненты:


доктор ветеринарных наук,

профессор Байматов Валерий Нурмухаметович


доктор биологических наук Букова Наталья Константиновна


Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская

государственная академия ветеринарной медицины»


Защита состоится «____» __________ 2009 г. в ___ час.

на заседании диссертационного совета Д 220.042.04 в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23.

Тел.: (495)377-93-83


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»


Автореферат разослан «___» _________2008


Ученый секретарь

диссертационного совета Фомина В.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследования биокаталитических систем на основе липаз являются важными и актуальными как по фундаментальной, так и по прикладной направленности. Липазы – это сериновые гидролазы, катализирующие ряд ключевых биохимических реакций: гидролиз, этерификация, трансэтерификация, алкоголиз, ацидолиз [Афонский С.И., 1966; Брокерхоф Х., 1976; Малахов А.Г., 1982; Зайцев С.Ю., 2005 и другие]. Липазы применяются в пищевой, фармакологической, агрохимической и кожевенной промышленности, в производстве моющих средств, поверхностно и оптически активных соединений, вкусовых и ароматических компонентов, для аналитических целей в медицине. Свойство энантиоселективности липаз широко применяется в органическом синтезе биологически активных веществ и их синтетических аналогов, таких как простагландины, алкалоиды, терпеноиды, антибиотики, производные нуклеозидов и т.п.

Однако, дальнейшее применение липаз в промышленности сдерживается сложностями в создании оптимальной реакционной системы, высокой ценой ферментов, загрязненностью большинства ферментных препаратов, низкой термостабильностью, невысокими скоростями реакций и т.д. Решения большинства вышеперечисленных проблем лежат на пути использования иммобилизованных ферментов. Иммобилизация липаз способствует отделению фермента от продуктов реакции, позволяет экономить фермент, увеличивает термостабильность и активность липаз. В настоящее время накоплен обширный материал по иммобилизации липаз из различных источников методами адсорбции, ковалентного связывания, включения в полимерные гели и т.д. [Мосбах К., 1976; Березин И.В. и др., 1987; Кабанов В.А. и др., 1987; Вудворд Дж., 1988; Варфаломеев С.С. и др., 1999; Штильман М.И., 2006 и другие]. Однако, систематизированных данных о влиянии полимеров на коллоидно-химические и каталитические свойства липаз из различных источников до начала наших работ в литературе было недостаточно. При исследовании новых биоматериалов и методов иммобилизации важно проводить фундаментальную работу по изучению физико-химических свойств иммобилизованных липаз.

Цель работы – изучение ферментативной активности и динамического поверхностного натяжения систем липаз из различных источников с природными и синтетическими полимерами.

Исходя из этой цели, были поставлены задачи:

1. Изучить влияние природного полимера – бычьего сывороточного альбумина на активность липаз из различных источников.
   
2. Изучить влияние синтетических разнозаряженных полиэлектролитов - полистиролсульфоната натрия и полидиаллилдиметиламмоний хлорида на активность липаз из различных источников.
   
3. Изучить сочетанное влияние температуры и полимерного окружения на активность липаз из различных источников.
   
4. Провести сравнительное исследование параметров динамического поверхностного натяжения панкреатической липазы в системах с синтетическими и природными полимерами.
   
5. Предложить эффективный способ регуляции ферментативной активности липаз из различных источников и модели супрамолекулярных наноразмерных систем на основе липаз и полиэлектролитов.
   

Научная новизна работы. Предложены модели супрамолекулярных наноразмерных систем на основе липаз и полиэлектролитов. Выявлены молекулярные механизмы и впервые изучено влияние температуры на активность липаз из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucor javanicus в системах с синтетическими полиэлектролитами: полистиролсульфонатом натрия и полидиаллилдиметиламмоний хлоридом. Впервые исследовано динамическое поверхностное натяжение систем липазы из поджелудочной железы свиньи с бычьим сывороточным альбумином, поли-L-глутаминовой кислотой, поли-L-лизином, полистиролсульфонатом натрия и полидиаллилдиметиламмоний хлоридом при различных молярных соотношениях липаза : полимер. Научная новизна работы подтверждена 3 патентами РФ № 2301830, № 2301831, № 2308486 (Зайцев С.Ю., Каштиго Т.В., Тульская Е.В., Царькова М.С., Коршикова А.В.).

Теоретическая и практическая значимость. Разработан эффективный способ направленной регуляции активности липаз в супрамолекулярных наноразмерных системах с разнозаряженными полиэлектролитами. Установлено значительное увеличение ферментативной активности и стабильности липаз в полимерных системах при возрастании температуры, что имеет большую практическую ценность для новых биотехнологических и биохимических методов. Полученные параметры динамического поверхностного натяжения систем липазы с природными и синтетическими полимерами важны как для понимания механизмов основных биохимических процессов в организме животных, так и для применения в биомедицинской диагностике. Результаты диссертационной работы используются для обучения студентов 3, 4 и 5 курсов ветеринарно-биологического факультета ФГОУ ВПО МГАВМиБ по специальности «Биохимия». Основные положения практической значимости работы отражены в 3 патентах РФ № 2301830, № 2301831, № 2308486 (Зайцев С.Ю., Каштиго Т.В., Тульская Е.В., Царькова М.С., Коршикова А.В.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Данные по влиянию природного полимера – бычьего сывороточного альбумина - на активность липаз из различных источников.
   
2. Данные по влиянию синтетических полиэлектролитов - полистиролсульфоната натрия и полидиаллилдиметиламмоний хлорида - на активность липаз из различных источников.
   
3. Данные по влиянию температуры на активность липаз из различных источников в системах с указанными синтетическими полиэлектролитами.
   
4. Параметры динамического поверхностного натяжения систем панкреатической липазы с синтетическими и природными полимерами.
   
5. Включение липазы в системы с полиэлектролитами в определенных соотношениях как эффективный способ регулирования каталитической активности липаз из различных источников. Модели супрамолекулярных наноразмерных систем, представляющих собой различные типы комплексов липазы, поликатиона, полианиона и эмульгированного триацилглицерола.
   

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи, ВВЦ, Москва, 2005 г.; на Четвертой Всероссийской Каргинской конференции «Наука о полимерах 21-му веку», МГУ, Москва, 2007 г.; на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, РАН, Москва, 2007 г.; на III международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике, МГУ, Москва, 2008; на международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии», ФГОУ ВПО МГАВМиБ, Москва, 2008 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 6 статей (в т.ч. 1 – в журнале «Доклады РАСХН», 1 – в журнале «Ветеринарная медицина»), 5 тезисов докладов на российских и международных конференциях, а также получено 3 патента РФ.

Личный вклад автора. Все экспериментальные исследования были проведены лично автором. В обработке данных участвовал ряд сотрудников кафедры органической и биологической химии под руководством заведующего кафедрой проф. С.Ю. Зайцева (научный руководитель данной диссертационной работы).

Структура и объем работы. Материалы диссертационной работы изложены на 131 странице. В работе приведено 79 рисунков и 14 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает 161 источник (из них 33 отечественных и 128 зарубежных).

Экспериментальная часть

Материалы и методы

Исследования проведены в 2005-2008 гг. на кафедре органической и биологической химии в ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина

В работе использовали следующие реактивы: липаза из поджелудочной железы свиньи (Л-1), M_w = 50 000 г/моль, активность фермента 15-35 МЕ/мг; липаза из гриба Mucor javanicus (Л-2), M_w = 40 000 г/моль, активность фермента 696 МЕ/мг; липаза из бактерии Pseudomonas fluorescence (Л-3), M_w = 33 000 г/моль, активность фермента 36 МЕ/мг; триацилглицерол (фирменное название – триацетин), M_w = 218,21 г/моль, чистота не менее 99 %; полистиролсульфонат натрия (ПСС), M_w = 70 000 г/моль; полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПAMA), M_w = 450 000 г/моль; поли-L-лизин гидробромид (ПЛ), M_w = 30 000-70 000 г/моль; поли-L-глутаминовая кислота натриевая соль (ПГ), M_w = 15 000-50 000 г/моль; бычий сывороточный альбумин (БСА), M_w = 66 000 г/моль; раствор NaOH (0,01М) использовали в качестве титранта; растворы NaCl (0,05М) и CaCl₂ (0,05М) использовали для приготовления рабочего раствора субстрата. Активность липазы была измерена с помощью метода потенциометрического титрования на автоматическом титраторе “Radiometer” (Копенгаген) по скорости гидролиза субстрата триацетина. Одна единица активности липазы соответствует 1 мкмолю уксусной кислоты, выделяющейся при ферментативном гидролизе субстрата (триацетина) в одну минуту. Каждая проба была измерена по 3-5 раз и рассчитано среднее значение абсолютной активности липазы. Относительная активность (в %) рассчитывалась как отношение активности опытной пробы к активности контрольной пробы. Измерение параметров динамического поверхностного натяжения (ДПН) липазы в комплексах с полимерами проводили на приборах ВРА-1P и PAT-2P “Sinterface” (Германия). Прибор BPA-1P основан на методе максимального давления в пузырьке и измеряет ДПН при коротких и средних временах существования поверхности (от 0,001 до 100 с). Прибор PAT-2P измеряет ДПН при средних и длинных временах (от 10 до 10000 с) с помощью метода висящей капли.

Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ "Статистика". Определены значения критерия достоверности на основе распределения Стьюдента с учётом принятого для научных экспериментов уровня значимости 0,05*, 0,01**, 0,001***.

Результаты и их обсуждение

1. Влияние белкового окружения на активность липаз из различных источников

Бычий сывороточный альбумин (БСА) является одним из наиболее простых и доступных белков для изучения влияния биополимерного окружения на активность липаз из различных источников. Активность липазы из поджелудочной железы свиньи (Л-1), измеренная при соотношениях фермент : БСА от 10:1 до 1:100, не показала достоверных отклонений от активности липазы без БСА, принятой за 100 %. В случае липазы из гриба Mucor javanicus (Л-2) наблюдается снижение активности фермента в присутствии БСА на 4-16 % при избытке липазы относительно БСА, и снижение активности на 27-28 % при избытке БСА относительно фермента (табл.1).

Таблица 1. Относительная активность (А) липазы из Mucor javanicus (Л-2) и Pseudomonas fluorescens (Л-3) в присутствии бычьего сывороточного альбумина при разных соотношениях фермент : БСА.

Параметры	А при 10:1, %	А при 1:1, %	А при 1:10, %	А при 1:100, %
Л-2	84±8*	96±7	72±8*	73±8*
Л-3	147±6*	114±11*	128±7*	126±9*

Активность липазы из Pseudomonas fluorescens (Л-3) в присутствии БСА всегда была выше контроля (за контроль была принята активность липазы без БСА) и максимальна при соотношении липаза : БСА, равном 10:1 (выше контроля в 1,5 раза).

Таким образом, указанные липазы по-разному взаимодействуют с БСА, который является оптимальным «активатором» только для липазы из Pseudomonas fluorescens. В случае липаз из поджелудочной железы свиньи и Mucor javanicus требовались другие полимеры, которые были выбраны из имеющихся синтетических полиэлектролитов.

2. Влияние полиэлектролитного окружения на активность липаз из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucor javanicus

Активность липазы из поджелудочной железы свиньи (Л-1) и липазы из гриба Mucor javanicus (Л-2) была измерена в присутствии полидиаллилдиметиламмоний хлорида (ПАМА) и полистиролсульфоната натрия (ПСС) в соотношениях липаза : полиэлектролит 1:1, 1:10, 1:100 при рН 7,0 и 25 ºС (табл. 2, 3). Активность липаз без полиэлектролитов была принята за 100 %.

Таблица 2. Относительная активность (А) липазы из поджелудочной железы свиньи (Л-1) в присутствии ПАМА и ПСС при разных соотношениях липаза : полиэлектролит.

Параметры	А при 1:1, %	А при 1:10, %	А при 1:100, %
Л-1 : ПАМА	73±6*	94±5	44±6**
Л-1 : ПСС	23±5**	117±4*	115±8*

Активность липазы из поджелудочной железы свиньи в присутствии ПСС при соотношениях 1:10 и 1:100 была выше контроля на 17 и 15 % (табл. 2), что может быть связано с увеличением микрогетерогенности системы в результате взаимодействия липазы с полиэлектролитом. Использование смеси липаза : ПСС 1:1 приводит к значительной инактивации липазы (до 23%), поскольку недостаточно ПСС для образования микрогетерогенности системы. В присутствии ПАМА даже «наивысшая» активность панкреатической липазы при соотношении липаза : полиэлектролит равном 1:10 оказалась ниже контроля на 6 % (табл. 2). По-видимому, отрицательно заряженная при нейтральных значениях рН липаза в процессе комплексообразования оказывается расположенной внутри глобулы положительно заряженного полимера и становится менее доступной для субстрата. Это подтверждается тем, что при увеличении содержания ПАМА в смеси до 1:100 происходит значительное уменьшение активности липазы на 56 %.

Таблица 3. Относительная активность (А) липазы из Mucor javanicus (Л-2) в присутствии ПАМА и ПСС при разных соотношениях липаза : полиэлектролит.

Параметры	А при 1:1, %	А при 1:10, %	А при 1:100, %
Л-2 : ПАМА	96±4	108±5	116±3*
Л-2 : ПСС	152±3**	63±6*	108±5

Максимальная активность липазы из гриба Mucor javanicus наблюдалась в присутствии ПАМА при соотношении 1:100 (116%), а в присутствии ПСС при соотношении 1:1 (152%). Увеличение активности липазы из Mucor javanicus с увеличением концентрации положительно заряженного ПАМА относительно фермента (от 96 % при соотношении 1:1 до 116 % при соотношении 1:100) связано прежде всего с удалением отрицательно заряженных жирных кислот из реакционной смеси путем электростатического взаимодействия с полиэлектролитом и сдвигом равновесия в сторону образования продуктов реакции. Увеличение активности липазы на 52 % в случае эквимолярного соотношения фермента с ПСС (табл. 3) можно объяснить закреплением каталитически выгодной конформации фермента в комплексе с ПСС.

Таким образом, активность липазы существенно зависит от заряда полиэлектролита и от концентрации его относительно фермента. Наилучшими для Л-1 являются системы с ПСС 1:10 и 1:100, для Л-2 – системы с ПАМА 1:100 или ПСС 1:1.

3. Регуляция активности липаз путем направленного
изменения условий среды

Резкое повышение температуры является одним из важнейших факторов, который с одной стороны увеличивает скорость реакции, а с другой - вызывает инактивацию любых ферментов, в том числе липаз. Учитывая перспективы практического использования, были исследованы температурные зависимости активности липаз из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucor javanicus в комплексах с полиэлектролитами.

Активность липазы из поджелудочной железы свиньи в присутствии ПАМА в соотношении 1:10 (рис. 1) значительно выше активности чистой липазы с максимумом при 60 ºС (выше в 2,3 раза), и наблюдается сдвиг температурного оптимума в сторону более высоких температур по сравнению с исходным ферментом. При соотношении липаза : ПАМА = 1:1 (рис. 1) активность панкреатичкской липазы оказалась как выше, так и ниже, чем в отсутствие полимера, хотя наиболее близкие значения отмечены при температуре 60 ºС (ниже в 1,2 раза). Все данные свидетельствуют о взаимодействиях в системе липаза : полиэлектролит, которые делают фермент более устойчивым к температурным воздействиям.

Рис. 1. Зависимость относительной активности липазы из поджелудочной железы свиньи (Л-1) в комплексе с ПАМА от температуры.

Показано, что в присутствии ПСС липаза из поджелудочной железы свиньи при 20 ºС имеет активность около 100% по отношению к контролю при 25 ºС при всех изученных концентрациях полиэлектролита. При повышении температуры до 60 ºС активность панкреатической липазы во всех случаях была выше активности липазы без полиэлектролита при той же температуре: при соотношениях 1:1 и 1:10 активность увеличилась в 2,0 и 2,8 раз, соответственно.

Активность липазы из гриба Mucor javanicus в присутствии ПАМА в соотношении 1:1 (рис. 2) возросла в 2,7 раз при 60 ºС относительно активности этой липазы без ПАМА. При соотношении липаза : ПАМА 1:10 (рис. 2) активность фермента возрастает при повышении температуры до 60 ºС в 3,9 раз.

Рис. 2. Зависимость относительной активности липазы из Mucor javanicus (Л-2) в комплексе с ПАМА от температуры.

Активность липазы из Mucor javanicus в присутствии ПСС с увеличением температуры до 60 °С уменьшается в 2,3 раза (при соотношении 1:1), и увеличивается в 2,8 раз (при соотношении 1:10).

Таким образом, установлено качественное и количественное изменение зависимости относительной активности фермента от температуры для систем липазы с разнозаряженными полиэлектролитами.

4. Изучение динамического поверхностного натяжения систем липазы из поджелудочной железы свиньи с природными и синтетическими полиэлектролитами

Впервые исследовано ДПН систем липазы с природным полимером – бычьим сывороточным альбумином (табл. 4), с модельными полипептидами - поли-L-лизином и поли-L-глутаминовой кислотой, и с синтетическими полиэлектролитами полидиаллилдиметиламмоний хлоридом и полистиролсульфонатом натрия. С помощью двух взаимодополняющих методов были получены тензиограммы при коротких (от 0,01 до 100 с) и длинных (до 3500 с) временах существования поверхности. По данным тензиограмм в программе Reading ADSA были рассчитаны параметры ДПН: ₂ (мН/м) - значения ДПН при 1 с, рассчитывали в координатах  - lg T; ₃ и ₄ (мН/м) - значения ДПН при 100 и 3500 с, определяли в координатах  - T^1/2; λ₀ и λ₁ (мН/м¹с^1/2) - углы наклона начального и конечного участка тензиограммы.

Таблица 4. Изменение параметров ДПН систем липаза : БСА при различных соотношениях компонентов.

Соотношение липаза:БСА	σ2, мН/м	λ0, мН/м-1 с1/2	σ3, мН/м	λ1, мН/м-1 с1/2	σ4, мН/м
1:0	71,7 ±0,1*	5,3 ±0,5*	70,6 ±0,3*	1,2 ±0,6*	42,9 ±1,2*
100:1	72,0 ±0,4*	4,9 ±0,3*	70,8 ±0,6*	2,1 ±0,2*	47,8 ±2,9*
10:1	72,1 ±0,1*	4,8 ±0,4*	71,1 ±0,1*	1,3 ±0,3*	45,4 ±1,8*
1:1	71,8 ±0,1*	5,4 ±0,1*	67,7 ±0,2*	7,4 ±0,9*	49,8 ±0,7*
1:10	69,9 ±0,2*	5,6 ±0,2*	61,9 ±0,2*	13,2 ±0,3*	52,0 ±0,1*
1:100	69,6 ±0,3*	5,9 ±0,2*	61,9 ±0,4*	12,5 ±0,5*	51,7 ±0,4*
0:1	69,4 ±0,1*	5,8 ±0,5*	62,0 ±0,3*	11,4 ±0,8*	51,7 ±0,1*

Параметры ДПН σ₂, σ₃, λ₀ изменяются достоверно, но не значительно. Наибольшие отличия в ДПН для всех изученных смесей (табл. 4) наблюдались при длинных временах существования поверхности (параметры λ₁ и σ₄), однако наиболее характеристичным и надежным является параметр σ₄, который и будет далее обсуждаться (табл. 5).

ДПН растворов ПГ, ПЛ, ПАМА и ПСС постоянно во всем временном диапазоне (табл. 5). Белки понижают ДПН: σ₄ для раствора липазы было равно 42,9±1,2 мН/м, а σ₄ для раствора БСА - 51,7±0,1 мН/м (при концентрации 10^-5 М). Параметр ДПН σ₄ для системы липаза : БСА практически не зависит от их соотношения и лишь незначительно снижается (на 3,9 мН/м) при увеличении концентрации липазы относительно БСА от 1:100 до 100:1 (табл. 5).

Таблица 5. Показатель ДПН σ₄ (мН/м) липазы в присутствии различных природных и синтетических полиэлектролитов.

Липаза:ПЭ	Л:БСА	Л:ПГ	Л:ПЛ	Л:ПСС	Л:ПАМА
100:1	47,8 ±2,9*	55,8 ±0,9*	46,1 ±1,1*	55,0 ±3,2*	46,1 ±3,7*
10:1	45,4 ±1,8*	53,6 ±1,4*	47,1 ±3,5*	67,3 ±1,6*	39,7 ±3,4*
1:1	49,8 ±0,7*	55,9 ±3,1*	50,5 ±2,9*	66,6 ±0,7*	50,3 ±3,1*
1:10	52,0 ±0,1*	69,0 ±0,1*	66,5 ±2,4*	68,7 ±0,1*	64,3 ±0,8*
1:100	51,7 ±0,4*	69,2 ±0,1*	68,6 ±0,1*	68,8 ±0,7*	69,1 ±0,2*
0:1	51,7 ±0,1*	69,5 ±0,2*	68,9 ±0,1*	69,2 ±0,1*	70,0 ±0,2*

В случае систем липазы с пептидными полиэлектролитами ПЛ и ПГ параметр σ₄ снижается на 22,5 и 13,4 мН/м при увеличении содержания липазы в системах от 1:100 до 100:1, что объясняется образованием гидрофобных комплексов липазы и полиэлектролитов, адсорбирующихся на поверхности раздела фаз и снижающих ДПН (табл. 5). Параметр σ₄ систем липазы с синтетическими полиэлектролитами ПСС и ПАМА снижается на 13,8 и 23,0 мН/м. Таким образом, величина изменения динамического поверхностного натяжения σ₄ для систем панкреатической липазы с полимерами с увеличением относительного содержания фермента от 1:100 до 100:1 уменьшается в ряду ПАМА ≥ ПЛ > ПСС ≥ ПГ > БСА.

5. Модели ферментативных супрамолекулярных наноразмерных систем

При изучении каталитических свойств липаз из различных источников в супрамолекулярных наноразмерных системах, представляющих собой комплексы липазы, поликатиона, полианиона, эмульгированного триацилглицерола и солей (NaCl, CaCl₂), сложно предсказать количественно изменение активности фермента в зависимости от типа полиэлектролита и его концентрации относительно фермента. Поэтому далее обсуждаются качественные характеристики взаимодействия компонентов ферментативной супрамолекулярной системы, которые определяют изменения в каталитической активности липазы и позволяют построить ряд обобщенных моделей таких систем (рис. 3 и 4). Среди многих типов взаимодействий, возникающих между ферментом и полиэлектролитом, могут преобладать взаимодействия электростатической природы (как в случае отрицательно заряженной панкреатической липазы и поликатиона ПАМА) или гидрофобной природы (как в случае комплекса липазы с полианионом ПСС).

Одним из факторов способствующих активации липазы на границе раздела фаз является увеличение микрогетерогенности системы в результате взаимодействия липазы с полиэлектролитами с образованием супрамолекулярных наноразмерных систем радиусом 54-94 нм [Зайцев и др., 2003]. Однако при большом избытке полимера относительно фермента в результате взаимодействия липазы и полиэлектролита может наблюдаться снижение активности фермента вследствие уменьшения доступности субстрата из-за блокировки активного центра фермента и перехода липазы в закрытую конформацию. Уменьшение доступности субстрата и как следствие снижение активности фермента можно объяснить взаимодействием отрицательно заряженного субстрата с положительно заряженным полиэлектролитом. Напротив, электростатическое связывание полиэлектролитом (или БСА) образующихся карбоновых кислот и удаление их из реакционной среды способствует сдвигу равновесия реакции в сторону образования продуктов реакции и увеличению общей каталитической активности.

а	б
Рис. 3. Модели систем липаза : ПСС, равных (а) 1:1 - «низкая активность» и (б) 1:10 - «высокая активность»
а		б
Рис. 4. Модели систем липаза : ПАМА, равных (а) 1:1 - «низкая активность» и (б) 1:10 - «высокая активность»

Таким образом, только одновременным действием описанных эффектов можно объяснить изменения ферментативной активности липазы в супрамолекулярных наноразмерных системах с полиэлектролитами.

Выводы

1. Показано, что природный полимер - бычий сывороточный альбумин может как увеличивать (в случае липазы из Pseudomonas fluorescens на 14-47 %), так и уменьшать (в случае липазы из Mucor javanicus на 4-28 %) относительную активность фермента в зависимости от типа липаз.

2. Обнаружено, что активность липаз из различных источников зависит от природы синтетического полимера (полидиаллилдиметиламмоний хлорида или полистиролсульфоната натрия) и его содержания в смеси с ферментом при стандартных условиях. Относительная активность липазы из поджелудочной железы свиньи увеличивается на 17 и 15 % в присутствии полистиролсульфоната натрия в соотношении 1:10 и 1:100, соответственно.

3. Установлено, что наибольшее увеличение активности липаз в присутствии полиэлектролитов при 60 °С наблюдается для системы липазы из поджелудочной железы свиньи с полистиролсульфонатом натрия (в 2,8 раза) и для системы липазы из Mucor javanicus с полидиаллилдиметиламмоний хлоридом (в 3,9 раза) относительно активности этих липаз без полиэлектролитов при той же температуре.

4. Впервые показано влияние природы полимера при его взаимодействии с липазой на параметры динамической тензиометрии, характеризующие скорость адсорбции данных комплексов на поверхность раздела фаз. Величина изменения динамического поверхностного натяжения σ₄ для систем панкреатической липазы с полимерами с увеличением относительного содержания фермента от 1:100 до 100:1 уменьшается в ряду: полидиаллилдиметиламмоний хлорид ≥ поли-L-лизин > полистиролсульфонат натрия ≥ поли-L-глутаминовая кислота > бычий сывороточный альбумин.

5. Предложен эффективный способ регулирования каталитической активности липаз из различных источников (из поджелудочной железы свиньи, гриба Mucor javanicus и бактерии Pseudomonas fluorescens) при включении липазы в системы с разнозаряженными полимерами. Предложены модели супрамолекулярных наноразмерных систем, представляющих собой различные типы комплексов липазы, поликатиона, полианиона и эмульгированного триглицерида.

Сведения о практическом использовании и рекомендации
по использованию результатов исследования

Предложен способ включения липаз из различных источников (из поджелудочной железы свиньи, гриба Mucor javanicus и бактерии Pseudomonas fluorescens) в системы с разнозаряженными полиэлектролитами, который позволяет получать ферментные препараты, стабильные в широком температурном интервале, что представлено в патентах автора и др. № 2301830, № 2301831, № 2308486. Основные результаты диссертации используются для обучения студентов 3, 4 и 5 курсов ветеринарно-биологического факультета ФГОУ ВПО МГАВМиБ по специальности «Биохимия».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1.* Тульская, Е.В. Влияние параметров среды на активность липазы из поджелудочной железы свиньи, иммобилизованной в полиэлектролитные комплексы / Тульская Е.В., Зайцев С.Ю., Каштиго Т.В. // Ветеринарная медицина. – 2006. - №2-3. - С. 59-60.

2. Тульская, Е.В. Изучение влияния полиэлектролитов и параметров среды на активность липазы из поджелудочной железы свиньи / Тульская Е.В., Зайцев С.Ю., Каштиго Т.В., Фролова Л.А. // Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии: Сб.науч.тр. / Моск. гос. акад. вет. мед. и биотехн. им. К.И. Скрябина.- Москва, 2006.- С. 20-24.

3. Зайцев, С.Ю. Влияние температуры на активность комплексов липазы из гриба Mucor javanicus с полиэлектролитами / Зайцев С.Ю., Шароменко О.С., Тульская Е.В., Каштиго Т.В., Миллер Р. , Л.А. Фролова // Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии: Сб.науч.тр. / Моск. гос. акад. вет. мед. и биотехн. им. К.И. Скрябина.- Москва, 2006.- С. 16-19.

4. Тульская, Е.В. Изучение влияния полиэлектролитов на активность липазы из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucor javanicus / Тульская Е.В., Каштиго Т.В., Шароменко О.В., Милаёва И.В. // Сб. науч. трудов молодых ученых «Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии». – 2006. - С. 14-18.

5.* Зайцев, С.Ю. Зависимость активности панкреатической липазы свиньи в комплексе с полимерами от условий среды / Зайцев С.Ю., Тульская Е.В., Каштиго Т.В. // Доклады РАСХН. – 2007. - №3. - С. 72-73.

6. Тульская, Е.В. Динамическое поверхностное натяжение комплексов липазы с альбумином и полипептидами / Тульская Е.В., Зайцев С.Ю., Миллер Р. // Сборник статей Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии», Москва. – 2008. - Вып. 1. - С. 116-121.

Тезисы докладов:

7. Тульская, Е.В. Полимер-ферментные комплексы как функциональные нанобиоматериалы / Тульская Е.В., Шароменко О.В., Гуревич И.В. // Сборник материалов ко Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи, Москва. – 2005. - С. 107-108.

8. Тульская, Е.В. Изменение активности липазы в присутствии полиэлектролитов/ Тульская Е.В., Зайцев С.Ю. //Четвертая Всероссийская Каргинская конференция «Наука о полимерах 21-му веку», Москва. – 2007. - С. 435.

9. Tulskaya E.V. Comparative study of the lipase activity in supramolecular polymer complexes / Tulskaya E.V., Zaitsev S.Yu. // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Москва. - 2007. - Т.6. - С. 125.

10. Тульская, Е.В. Изучение активности липазы в присутствии синтетических и природных полиэлектролитов/ Тульская Е.В., Зайцев С.Ю. // III международная конференция по коллоидной химии и физико-химической механике, Москва. - 2008. - С. 63.

11. Тульская, Е.В. Динамическое поверхностное натяжение комплексов липазы с альбумином и полипептидами / Тульская Е.В., Зайцев С.Ю., Миллер Р. // Сборник тезисов Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии», Москва. – 2008. - С. 17.

Патенты:

12.* Патент РФ № 2301830 «Способ получения иммобилизованной липазы» Зайцев С.Ю., Тульская Е.В., Каштиго Т.В., Царькова М.С., Коршикова А.В., опубликовано 27.06.2007 Бюл. № 18.

13.* Патент РФ № 2301831 «Способ получения иммобилизованной липазы» Зайцев С.Ю., Тульская Е.В., Каштиго Т.В., Царькова М.С., Коршикова А.В., опубликовано 27.06.2007 Бюл. № 18.

14.* Патент РФ № 2308486 «Способ получения иммобилизованной липазы» Зайцев С.Ю., Тульская Е.В., Каштиго Т.В., Царькова М.С., Коршикова А.В., опубликовано 20.10.2007 Бюл. № 29.